De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen heeft significant bijgedragen tot studies op zowel fysiologische als pathologische in vivo processen. De pronucleaire injectie van DNA-expressieconstructen in bevruchte oocyten blijft de meest gebruikte techniek om transgene muizen te genereren voor overexpressie. Met de introductie van CRISPR technologie voor gen targeting, is pronucleaire injectie in bevruchte oocyten uitgebreid tot de generatie van zowel knock-out en knockin muizen. Dit werk beschrijft de voorbereiding van DNA voor injectie en het genereren van CRISPR-gidsen voor gen targeting, met bijzondere nadruk op kwaliteitscontrole. De genotyperingsprocedures die nodig zijn voor de identificatie van potentiële oprichters zijn kritisch. Innovatieve genotyping strategieën die gebruik maken van de "multiplexing" mogelijkheden van CRISPR worden hierin gepresenteerd. Chirurgische procedures worden ook beschreven. Samen zullen de stappen van het protocol het genereren van gen mogelijk makenEtisch gemodificeerde muizen en voor de daaropvolgende vestiging van muiskolonies voor een overvloed aan onderzoeksvelden, waaronder immunologie, neurowetenschappen, kanker, fysiologie, ontwikkeling en anderen.
Inleiding
Diermodellen, zowel bij gewervelde dieren als in ongewervelden, hebben bijgedragen tot het onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer 1 , 2 . Ze zijn ook waardevolle hulpmiddelen om te zoeken naar ziekteveranderende middelen en uiteindelijk nieuwe behandelstrategieën te ontwikkelen in de hoop op een genezing. Hoewel elk model intrinsieke beperkingen heeft, is het gebruik van dieren als gehele systemische modellen van vitaal belang voor biomedisch onderzoek. Dit komt doordat de metabolische en complexe fysiologische omgeving niet volledig in de weefselkweek kan....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de University of New South Wales Animal Care and Ethics Committee.
1. Bereiding van het transgeen (willekeurige integratie)
- Analytische agarosegel-elektroforese.
- Digest het plasmide om het transgen te accentueren door gebruik te maken van geschikte enzymen (1 u incubatie) of snel verteerbare enzymen (15 tot 30 min incubatie) in een thermocycler volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie figuur 2A en zijn legende).
- Giet een 1% tris-acetaat-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TEA) agarosegel, gekleurd met 0,5-1,0 μg / ml e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hieronder worden de werkstromen voor microinjectie in het geval van willekeurige integratie en CRISPR-gemedieerde gen targeting beschreven ( Figuur 1 ).
Figuur 1: Typische werkstroom voor de generatie van genetisch gemodificeerde muizen. Voor willekeurige integratie wordt het gezuiverde trans.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen binnen het protocol
De opkomst van genetisch gemodificeerde muizen is technisch uitdagend. Het hier gepresenteerde protocol is echter een geoptimaliseerde en vereenvoudigde methode waarmee men de techniek in recordtijd kan beheersen en oplossen. Er zijn twee stappen nodig om de techniek succesvol af te ronden. Ten eerste kan de synthese van lineaire DNA templates (voor de synthese van sgRNAs) worden bereikt zonder magnesiumchloride (MgCl2). Het wordt echter sterk aanbevolen om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verstrekken academische transgenese diensten in muizen via het University of New South Wales Mark Wainwright Analytical Center.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken het personeel van de dierenfaciliteit (BRC) voor hun lopende ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council en de Australian Research Council.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Micropipette 0.1-2.5 μL | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2 - 20 μL | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20 - 200 μL | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100 - 1.000 μL | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecuulgewichtsmarker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| Molecuulgewichtsmarker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - Verdunnen tot 1x |
| Ethidiumbromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gelkleuring | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extractie kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR zuiveringskit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuumsysteem (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-vrije micro-injectiebuffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifugefilter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR-expresserend plasmide (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease-vrij water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA zuiveringsspinkolommen (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donorplasmide | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryocultuurmedium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineralolie | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasine B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mondstuk | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glas microcapillairen | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 pincet | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Irisschaar | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vesselaar | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wondclips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clipsapplicatie | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Microschaar | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterisator | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Niet-absorbeerbare chirurgische hechtdraden (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Elektroforese instelling | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopische microscoop | Olympus | SZX7 | |
| Omgekeerde microscoop | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulatoren | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oöcyten manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Muizen C57BL/6J-stam | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Referenties
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
