Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit Rhipicephalus microplus Epitheliale darmcellen

Samenvatting

Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.

Samenvatting

Rhipicephalus microplus - de veestok - is de belangrijkste ectoparasiet in termen van economische impact op vee als vector van verschillende pathogenen. Er is gewerkt aan de veestokcontrole om de schadelijke effecten ervan te verminderen, met de nadruk op de ontdekking van vaccinekandidaten, zoals BM86, gelegen op het oppervlak van de epitheelcellen. Huidig ​​onderzoek richt zich op het gebruik van cDNA en genomische bibliotheken, om te screenen voor andere vaccin kandidaten. De isolatie van tikgutcellen vormt een belangrijk voordeel bij het onderzoeken van de samenstelling van oppervlakte-eiwitten op het membraan van de tikkeldarmcellen. Dit papier vormt een nieuwe en haalbare methode voor het isoleren van epitheliale cellen, uit de tikgutinhoud van halfgegraveerde R. microplus. Dit protocol maakt gebruik van TCEP en EDTA om de epitheelcellen uit de subepitheliale ondersteunende weefsels te ontlasten en een discontinuous density centrifugatiegradieNt om epitheelcellen van andere celsoorten te scheiden. Cel-oppervlakte-eiwitten werden biotinyleerd en geïsoleerd uit de epitheelcellen van de tikgut, met behulp van streptavidine-gekoppelde magnetische kralen, die toestaan ​​voor downstream toepassingen in FACS of LC-MS / MS-analyse.

Inleiding

Rhipicephalus microplus , de veestok, is de meest significante ectoparasiet in termen van economische impact op de veeindustrie van tropische en subtropische regio's, aangezien het vectoren boviene tik koorts (babesiosis), anaplasmose en paardenpiroplasmosis ^{1 , 2 , 3 , 4 is} . Er zijn inspanningen gedaan voor veestokcontrole om het schadelijke effect te verminderen, maar conventionele methoden zoals het gebruik van chemische acariciden hebben impliciete nadelen, zoals de aanwezigheid van chemische residuen in melk en vlees, en de toename van de prevalentie van chemisch resistente tegels ^{5 , 6 , 7} . Bijgevolg is de ontwikkeling van alternatieve methoden voor tikbesturing onderzocht, zoals het gebruik van natuurlijk resistentiebeest, biologische bestrijding (biopesticiden) en vaccinInen ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

In het nastreven van eiwitten die kunnen worden gebruikt als vaccin kandidaten, is het huidige onderzoek gericht op de tikgut. De midgutmuur is gebouwd uit een enkele laag epitheliale cellen die op een dunne basale lamina rusten, waarbij de buitenkant van de basale lamina een netwerk van spieren vormt. Licht- en elektronmicroscoopwaarnemingen wijzen erop dat de midgut bestaat uit drie typen cellen: reserve (ongedifferentieerd), secretie en spijsvertering. Het aantal celtypes varieert aanzienlijk afhankelijk van de fysiologische fase. Secretory en spijsverteringscellen zijn afkomstig van reservecellen ^{18 , 19 , 20} .

De constructie van cDNA bibliothekenOm de samenstelling van de tikgoot te onderzoeken heeft geleid tot de identificatie van antigeen eiwitten, zoals Bm86, als potentiële vaccin kandidaten ^{2 , 3 , 4} . Het glycoproteïne Bm86 is gelokaliseerd op het oppervlak van bosluiscellen en veroorzaakt een beschermende immuunrespons tegen de veekenteken ( R. microplus ) bij gevaccineerde vee. Anti-Bm86 IgG's die worden geproduceerd door de geïmmuniseerde gastheer worden ingehaald door de tik, herken dit antigeen op het oppervlak van tikgutcellen, en versteur vervolgens de tikweefselfunctie en integriteit. Vaccins op basis van Bm86 antigenen hebben effectieve controle van R. microplus en Rhipicephalus annulatus getoond , door het aantal, gewicht en voortplantingscapaciteit van ingewikkelde vrouwtjes te verminderen, wat resulteert in een verminderde larve-besmetting in daaropvolgende tikgeneraties ⁴ . Bm86-gebaseerde vaccins zijn echter niet effectief tegen alle tikstadia en hebbenHeeft onbevredigende effectiviteit aangetoond tegen sommige geografische stammen van R. microplus , waardoor de rundvlees- en zuivelindustrie deze vaccins ^{2 , 4} slecht heeft aangenomen.

Het vermogen om epitheelcellen uit de tikgut te isoleren is een belangrijke innovatie die de voortgang van het onderzoek mogelijk maakt om eiwitmembraansamenstelling te bepalen, waaronder morfologie en fysiologie onder verschillende omgevingsomstandigheden. De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van het chelaatmiddel ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) om het epithelium uit zijn subepitheelondersteunende weefsels ^{10 te} ontlasten. Het epithelium wordt hersteld na mechanische verstoring van de weefsels door schudden, gevolgd door discontinuous gradient centrifugatie in Percoll. Dit papier beschrijft een haalbare en nieuwe techniek voor het isoleren van tikgut epiTheliale cellen. Biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten, geïsoleerd uit het oppervlak van deze epitheliale cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in downstream toepassingen, zoals FACS en / of LC-MS / MS-analyse.

Protocol

1. Dissectie van de Gut Epithelium van R. microplus

1. Verzamel semi-engorged bosluizen van vee op de dag van het experiment. Dissect fluitjes binnen 24 uur na verwijdering van de gastheer.
2. Houd een strip tape vast aan de bodem van de 92 mm x 16 mm Petri-schotel. Voeg een druppel superlijm aan de band toe. Plaats de vinkje, de ventrale zijde van de superlijm, laat het gedurende 2 minuten drogen.
3. Giet 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de petrischaal, of tot de vinkje helemaal ondergedompeld is.
4. Gebruik een maat 11 scalpel, snijd van de bovenkant van de ogen naar de bodemfeestjes, aan weerszijden van de tik.
5. Verwijder met behulp van steriele tang de scutum en alloscutum volledig om de inwendige organen bloot te stellen.
6. Verwijder de fijne witte draadachtige organen (trachea) en andere membranen om vervuiling te voorkomen.
7. Verwijder de darm met behulp van pincet, door het bovenste gebied te knijpen en te trekken van dekarkas. Verwijder eventuele resterende darmweefsels, zodat er geen andere weefsels zijn gescheiden.
8. Bewaar de darm in ijskoude Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing (HBSS) zonder calciumchloride en magnesiumsulfaat met proteïne-inhibitorcocktail (PIC). Vries de darm in droogijs en houd deze bij -20 ° C op.
   Opmerking: Om te helpen bij de darmdissectie en de details van de inwendige organen, raadpleeg hoofdstuk 3.1 van D. Sonenshine, "Biology of Ticks" ¹⁹ .

2. Epitheliale celdissociatie

1. Giet de gedissende darm op een 70 μm celzeef in een 50 ml buis.
2. Spoel het darmweefsel met 50 ml ijskoude HBSS met PIC tot de oplossing helder loopt, en de darm neemt een witte / heldere uitstraling op.
3. Rein suspenderen in 30 ml ijskoude HBSS met PIC, meng zachtjes en centrifugeer bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten om de darm te pelletiseren. Verwijder de supernatant en herhaal het wasproces drie keer.
4. Om epitheliale darmcellen los te maken, zet de darm opnieuw op in 10 ml celkweekmedium Dulbecco's gemodificeerde arendmedium (DMEM), 2% foetaal kalfserum (FCS), 0,5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 1 mM Tris (2 -carboxyethyl) fosfine (TCEP), PIC en incuberen gedurende 60 minuten bij 37 ° C onder langzame rotatie onder gebruikmaking van een roller bij 6 rpm.
5. Filter de suspensie door een 250 μm celsilinder, vortex de doorstroming en filter door een 70 μm celsilinder die de resterende doorstroming verzamelt.
6. Centrifugeer de suspensie bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten om de enkele cellen te pelletiseren.

3. Isolatie van enkele epitheelcellen met behulp van een dichtheidscentrifugatiegradiënt

1. Bereid de dichtheidscentrifugatiegradiënt ( bijv . Percoll) door door een AP15 voorfilterpapier te filteren. Bereid 40% en 20% Percoll in MqH ₂ 0 (v / v) en afkoel 1 uur voor 4 uur bij 4 ° C voordat het gradiënt wordt gelegd.
2. Gebruik van een peristalticumPomp ingesteld op de laagste snelheid, laag 3 ml 40% dichtheidscentrifugatiegradiënt in een 16 ml ultracentrifugebuis, waardoor het gedurende 15 minuten op ijs kan liggen. Snelheid van de pomp moet leiden tot een <1 mL per min flow rate.
3. Gebruik de peristaltische pomp om de buis naar een hoek van 45 ° te kantelen om de 20% dichtheidscentrifugatiegradiënt op de 40% laag te laten lagen. Snelheid van de pomp moet leiden tot <1 mL per min flow rate. Laat de lagen gedurende 15 minuten op ijs zetten.
4. Gebruik de peristaltische pomp bij <1 ml per minuut stromingssnelheid naar laag 3 ml DMEM-medium dat tikgootcellen bevat over de 20-40% dichtheidscentrifugatiegradiënt.
5. Programmeer de centrifuge voor maximale versnelling en minimale vertraging. Centrifuge bij 600 xg gedurende 10 minuten. Verzamel tussenfasen tussen de DMEM: 20% dichtheidscentrifugatiegradiënt en de 20%: 40% dichtheidscentrifugatiegradiënten om epitheliale enkele cellen te isoleren. Bewaar verzamelde interfasen bij 4 ° C voor latere analyses.

4. Beoordeling van celisolatie

1. hemacytometer
   1. Maak de hemacytometer glijbaan schoon met alcohol.
   2. Schakel de cellen op door de cellen op en neer zachtjes te pipetteren. Pipette 100 μL van de cel suspensie en plaats in een 1,5 ml microcentrifuge buis.
   3. Voeg 400 μl 0,4% Trypan Blue toe. Meng het voorzichtig door de buis te flikkeren.
   4. Pipet 100 μL van de Trypan Blue-behandelde cel suspensie om beide kamers van de hemocytometer langzaam te vullen.
   5. Plaats de hemocytometer onder een lichtmicroscoop, met de nadruk op de roosterlijnen van de hemocytometer met een 10X-doelstelling.
   6. Met behulp van een handtekeningsteller tellen u de levende niet-gestippelde cellen in een set van 16 vierkanten. Tabel de blauwe dode cellen in hetzelfde vierkant. Ga door met tellen tot vier sets van 16 vierkanten worden geteld.
   7. Bereken de totale cellen per ml met behulp van de formule:
      47eq1.jpg "/>
   8. Bereken het percentage levensvatbaarheid van de cel door de formule te gebruiken:
      
2. Cellisolatie Visualisatie
   1. Verdun 1 μl van de geïsoleerde cellen in 9 μl HBSS in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Flip de microcentrifugebuis voorzichtig om te mengen.
   2. Pipetteer 5 μL geïsoleerde cellen in HBSS in het midden van een glazen glijbaan. Breng drie druppels monteringsmedium aan met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
   3. Incubeer de dia bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Plaats voorzichtig een deklaag over het preparaat, vermijd luchtbellen.
   4. Visualiseer cellen gemarkeerd met DAPI bij excitatie 360 ​​nm en emissie bij 460 nm onder een fluorescerende microscoop.

5. Biotinylatie van de celoppervlakteproteïne

1. Biotinylaat 100 μL epitheelcellen met een cel met behulp van Biotin (Type A) ConjugatieKit, bij een molverhouding van 1: 1 oppervlakte-eiwit om te conjugeren, volgens de instructies van de fabrikant
2. Voor cellysis, voeg 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 μM geoxideerde glutathion en PIC aan de biotinyleerde cellen toe. Incubeer op ijs gedurende 1 uur met zacht mengend elke 10 minuten.
3. Centrifugeer de biotinyleerde cellen bij 20.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Verzamel de supernatant die cytoplasmatische, en biotinyleerde membraaneiwitten bevat.
4. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.

6. Isolatie van Biotinyleerde Oppervlakte Proteïnen

1. Voeg 50 μL Streptavidin Magnetische Kralen in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Plaats de buis in een magnetische stand, waarbij de kralen tegen de zijde van de buis worden verzameld. Verwijder en wis de supernatant.
3. Voeg 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 aan de buis toe. Meng het voorzichtig en verzamel de kralen met de magnetische stand. Verwijder en wis de supernatant.
4. Combineer 40 μg biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten, verdund tot 300 μl in 1x PBS met gewassen magnetische kralen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder roeren.
5. Verzamel de kralen met een magnetische stand, verwijder en wis de supernatant.
6. Voeg 300 μL TBS, 0,1% Tween-20 aan de buis toe, meng zachtjes om de kralen opnieuw op te schudden. Verzamel kralen, verwijder en verwijder de supernatant. Herhaal deze wasstap twee keer.
7. Voeg 100 μl van de 0,1 M glycine pH 2,0 aan de magnetische kralen toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verzamel kralen en verwijder supernatant die geëlueerde biotinyleerde oppervlakte-eiwitten bevat.
8. Visualiseer geïsoleerde oppervlak eiwitten op een 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE gel.

7. Beoordeling van biotinylated oppervlakteproteïne

1. Dot Blot
   1. Knip een 7 cm x 3 cm strip nitrocellulose membraan.
   2. Breng 10 μg totaal tick tick aanT inhoud (vanaf 1.8 hierboven) en 10 μg biotinylated oppervlakte-eiwit aan het membraan. Laat drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Overbrengen naar een container en onderdompelen in 100 ml blokkerende buffer. Incubeer bij kamertemperatuur onder roeren gedurende een uur. Wis blokkerende buffer weg.
   4. Was nitrocellulosemembraan in 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 5 minuten met roeren. Gooi de wasbuffer weg en herhaal de was driemaal.
   5. Incubeer in 1/5000 Streptavidine-Peperwortelperoxidase (HRP) in 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 2 uur onder roeren bij kamertemperatuur en wis eventuele resterende oplossing.
   6. Was nitrocellulosemembraan in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 gedurende 5 minuten met roeren. Gooi de wasbuffer weg en herhaal de was driemaal.
   7. Ontleed 1 tablet 4-chloor-1-nafthol in 10 ml ijskoude methanol voor detectie. Voeg 4 ml methanol voorraad toe aan 20 ml TBS. Voeg 10 μL vers 30% waterstofperoxide en immedia toeToepasselijk op nitrocellulose membraan.
   8. Incubeer met roering bij kamertemperatuur tot het substraat een onoplosbaar blauw eindproduct produceert. Dit kan tussen 2-15 minuten duren.
   9. Gooi detectieoplossing en was het membraan driemaal in 100 pl MQH ₂ O.
2. ELISA-analyse
   1. Verdun 200 ng van elk monster met 400 μl 100 mM carbonaatcoatingbuffer en laag 2 lanen van de eerste rij (A #) van de ELISA-plaat (platte boorputjes)
   2. Voeg 100 μl 100 mM carbonaat coating buffer toe aan alle andere corresponderende putten in rijen (BH).
   3. Bereid de seriële verdunningen van elk monster door 100 μL van elke put in rij A te pipetteren en over te zetten in rij B. Meng zachtjes door pipetten en vermijd bellen produceren. Herhaal de verdunningen onder elke rij, waarbij de laatste 100 μL van elke put in rij H. wordt verwijderd.
   4. Bedek de plaat met parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
   5. Was de platE met 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per putje drie keer.
   6. Voeg 200 μL blokkerende buffer toe aan de gecoate putten, bedek met Parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
   7. Verdun 1 / 15.000 Streptavidine-HRP in blokkerende buffer en voeg 100 μL toe aan elke putje van de plaat. Bedek met parafilm en incubeer overnacht bij 4 ° C.
   8. Was de plaat vijf keer in 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 per putje.
   9. Om op te sporen, voeg 100 μL TMB-reagens per put toe. Na voldoende kleurontwikkeling, meestal tussen 10-15 minuten, voeg 100 μL 1 M fosforzuur toe om de reactie te stoppen.
   10. Lees de absorptie van elke bron bij λ = 450 nm.

Resultaten

Epitheelcellen werden geïsoleerd uit de darmweefsels van R. microplus volgens de schematische voorstelling in Figuur 1 . Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van epitheelcellen van tikgut, bereid met gebruikmaking van dit protocol, worden getoond in Figuur 2A En 2B. Aangezien de celisolatie wordt uitgevoerd op halfgegraveerde R. mic...

Discussie

Veebesmettingen zijn een belangrijk probleem voor de veeindustrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld, met de meest voorkomende methode van controle afhankelijk van het gebruik van acariciden ^{1 , 4} . Bm86 werd eerder geïdentificeerd binnen het epitheelvlak van de tikgut als beschermend antigeen tegen R. microplus infestatie ¹⁰ , met beperkt succes als een vaccinestrategie door Bm86 geografische sequentievariatie e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Koel in ijs voorafgaand aan gradiënt
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Opgeslagen bij 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm stijl. Polypropyleen conische buis.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ijskoud voor protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Zwitserland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol voor moleculaire biologie >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ijskoud voor protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-buis magnetische scheidingsrek
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integraal waterzuiveringssysteem voor ultrapuur water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membraan
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml gedistilleerd water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Opgeslagen bij 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – opgeslagen bij -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	Voor Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standaarden voor Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Maat 11 scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100