Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Summary

De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.

Abstract

Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.

Introduction

Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen ^{1 ,}

Protocol

In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het w....

Results

De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) ¹¹ en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) ¹² ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer ¹³ Bevattende een proteaseremmerscocktail ¹⁴ .

.......

Discussion

Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.

In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline solution			0.9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin	Bridge life	RM/N 4081	Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air	Burdinola		Class A GMP classification
Dewar Flask	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system	OPS diagnostics	CG 08-01	Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel	Medisafe	MS-10
Stainless steel scissors			Autoclavable
Stainless steel picks			Autoclavable
Disposable sterile drap	Mon&Tex	3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol			70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide			6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes	VWR international	9278
1.7 mL centrifuge tubes	VWR international	PIER90410
Urea buffer			8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea	Sigma aldrich	U6504-1KG	To be used for Urea buffer
Thiourea	Sigma aldrich	T8656	To be used for Urea buffer
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	To be used for Urea buffer
Dithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL	PIC		To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter	Millipore	SLGP033RB	To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL	Kartell	6302	Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar	Kartell	6102	Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer	VELP scientifica	Stirrer DLH	To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay	Bio-Rad laboratories	5000006
Tube rotator	Pbi International	F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge			For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave			For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven			For sterilization
Protease inhibitor cocktail	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	version 2.7	Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	version 3.0.3	Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody	Novus Biologicals	NBP1-97494	Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody	Novus Biologicals	NBP1-83824	Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody	Novus Biologicals	NBP-188745	Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody	Novus Biologicals	NB110-68135	Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP	Bio-Rad laboratories	170-5046	Secondary antibody for immunoblotting