Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit Rhipicephalus microplus Epitheliale darmcellen

Summary

Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.

Abstract

Rhipicephalus microplus - de veestok - is de belangrijkste ectoparasiet in termen van economische impact op vee als vector van verschillende pathogenen. Er is gewerkt aan de veestokcontrole om de schadelijke effecten ervan te verminderen, met de nadruk op de ontdekking van vaccinekandidaten, zoals BM86, gelegen op het oppervlak van de epitheelcellen. Huidig ​​onderzoek richt zich op het gebruik van cDNA en genomische bibliotheken, om te screenen voor andere vaccin kandidaten. De isolatie van tikgutcellen vormt een belangrijk voordeel bij het onderzoeken van de samenstelling van oppervlakte-eiwitten op het membraan van de tikkeldarmcellen. Dit papier vormt een nieuwe en haalbare methode voor het isoleren van epitheliale cellen, uit de tikgutinhoud van halfgegraveerde R. microplus. Dit protocol maakt gebruik van TCEP en EDTA om de epitheelcellen uit de subepitheliale ondersteunende weefsels te ontlasten en een discontinuous density centrifugatiegradieNt om epitheelcellen van andere celsoorten te scheiden. Cel-oppervlakte-eiwitten werden biotinyleerd en geïsoleerd uit de epitheelcellen van de tikgut, met behulp van streptavidine-gekoppelde magnetische kralen, die toestaan ​​voor downstream toepassingen in FACS of LC-MS / MS-analyse.

Introduction

Rhipicephalus microplus , de veestok, is de meest significante ectoparasiet in termen van economische impact op de veeindustrie van tropische en subtropische regio's, aangezien het vectoren boviene tik koorts (babesiosis), anaplasmose en paardenpiroplasmosis ^{1 , 2 , 3 , 4 is} . Er zijn inspanningen gedaan voor veestokcontrole om het schadelijke effect te verminderen, maar conventionele methoden zoals het gebruik van chemische acariciden hebben impliciete nadelen, zoals de aanwezigheid van chemische residuen in melk en vlees, en ....

Protocol

1. Dissectie van de Gut Epithelium van R. microplus

1. Verzamel semi-engorged bosluizen van vee op de dag van het experiment. Dissect fluitjes binnen 24 uur na verwijdering van de gastheer.
2. Houd een strip tape vast aan de bodem van de 92 mm x 16 mm Petri-schotel. Voeg een druppel superlijm aan de band toe. Plaats de vinkje, de ventrale zijde van de superlijm, laat het gedurende 2 minuten drogen.
3. Giet 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de petrischaal, of tot de vinkje helemaal ondergedompeld is.
4. Gebruik een maat 11 scalpel, snijd van de bovenkant van de ogen naar de bodemfeestjes, aan weerszijde....

Results

Epitheelcellen werden geïsoleerd uit de darmweefsels van R. microplus volgens de schematische voorstelling in Figuur 1 . Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van epitheelcellen van tikgut, bereid met gebruikmaking van dit protocol, worden getoond in Figuur 2A En 2B. Aangezien de celisolatie wordt uitgevoerd op halfgegraveerde R. mic.......

Discussion

Veebesmettingen zijn een belangrijk probleem voor de veeindustrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld, met de meest voorkomende methode van controle afhankelijk van het gebruik van acariciden ^{1 , 4} . Bm86 werd eerder geïdentificeerd binnen het epitheelvlak van de tikgut als beschermend antigeen tegen R. microplus infestatie ¹⁰ , met beperkt succes als een vaccinestrategie door Bm86 geografische sequentievariatie e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	3322
100mM Carbonate Buffer			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap	Thermo Scientific	3138-0016	Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA	Sigma	T0440	Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer	BD Falcon	352350
AP15 filter paper	Millipore	AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit	Abcam	Ab102865
Dissection microscope	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Cell imagery software
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ice cold for protocol
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Forceps	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol for molecular biology >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Hand-Held Counter	Officeworks	JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathione oxidized	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetic Separation Stand	Novagen	-	4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane	Life Sciences	66485	30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Peristaltic Pump	Masterflex	7518-10
Phosphoric Acid	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer	Thermo-Scientific	37573	Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA standards for Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Water Bath	Grant	GD100