Methodenartikel

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

DOI:

10.3791/55762

⸱

14 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 , 2 gereguleerd worden .

Bovendien dicteert eiwitten uiteindelijk de functie van de cel en dicteert daarom zijn fenotype, dat dynamische veranderingen kan ondergaan in reactie op autocrine, paracriene en endocriene factoren; Bloedgedragen bemiddelaars; temperatuur; behandeling met geneesmiddelen; En ziekte ontwikkelenment. Zo is een expressieanalyse gericht op het eiwitgehalte bruikbaar om het proteome te karakteriseren en de kritische veranderingen die erin voorkomen, te ontrafelen als onderdeel van ziektepatogenese 3 .

Daarom zijn de mogelijkheden die proteomics presenteren om de gezondheids- en ziekteomstandigheden te verduidelijken, ondanks de huidige technologische uitdagingen formidabel. De bijzonder veelbelovende onderzoeksgebieden waaraan proteomics kunnen bijdragen, omvat: het identificeren van gewijzigde eiwituitdrukking op elk niveau ( dwz hele cellen of weefsel, subcellulaire compartimenten en biologische vloeistoffen); De identificatie, verificatie en validatie van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van de ziekte; En hopelijk de identificatie van nieuwe eiwitdoelstellingen die ter therapeutische doeleinden kunnen worden gebruikt, alsmede voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen 4 .

Het vastleggen van de complexiteit vanHet proteome vertegenwoordigt een technologische uitdaging. De huidige proteomische instrumenten bieden de mogelijkheid om op grote schaal analyses uit te voeren voor de identificatie, kwantificering en validatie van gewijzigde eiwitniveaus. Daarnaast heeft de introductie van fractionerings- en verrijkingstechnieken, die gericht zijn op het vermijden van de interferentie veroorzaakt door de meest overvloedige eiwitten, ook verbeterde eiwitidentificatie door de minste overvloedige eiwitten te omvatten. Tenslotte is proteomics aangevuld met de analyse van post-translational modificaties, die zich als belangrijke modulatoren van eiwitfunctie voordoen.

De monstervoorbereiding en het eiwitherstel in de biologische monsters onder analyse blijven echter de beperkende stappen in de proteomische workflow en vergroten het potentieel voor mogelijke valkuilen 5 . Inderdaad, in de meeste moleculaire biologie technieken die moeten worden geoptimaliseerd, zijn de eerste stappen tissue homogenizatIon- en cellysis, in het bijzonder tijdens de analyse van eiwitten met weinig overvloed waarvoor geen amplificatiemethoden bestaan. Bovendien kan de chemische aard van eiwitten hun eigen herstel beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de analyse van zeer hydrofobe eiwitten is zeer uitdagend omdat ze gemakkelijk neerslaan tijdens isoelectrische focus, terwijl transmembraan eiwitten bijna onoplosbaar zijn (in Referentie 5 onderzocht). Bovendien vormt de variatie van de weefselsamenstelling een belangrijke barrière voor het ontwikkelen van een universele extractiemethode. Ten slotte, omdat bijna alle klinische exemplaren van beperkte hoeveelheid zijn, is het essentieel om eiwitbereiding mogelijk te maken met maximaal herstel en reproduceerbaarheid van minimale monsterhoeveelheden 6 .

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor extractie van eiwitten uit de normale menselijke hart mitralisklep, die een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vertegenwoordigt. De normale mitrale klep is een compLex structuur tussen het linker atrium en de linker hartslag van het hart ( figuur 1 ). Het speelt een belangrijke rol in de controle van de bloedstroom van het atrium naar de ventrikel, het voorkomen van terugstroom en het verzekeren van de juiste zuurstofvoorziening aan het hele lichaam, waardoor een adequate hartuitgang wordt behouden. Het wordt echter vaak beschouwd als een "inactief" weefsel, met een lage cellulariteit en weinig componenten, voornamelijk in de extracellulaire matrix. Dit komt doordat de inwendige valvulaire interstitiële cellen (VIC's) onder normale omstandigheden een stil fenotype met een biosynthese van lage proteïnen 7 voordoen.

Er is echter aangetoond dat in een pathologische toestand het aantal VICs in de spongiosa toeneemt en hun proteïnesynthese geactiveerd wordt, samen met andere functionele en fenotypische veranderingen 8 . Daarom is het niet verwonderlijk dat de minimale gegevens die beschikbaar zijn inDe literatuur richt zich op de analyse van pathologische mitrale kleppen 9 , 10 , waarin het verhoogde aantal geactiveerde VIC's het relatief hoge aantal geïdentificeerde eiwitten kan verklaren.

Ten slotte kan het onderhavige protocol dienen om het begrip van de pathogene mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitrale klepziekten te ontwikkelen door middel van het bestuderen van mitrale klep eiwit componenten. Inderdaad, een beter begrip van de onderliggende pathologische processen kan bijdragen tot het verbeteren van het klinisch beheer van klepziekten, waarvan de huidige indicaties voor interventie grotendeels op hemodynamische overwegingen zijn gebaseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het weefsel voor transplantatie en onderzoek wordt alleen verzameld na toestemming van de ouders; Op het toestemmingsblad machtigen ze (of niet) het gebruik van het hartweefsel voor onderzoek alleen als het niet geschikt is voor menselijk klinisch gebruik ( dwz microbiologische, functionele en serologische problemen), volgens de richtlijnen van de ethische commissie vanMonzino Cardiologic Center.

1. Mitralklepbereiding

  1. Oog de menselijke mitrale klep zo snel mogelijk na organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur).
  2. Verwijder in een schone kamer het hart uit de transporttas met een koude (4 ° C) oplossing ( bijv. Zoutoplossing of evenwichtig medium Eurocollins of Wisconsin). Zet het in een emmer en plaats het in een biosafety-kast (biohazard verticale luchtstroom, klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) classificatie) om verder te gaan met de klepbereiding.
  3. Plaats het hart op een steriele wegwerpdoek in de kast. Snijd het hart volledig, loodrecht op de hoofdas, op het niveau van de linker en rechter ventrikels, ongeveer 4 cm van de top, met behulp van een steriele wegwerpschaalpel.
  4. Beweeg de oplopende aorta en longslagader om het linker atriale dak weer te geven.
  5. Met steriele autoclavable tang en picks, snijd de linker auricle op deLinker atriumdak, waardoor de mitralklep zichtbaar is en het mogelijk maakt de grote mitrale leaflet (anterior) en de kleine mitrale leaflet (posterior) te identificeren.
    OPMERKING: Antero-laterale en de achterste mediale commissies definiëren de grens van de voorste folder en het achterste gedeelte.
  6. Ontleed het linkeratrium en de ventrikelwanddikte rond de omtrek van de hele mitrale klep met behulp van steriele autoclaverbare scharen en niet-traumatische tang .
  7. Identificeer de continuïteit van de mitro-aorta klep.
    OPMERKING: De linker ventrikel bevat de hele mitrale klep en akkoorden.
  8. Scheep de anterior mitralklepje uit de posterior mitralklepje, snijd de posterior folder langs de insteek met de ventrikel (commissuur).
  9. Was de posterior folder in de zoutoplossing. Knip de folder in kleine stukken (<1 cm 2 ) en plak ze individueel in aluminiumfolie. Bevroren ze met vloeibare stikstof.
    Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof.
    1. Maak de tafel van de kast schoon met een 70% isopropylalcoholoplossing en 6% waterstofperoxideoplossing aan het einde van de procedure.

2. Proteïne extractie

  1. Gebruik pincet om het monster op te slaan die in vloeibare stikstof is opgeslagen en plaats het op droogijs onmiddellijk terwijl het nog in de aluminiumfolie wordt verpakt. Laat het monster niet ontdooien tijdens overdrachten.
  2. Voor het slijpen, koud de porselein / zirkonium mortel en stamper van een grindersysteem ( bijv. CryoGrinder), samen met het monster, door ze in een Dewar-fles met vloeibare stikstof (~ 500 ml) te plaatsen.
    Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof.
  3. Zet de mortel en de stamper in een polystyreen doos met droogijs. Verwijder het monster uit de aluminiumfolie en steek het in de mortel.
  4. Grind tHij proeft met de grote stamper tegen de mortel 15-20 keer, met behulp van de schroevendraaier om de stamper te draaien. Meng het monster tijdens het slijpproces met de punt van een voorgekoelde spatel.
    1. Herhaal met de kleine stamper.
  5. Breng het grondmonster over op een eerder gewogen buis ( bv. 15 ml centrifugebuis) door de buis om te zetten, plaats het over de mortel en draai ze om elkaar om het monster naar de buis te verplaatsen. Gebruik een voorgekoelde spatel om het materiaal van de mortel te herstellen.
    1. Houd de buis met het monster op droog ijs om te voorkomen dat het ontdooien tijdens de overdracht.
  6. Bereken het netto gewicht van het monster.
  7. Reinig de mortel en de stamper na elk monster en ontreinig ze door autoclaven of verwarm ze bij 200 ° C gedurende 2 uur.
  8. Breng het poedervormige monster uit de centrifugebuis door de inversie naar de glazen buis van een homogenisator.
  9. Voeg gefilterde ureumbuffet toeR (8 M ureum, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris en 55 mM dithiotreitol) aan de glazen buis, 200 μl ureumbuffer voor elke 10 mg poederstof.
    OPMERKING: Residueel poedermonster dat in de centrifugebuis achterblijft, kan worden hersteld met behulp van een deel van het berekende volume ureumbuffer.
  10. Homogeniseer het monster met behulp van een roerder uitgerust met een borosilicaatglasmortel en een polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper. Druk langzaam de stamper op het monster met een draaiende beweging (1500 rpm) 10 keer.
  11. Herstel de supernatant en verplaats deze naar een schone 1,7 ml centrifugebuis. Trek het resterende monster opnieuw uit met verse ureumbuffer en voeg de helft toe van het volume dat tijdens de eerste extractie werd gebruikt.
  12. Herhaal stap 2.10.
  13. Herstel de supernatant en combineer deze met de supernatant uit stap 2.11. Plaats de gecombineerde supernatant gedurende 30 minuten op een buisrotator.
  14. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C.
  15. Herstel de supernatant anD de eiwitconcentratie meten volgens de Bradford-eiwitmeting, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het monster bij -80 ° C tot aan het gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) 11 en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) 12 ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer 13 Bevattende een proteaseremmerscocktail 14 .

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.

In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Saline oplossing0,9 % NaCl
Eurocollins ASALF30874046Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen
Eurocollins BSALF30874022Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen
WisconsinBridge lifeRM/N 4081Gebalanseerd transportmedium voor organen
Biohazard vertical flow airBurdinolaClass A GMP-classificatie
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
Cryogrinder systeemOPS diagnosticsCG 08-01Grindersysteem met mortels, stampers en schroevendraaier
Roestvrijstalen pincetten
Roestvrijstalen spatel
Wegwerp steriele scalpelMedisafeMS-10
Roestvrijstalen schaarAutoclaveerbaar
Roestvrijstalen puntenAutoclaveerbaar
Wegwerp steriele drapMon&Tex3.307.08
Steriliserende oplossing met isopropylalcohol70% isopropylalcohol
Steriliserende oplossing met waterstofperoxide6% waterstofperoxide
Micropipet, 1 ml, met tips
15 ml centrifugebuizenVWR international9278
1,7 ml centrifugebuizenVWR internationalPIER90410
Urea buffer8 M ureum, 2 M thioureum, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
UreaSigma aldrichU6504-1KGTe gebruiken voor Urea buffer
ThioureumSigma aldrichT8656Te gebruiken voor Urea buffer
CHAPSSigma aldrichC3023-5GRTe gebruiken voor Urea buffer
DithiotreitolSigma aldrichD0632-5GTe gebruiken voor Urea buffer
Spuit 50 mlPICTe gebruiken voor het filteren van Urea buffer
0,22 μm filterMilliporeSLGP033RBTe gebruiken voor het filteren van Urea buffer
PFTE stamper, 2 mlKartell6302Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator
Glas mortel met borosilicaatKartell6102Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator
RoerderVELP scientificaRoerder DLHTe gebruiken voor homogenisatie door Potter-Elvehjem
Bradford-eiwitbepalingBio-Rad laboratories5000006
BuisrotatorPbi InternationalF205
Vloeibare stikstof
Aluminiumfolie
IJs
Polystyreen doos
Droogig
CentrifugeVoor centrifugatie van 1,7 ml centrifugebuizen bij 13.000 x g
Freezer -80°C
Precisiebalans
AutoclaafVoor sterilisatie
Cryogene handschoenen voor vloeibare stikstof
Handschoenen
Professionele geforceerde ventilatie en natuurlijke luchtconvectie-ovenVoor sterilisatie
Protease-remmercocktailSigma aldrichP8340-5ML100X-oplossing
ProteoExtract Protein Precipitation KitCalbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.orgversie 2.7Softwareplatform voor Gene Ontology-analyse
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoversie 3.0.3Plugin voor Gene-ontologieanalyse
AlphaB Crystallin/CRYAB AntilichaamNovus BiologicalsNBP1-97494Muis monoklonaal antilichaam tegen CryAB
Septin-11 AntilichaamNovus BiologicalsNBP1-83824Konijn polyklonaal antilichaam tegen septin-11
FHL1 AntilichaamNovus BiologicalsNBP-188745Konijn polyklonaal antilichaam tegen FHL-1
Dermatopontin AntilichaamNovus BiologicalsNB110-68135Konijn polyklonaal antilichaam tegen dermatopontin
Geit Anti-muis IgG HRPSigma aldrichA4416-0.5MLSecundair antilichaam voor immunoblotting
Geit Anti-konijn IgG HRPBio-Rad laboratories170-5046Secundair antilichaam voor immunoblotting

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote ne extractieProteomische AnalyseUreabufferVermalen met Vloeibare StikstofBradford assayTweidimensionale ElektroforeseVloeistofchromatografie massaspectrometrieGene Ontology analyseHartklepziekte

Gerelateerde artikelen