Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Rhipicephalus microplus - de veestok - is de belangrijkste ectoparasiet in termen van economische impact op vee als vector van verschillende pathogenen. Er is gewerkt aan de veestokcontrole om de schadelijke effecten ervan te verminderen, met de nadruk op de ontdekking van vaccinekandidaten, zoals BM86, gelegen op het oppervlak van de epitheelcellen. Huidig onderzoek richt zich op het gebruik van cDNA en genomische bibliotheken, om te screenen voor andere vaccin kandidaten. De isolatie van tikgutcellen vormt een belangrijk voordeel bij het onderzoeken van de samenstelling van oppervlakte-eiwitten op het membraan van de tikkeldarmcellen. Dit papier vormt een nieuwe en haalbare methode voor het isoleren van epitheliale cellen, uit de tikgutinhoud van halfgegraveerde R. microplus. Dit protocol maakt gebruik van TCEP en EDTA om de epitheelcellen uit de subepitheliale ondersteunende weefsels te ontlasten en een discontinuous density centrifugatiegradieNt om epitheelcellen van andere celsoorten te scheiden. Cel-oppervlakte-eiwitten werden biotinyleerd en geïsoleerd uit de epitheelcellen van de tikgut, met behulp van streptavidine-gekoppelde magnetische kralen, die toestaan voor downstream toepassingen in FACS of LC-MS / MS-analyse.
Inleiding
Rhipicephalus microplus , de veestok, is de meest significante ectoparasiet in termen van economische impact op de veeindustrie van tropische en subtropische regio's, aangezien het vectoren boviene tik koorts (babesiosis), anaplasmose en paardenpiroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 is . Er zijn inspanningen gedaan voor veestokcontrole om het schadelijke effect te verminderen, maar conventionele methoden zoals het gebruik van chemische acariciden hebben impliciete nadelen, zoals de aanwezigheid van chemische residuen in melk en vlees, en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Dissectie van de Gut Epithelium van R. microplus
- Verzamel semi-engorged bosluizen van vee op de dag van het experiment. Dissect fluitjes binnen 24 uur na verwijdering van de gastheer.
- Houd een strip tape vast aan de bodem van de 92 mm x 16 mm Petri-schotel. Voeg een druppel superlijm aan de band toe. Plaats de vinkje, de ventrale zijde van de superlijm, laat het gedurende 2 minuten drogen.
- Giet 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de petrischaal, of tot de vinkje helemaal ondergedompeld is.
- Gebruik een maat 11 scalpel, snijd van de bovenkant van de ogen naar de bodemfeestjes, aan weerszijde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Epitheelcellen werden geïsoleerd uit de darmweefsels van R. microplus volgens de schematische voorstelling in Figuur 1 . Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van epitheelcellen van tikgut, bereid met gebruikmaking van dit protocol, worden getoond in Figuur 2A En 2B. Aangezien de celisolatie wordt uitgevoerd op halfgegraveerde R. mic.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Veebesmettingen zijn een belangrijk probleem voor de veeindustrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld, met de meest voorkomende methode van controle afhankelijk van het gebruik van acariciden 1 , 4 . Bm86 werd eerder geïdentificeerd binnen het epitheelvlak van de tikgut als beschermend antigeen tegen R. microplus infestatie 10 , met beperkt succes als een vaccinestrategie door Bm86 geografische sequentievariatie e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australië) bedanken voor de levering van Rhipicephalus microplus- ticks die voor deze studie werden gebruikt, en Lucas Karbanowicz voor assistentie bij videofilms.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Koel in ijs voorafgaand aan gradiënt |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Opgeslagen bij 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm stijl. Polypropyleen conische buis. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - ijskoud voor protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont - Zwitserland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol voor moleculaire biologie >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ijskoud voor protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | - | - |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | - | 4-buis magnetische scheidingsrek |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integraal waterzuiveringssysteem voor ultrapuur water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membraan |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml gedistilleerd water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Opgeslagen bij 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – opgeslagen bij -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | Voor Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standaarden voor Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Maat 11 scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
Referenties
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
