Oprichting van een knaagdier Model van abdominale aorta aneurysma door het blokkeren van Adventitial Vasa Vasorum perfusie

Summary

Polyurethaan katheter inbrengen in de aorta lumen en hechtdraad Afbinding van de aorta induceren chronische hypoxie als gevolg van hypoperfusie van de adventitial Wasa vasorum. Dit artikel beschrijft een roman diermodel van abdominale aorta aneurysma (AAA) met eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van AAA bij de mens.

Abstract

De adventitial Wasa vasorum (VV) biedt zuurstof en voeding aan de wand van de aorta. Hypoxie in de aorta muur kan leiden tot uitgebreide abdominale aorta aneurysma (AAAs). Dit artikel introduceert en beschrijft een standaard protocol dat wordt gebruikt voor het opwekken van AAAs via adventitial VV hypoperfusie gemaakt met een combinatie van polyurethaan katheter inbrengen in de aorta lumen en hechtdraad Afbinding van de abdominale aorta infrarenal.

Het protocol impliceert het gebruik van mannelijke ratten gewicht van 300-400 g, die voedsel en water ad libitumworden meegeleverd. Na de laparotomie met een ventral midline abdominale incisie, wordt afschilfering van de aorta uitgevoerd, die de doorbloeding van het weefsel gerelateerde blokkeert. Aortotomy waarbij een kleine snede grenzend aan de takken van de renale slagader wordt uitgevoerd, en een polyurethaan katheter is ingevoegd met behulp van een 18-gauge inwonende naald. Na het repareren van de incisie, strakke Afbinding van de aorta over de katheter blokken VV doorbloeding van de proximale richting door de aorta muur zonder verstoring van de aorta doorbloeding. Deze techniek kan een AAA met progressieve aorta maagdilatatie veroorzaken.

Het grootste voordeel van dit model is dat VV hypoperfusie veroorzaakt weefsel hypoxie en de ontwikkeling van een infrarenal AAA, dat vergelijkbaar met die van een menselijke AAA morfologische en pathologische kenmerken is.

Introduction

De abdominale aorta is samengesteld uit de volgende drie lagen: de vasculaire binnenmuur (intima) mediale laag (media) en de buitenste vasculaire muur (adventitia), en van deze, de adventitia heeft een unieke bloed leveren systeem bekend als de vasa vasorum (VV). Aorta weefsel wordt geleverd met zuurstof via adventitial VV perfusie en eenvoudige zuurstof diffusie van de aorta bloed stroom¹. Echter, geografisch, de abdominale aorta heeft de minste verdeling van VVs vergeleken met die in andere delen van de aorta. ²

Een eerdere studie gemeld op weefsel hypoxie in menselijke abdominale aorta aneurysma (AAA) muren met dikke intraluminale trombose (ILT)³. Bovendien is gebleken dat een adventitial VV in aneurysmal muren met arteriosclerotic wijzigingen op een aanzienlijk hoger tarief, dat gekoppeld aan weefsel hypoxie in de AAA muren^{4 is}is geroteerd. Op basis van deze bevindingen, was een roman knaagdier model van AAA gemaakt door inducerende adventitial VV hypoperfusie⁵. In dit model veroorzaakt VV hypoperfusie weefsel hypoxie en de ontwikkeling van een infrarenal AAA, die had morfologische en pathologische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van een menselijke AAA-⁶. Uitstekende voorbeelden waren de aanwezigheid van ILTs en de accumulatie van hyperplastische adipocytes⁶, en kunnen leiden tot breuk^7,8. Deze bevindingen zijn zelden waargenomen in voorgaande knaagdier modellen. Dit model kan dus enorm bijdragen aan een dieper begrip van het mechanisme verantwoordelijk voor AAA ontwikkeling en breuk. We introduceren en beschrijven van een standaard protocol dat wordt gebruikt voor het opwekken van AAAs via adventitial VV hypoperfusie, en wij leggen uit hoe voor het opwekken van hypoxie in de aorta muur met behulp van chirurgische technieken.

Protocol

verzorging van de dieren en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het Hamamatsu Universiteit School van geneeskunde Animal Care Committee in het midden dier ziekenverpleger.

1. chirurgische Procedure voor het maken van het Model

Opmerking: plaats de chirurgische instrumenten in een sterilisator kraal voor 10 s preoperatively. Gebruik van steriele handschoenen en.

1. Gebruik mannelijke ratten met een gewicht van 300-400 g. de rats toegang tot voedsel en water ad libitum.
2. Anesthetize de rat met Isofluraan inademing (2.0-3.0 mL/L). Juiste afstomping bevestigen door teen snuifje.
3. Haren op de buik met een elektrisch scheerapparaat te scheren, en scrub van de buik met alcohol en een Povidon-jodium oplossing.
4. Plaats de rat in de liggende positie op de operatie tafel. Gebruik maken van dierenarts zalf op de rat ' s ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
5. Voeren een laparotomie met een ventral midline abdominale incisie met behulp van een schaar. Om een duidelijke chirurgische veld, pak de abdominale inhoud in de buikholte met steriel gaas met behulp van een wond oprolmechanisme.
6. Loskoppelen van de aorta uit het gerelateerde weefsel, voorzichtig oppakken en scheuren van het retroperitoneum met een pincet bloot van de aorta muur en peeling de aorta infrarenal in de retroperitoneal ruimte tussen het niveau van de linker nier ader de bifurcatie uit de gerelateerde weefsel ( figuur 1A).
7. De vaartuigen vertakking van de abdominale aorta met een 5-0 zijde koord naar blok bloed leveren op een punt uit de buurt van de aorta dat betekent niet het beperken van de aorta lumen Ligate.
8. Voor het blokkeren van de aorta doorbloeding, plaats vasculaire clips net onder de renale slagader en net boven de bifurcatie van de aorta.
   Opmerking: De grootte van de clips groter moet zijn dan de diameter van de aorta volledig blokkeren van de bloedstroom. Een tijdelijk 5-0 zijde tekenreeks ligatuur is ook voldoende voor het blokkeren van de bloedstroom in de plaats van de clips.
9. Vergelijkbaar met het maken van een bloeding van de stip op het oppervlak van de aorta muur, snijd de anterior aorta muur met behulp van een micro-schaar 5 mm distally uit de aorta clip, grenzend aan de takken van de renale slagader, invoegen van een polyurethaan katheter.
10. Invoegen een polyurethaan katheter (buitendiameter 0.55 mm, binnendiameter 0,37 mm) met behulp van een 24-gauge inwoning ondiep naald via de incisie wegwassen van bloed in de aorta met water. Beheren van een 1 mL spuit gevuld met water in de polyurethaan katheter en het overgebleven bloed in de aorta met water wegspoelen. Na irrigatie, verwijderen de katheter de aorta.
11. Voor het invoegen van een polyurethaan katheter (buitendiameter 1.20 mm, binnendiameter 0.94 mm) met behulp van een 18-gauge inwonende naald, snijd de polyurethaan katheter tot 10 mm lange ( figuur 1B).
    1. Invoegen de cut stuk van de polyurethaan katheter in de aorta lumen van de incisie gemaakt in stap 1.9. Volledig plaats van de 10-mm katheter in de aorta lumen, en verplaats het middelpunt van de katheter aan de locatie van de incisie (d.w.z., dekking van de incisie met de katheter).
12. Reparatie van de incisie met onderbroken hechtingen met behulp van een 8-0 monofilamenten string ( Figuur 1 c).
13. Ligate de abdominale aorta met behulp van een combinatie van zijden tekenreeks van 5-0 en de polyurethaan katheter ( Figuur 1 d).
    Opmerking: De aorta lumen kan worden gehandhaafd door de inwonende katheter. Het afbinden van de aorta stevig om te voorkomen dat misaligning de positie van de katheter. De chirurg ' s knoop wordt aanbevolen, omdat het voegt een extra wending wanneer koppelverkoop de eerste worp van de knoop, vormen een dubbele bovenhands knoop, en een extra beurt geeft meer wrijving en kan verminderen losraken.
14. Na afbinding, verwijder de vasculaire clip aan de aorta bifurcatie, en vervolgens de vasculaire clip hieronder de renale slagader om te herstellen van de antegrade doorbloeding. Bevestigen van bruto aorta pulsatie.
15. Sluit de abdominale incisie in twee lagen, het buikvlies en andere lagen, met een 4-0 polypropyleen hechtdraad. Strak suture de snede om te voorkomen dat een uitgepuild orgel.
16. Toepassen actueel lidocaïne op de buik incisie. Plaats de rat op een verwarming pad tot bewustzijn terugkeert. Laat niet een rat zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Niet de terugkeer van een rat die operatie aan het gezelschap van andere ratten heeft ondergaan, totdat het volledig is hersteld.
17. Volgen de rat na de operatie. Een bolus van steriele zoutoplossing (1.0-2.0 mL) subcutaan injecteren als een rat tekenen van nood of lichaam gewichtsverlies toont.
18. Observeren postoperatief, de ontwikkeling van de tijd-gangen van de uitgebreide aorta op een echogram echografie. Maatregel de maximale diameter van de binnenkant van de rand aan de buitenrand van de abdominale aorta als omschreven ⁵.

2. Oogsten, vaststelling en Elastica-van Gieson (EVG) Staining

1. achtentwintig dagen postoperatief, beheren natrium pentobarbital ≥ 100 mg/kg intraperitoneally tot de rats euthanaseren.
2. Opengesneden op de rat ' s abdominale Holten ventrally. Maak de oorspronkelijke incisie met behulp van een scalpel. Oogst van het aneurysma met behulp van schaar en plaats de geoogste aortas in 10% neutraal gebufferd formaline voor 24-48 h.
   Opmerking: De chirurg moet voorzichtig ter voorkoming van schade aan de aorta en andere organen bij het blootstellen van het aneurysma. Een verhoogde abdominale orgaan moet worden nageleefd, met vermelding van AAA vorming. Figuur 2 toont een beeld-in-vivo en ex vivo beeld; Deze representatieve steekproef van AAAs is niet gescheurd.
3. EVG kleuring ⁹
   1. Oplossing voorbereiding
      1. voorbereiden Verhoeff ' s Haematoxyline door het mengen van de volgende handelingen uit in de gegeven volgorde: alcoholische Haematoxyline 20 mL, 10% ferrichloride 8.0 mL, en Lugol ' s jodium 8 mL. Meng de oplossing tussen elke toevoeging. Deze oplossing kan worden bereid verse desgewenst.
      2. Voorbereiden Van Gieson ' s oplossing door het mengen van 1% zuur Fuchsine 1 mL en verzadigde pikrinezuur 45 mL. Laat rusten en meng goed. Deze oplossing is 2 weken stabiel.
      3. Bereid onderscheidende oplossing (2% ferrichloride) door het mengen van 10% FeCl ₃ 10 mL in 40 mL gedestilleerd water. Deze oplossing kan worden bereid verse desgewenst.
      4. Voorbereiden 5% hypo door ontbinding van 5,0 g natrium thiosulfate in 100 mL gedestilleerd water. Deze oplossing is voor 1 jaar stabiel.
   2. Staining procedure
      Opmerking: zie referentie ⁹ voor meer informatie.
      1. Kort, hydrateren de vaste paraffine secties van de geoogste aortas in gedistilleerd water voor 10 min. de aortas plaats in Verhoeff ' s Haematoxyline gedurende 25 minuten wassen met water en dip 10 - 30 keer in het onderscheiden van oplossing (2% FeCl ₃). Spoelen in water. Plaats in 5% hypo voor 1 min. wassen in water. Plaats in Van Gieson ' s oplossing voor 5 min.
      2. Dehydrate in alcohol in de volgende volgorde: 75%, 90%, 95%, 100% en 100% alcohol voor 30 s elke. Schakelt in xyleen gedurende 5 minuten, tweemaal. Plaats op een dekglaasje aan met harsachtige montage medium.
         Opmerking: elastische vezels verschijnen blauw-zwarte tot zwart; kernen: blauw tot blaCK; collageen: rood; en andere elementen van het weefsel: gele.

Results

De beschreven operatietechniek maken een roman diermodel van een chronische hypoxie-geïnduceerde aorta aneurysma met behulp van een combinatie van polyurethaan katheter inbrengen en hechtdraad Afbinding van de abdominale aorta infrarenal bij ratten. De ratten die zijn beschreven in de sectie Protocol werden euthanized 28 dagen na de ingreep. De aortas werden geoogst en beeld om te visualiseren aneurysma vorming. Figuur 2 toont de ontwikkeling van de sigaarvormig AAA. De bovenste en onderste uiteinden van de aorta in ex vivo hebben een normale diameter zonder maagdilatatie. Aorta diameters werden gemeten met behulp van transabdominal Ultrasonografie (Figuur 3). De diameter in het algemeen bereikt zijn maximale grootte op ongeveer 14 dagen na de ingreep; Daarna, het blijft ongewijzigd of enigszins toeneemt. Figuur 4 toont het histopathologisch beeld van het aneurysma op zijn maximale diameter na EVG kleuring. Het beeld van het weefsel op dag 28 (aneurysma) toonde prominente afbraak van elastische vezels vergeleken met die op dag 0.

Figuur 1: Chirurgische procedures voor het opwekken van een abdominaal aorta-aneurysma (AAA).
(A) de infrarenal aorta is geëxpandeerd van het omringende weefsel. (B) een polyurethaan katheter knippen 10 mm lang wordt ingebracht via een kleine incisie in de aorta. (C) de incisie is hersteld met een 8-0 monofilament hechtdraad en doorbloeding is hersteld. (D) de aorta is afgebonden met een 5-0 zijde hechtdraad over de ingevoegde katheter. Schaal bar = 5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Postoperatieve representatieve resultaten.
Macroscopische visie op postoperatieve dag 28 weergegeven: ontwikkeling van sigaarvormig abdominale aorta aneurysmata. De verhoogde marge van het retroperitoneum komt overeen met de buitenste rand van het aneurysma (gebroken lijnen; links). De bovenste en onderste uiteinden van de aorta in ex vivo zijn normale (rechts). Schaal bar = 3 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Maximum aorta diameters gemeten met behulp van transabdominal Ultrasonografie.
De diameter van de aorta is gestaag toegenomen in dit model van de rat. Aorta diameters worden gepresenteerd als een gemiddelde ± standaardafwijking (n = 12). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Representatieve beelden van aneurysmal weefsel met Elastica van Gieson kleuring.
Histologische evaluatie met EVG kleuring tonen de degeneratieve elastische lamina in de media en de vorming van een trombose van de intraluminale 28 dagen na de ingreep (rechts). Elastische vezels versnippering in de aorta media en schaars collageen vezels in de aorta adventitia worden waargenomen op dag 28. Dag 0 is vóór de procedure (links). Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Onder fysiologische omstandigheden, worden de binnenste lagen van de aorta muur gevoed door diffusie uit de luminal doorbloeding, overwegende dat de buitenste en middelste lagen worden gevoed door de VV, die van de adventitia in de mediale VV^{1 doordringen}. VV doorbloeding in de buikwand van de aorta kan afkomstig zijn van de volgende drie richtingen/gebieden: (1) de proximale richting via de wand van de aorta, de (2) de distale richting via de wand van de aorta, en (3) gerelateerde weefsels¹⁰. Eerder, onze histologische analyse van menselijke weefsels aanzienlijke stenose of occlusie van de VV in de AAA-muur, suggereren dat VV doorbloeding in de aorta buikwand verminderde⁴kan worden geïdentificeerd. Het is een buitengewoon belangrijk punt in dit protocol dat een infrarenal AAA werd veroorzaakt door een combinatie van polyurethaan katheter inbrengen en hechtdraad Afbinding van de abdominale aorta infrarenal. Om zorgvuldig exfoliëren de laag weefsel, moeten chirurgen een polyurethaan katheter vlot invoegen in de aorta en stevig het afbinden van de aorta te veroorzaken van chronische hypoxie als gevolg van hypoperfusie van de adventitial VV en aneurysma vorming. Met behulp van deze technieken, doorbloeding in de aorta muur is derhalve gedaald, en een lokale hypoxische omgeving wordt geïnduceerd. De vermindering van de stroom van bloed en hypoxie-geïnduceerde aneurysma vorming geeft aan dat VV doorbloeding in de aorta buikwand een rol in de pathogenese van AAA vorming speelt.

In het bijzonder een aneurysma van de aorta-model moet voldoen aan de volgende voorwaarden: een 1.5-fold stijging van de vasculaire diameter t.o.v. baseline, degeneratie van de tunica media en ontsteking van de aortaklep muur. De meest populaire dierlijke modellen zijn aangelegd door inducerende inflammatoire reacties met stoffen, zoals CaCl₂¹¹, elastase¹²en angiotensine II¹³. Deze modellen kunnen hebben een hoge reproduceerbaarheid en uiteraard veroorzaken pathologische veranderingen, en zij zijn gewoonlijk gebruikt in onderzoeken. In ons model beoordeeld wij van de aorta diameter met Ultrasonografie elke 7 dagen vanaf voordat de procedure werd uitgevoerd tot dag 28 na de ingreep (Figuur 3). Resultaten toonden aan dat de diameter van de aorta matig verhoogd de 28 dagen, die aangeeft dat deze wijziging in de diameter vergelijkbaar met die in voorgaande knaagdier modellen is. Bruto observatie van de vasculaire formulier aangegeven een soepele sigaarvormig vorm (Figuur 2). Op dag 28, we opgeofferd de ratten en histopathologische analyses van de aorta weefsel dat werd teruggevonden uitgevoerd. Scheuren en verdwijning van de elastische en collageen vezels van de tunica media en adventitia werden waargenomen (Figuur 4). Bovendien waren de ontstekingscellen, zoals macrofagen, aanwezig van de tunica adventitia tot de tunica media.

Momenteel zijn de behandelingsopties beschikbaar voor AAAs beperkt tot reparatie van chirurgische en endovasculaire stent enten, met sterftecijfers van 30-50% bij patiënten met AAA breuk¹⁴. Echter is geen drug goedgekeurd voor klinisch gebruik voor de behandeling van AAAs. Er is een debat dat er verschillen in de pathologische bevindingen tussen mens en gevestigde diermodellen gebruikt in AAA onderzoek zijn. Gelijkenissen in de pathogenese tussen menselijke AAA en diermodellen AAA zijn essentieel voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen. Met betrekking tot de effectiviteit van knaagdier modellen is ons model rat morfologisch vergelijkbaar met mensen in termen van intraluminale trombose⁵ en adipogenesis⁸. Bovendien is ongeveer 20% van de ratten in deze studie had AAA breuk en stierf binnen 28 dagen na de ingreep. Hoewel aorta aneurysma ruptuur de meest kritieke gebeurtenis voor deze ziekte is, breuk is ongewoon met gevestigde experimentele AAA-modellen, en het mechanisme is nog niet opgehelderd. Dit model is daarom nuttig voor het begrijpen van het mechanisme van verwijding van de aorta diameter en ruptuur van het aneurysma.

De oprichting van dit model is vereist voor sommige chirurgische ingrepen. Daarom moeten de onderzoekers praktijk maken dit model, dat een beperking van dit model is. In de toekomst zouden we willen tot stand brengen van een knaagdier model waarin we bloedstroom verminderen kan door geleidelijk de verdikking van de VV muren, wat resulteert in spontane aorta aneurysma.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
rat	Japan SLC.Inc	Slc:SD rat	Sprague–Dawley ratTM
povidone-iodine solution	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.	4987335 111457
5-0 silk string	Akiyama Medical MFG. CO.,LTD	JIS No.1
vascular clips	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	C-42-S-2
polyurethane catheter (24-gauge indwelling needle)	MEDIKIT	24G	Supercath Z4VTM, 24-gauge indwelling needle
polyurethane catheter (18-gauge indwelling needle)	MEDIKIT	18G	Supercath Z3VTM, 18-gauge indwelling needle
8-0 monofilament string	Ethicon Suture	c-42-S-2	PROLENE Polypropylene Suture, Repair the incision with the suture