De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.
Inleiding
Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 ,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) 11 en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) 12 ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer 13 Bevattende een proteaseremmerscocktail 14 .
.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.
In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Saline oplossing | 0,9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Gebalanseerd transportmedium voor organen |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP-classificatie | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder systeem | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grindersysteem met mortels, stampers en schroevendraaier |
| Roestvrijstalen pincetten | |||
| Roestvrijstalen spatel | |||
| Wegwerp steriele scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Roestvrijstalen schaar | Autoclaveerbaar | ||
| Roestvrijstalen punten | Autoclaveerbaar | ||
| Wegwerp steriele drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Steriliserende oplossing met isopropylalcohol | 70% isopropylalcohol | ||
| Steriliserende oplossing met waterstofperoxide | 6% waterstofperoxide | ||
| Micropipet, 1 ml, met tips | |||
| 15 ml centrifugebuizen | VWR international | 9278 | |
| 1,7 ml centrifugebuizen | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M ureum, 2 M thioureum, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | Te gebruiken voor Urea buffer |
| Thioureum | Sigma aldrich | T8656 | Te gebruiken voor Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | Te gebruiken voor Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | Te gebruiken voor Urea buffer |
| Spuit 50 ml | PIC | Te gebruiken voor het filteren van Urea buffer | |
| 0,22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | Te gebruiken voor het filteren van Urea buffer |
| PFTE stamper, 2 ml | Kartell | 6302 | Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator |
| Glas mortel met borosilicaat | Kartell | 6102 | Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator |
| Roerder | VELP scientifica | Roerder DLH | Te gebruiken voor homogenisatie door Potter-Elvehjem |
| Bradford-eiwitbepaling | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Buisrotator | Pbi International | F205 | |
| Vloeibare stikstof | |||
| Aluminiumfolie | |||
| IJs | |||
| Polystyreen doos | |||
| Droogig | |||
| Centrifuge | Voor centrifugatie van 1,7 ml centrifugebuizen bij 13.000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precisiebalans | |||
| Autoclaaf | Voor sterilisatie | ||
| Cryogene handschoenen voor vloeibare stikstof | |||
| Handschoenen | |||
| Professionele geforceerde ventilatie en natuurlijke luchtconvectie-oven | Voor sterilisatie | ||
| Protease-remmercocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X-oplossing |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | versie 2.7 | Softwareplatform voor Gene Ontology-analyse |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | versie 3.0.3 | Plugin voor Gene-ontologieanalyse |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antilichaam | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Muis monoklonaal antilichaam tegen CryAB |
| Septin-11 Antilichaam | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Konijn polyklonaal antilichaam tegen septin-11 |
| FHL1 Antilichaam | Novus Biologicals | NBP-188745 | Konijn polyklonaal antilichaam tegen FHL-1 |
| Dermatopontin Antilichaam | Novus Biologicals | NB110-68135 | Konijn polyklonaal antilichaam tegen dermatopontin |
| Geit Anti-muis IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secundair antilichaam voor immunoblotting |
| Geit Anti-konijn IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secundair antilichaam voor immunoblotting |
Referenties
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expressio....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
