Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Summary

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Abstract

Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen heeft significant bijgedragen tot studies op zowel fysiologische als pathologische in vivo processen. De pronucleaire injectie van DNA-expressieconstructen in bevruchte oocyten blijft de meest gebruikte techniek om transgene muizen te genereren voor overexpressie. Met de introductie van CRISPR technologie voor gen targeting, is pronucleaire injectie in bevruchte oocyten uitgebreid tot de generatie van zowel knock-out en knockin muizen. Dit werk beschrijft de voorbereiding van DNA voor injectie en het genereren van CRISPR-gidsen voor gen targeting, met bijzondere nadruk op kwaliteitscontrole. De genotyperingsprocedures die nodig zijn voor de identificatie van potentiële oprichters zijn kritisch. Innovatieve genotyping strategieën die gebruik maken van de "multiplexing" mogelijkheden van CRISPR worden hierin gepresenteerd. Chirurgische procedures worden ook beschreven. Samen zullen de stappen van het protocol het genereren van gen mogelijk makenEtisch gemodificeerde muizen en voor de daaropvolgende vestiging van muiskolonies voor een overvloed aan onderzoeksvelden, waaronder immunologie, neurowetenschappen, kanker, fysiologie, ontwikkeling en anderen.

Introduction

Diermodellen, zowel bij gewervelde dieren als in ongewervelden, hebben bijgedragen tot het onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer ^{1 , 2} . Ze zijn ook waardevolle hulpmiddelen om te zoeken naar ziekteveranderende middelen en uiteindelijk nieuwe behandelstrategieën te ontwikkelen in de hoop op een genezing. Hoewel elk model intrinsieke beperkingen heeft, is het gebruik van dieren als gehele systemische modellen van vitaal belang voor biomedisch onderzoek. Dit komt doordat de metabolische en complexe fysiologische omgeving niet volledig in de weefselkweek kan worden gesimuleerd.

Tot op heden blijft de muis de meest voorkomende zoogdiersoort die wordt gebruikt voor genetische manipulatie omdat het meerdere voordelen heeft. De fysiologische processen en genen die verband houden met ziekten worden sterk bewaard tussen muizen en mensen. De muis was het eerste zoogdier om zijn volledige genoom sequenced (2002) te hebben, een jaar voor het menselijk genoMij ​​(2003). Naast deze rijkdom genetische informatie heeft de muis goede fokcapaciteiten, een snelle ontwikkelcyclus (6 weken van bevruchting tot speen) en een redelijke omvang. Al deze voordelen, in combinatie met fysiologische indicatoren, zoals onderscheidende coat kleuren (vereist voor het oversteken van strategieën), maakte de muis een aantrekkelijk model voor genetische manipulatie. Met name in de vroege tijd van de moderne genetica begon Gregor Mendel met muizen te werken voordat ze naar planten ^{3 gaan} .

Gene transfer technieken resulteerden in de generatie van de eerste transgene muis over drie decennia geleden ⁴ , oorspronkelijk gemaakt met behulp van virale levering. Echter, onderzoekers realiseerden snel dat een van de belangrijkste uitdagingen van de muis transgenese het onvermogen was om het lot van het exogene DNA te controleren. Omdat de virale afgifte van transgenen in muis-oocyten resulteerde in meerdere kopieën willekeurig geïntegreerd in het genoom, de mogelijkheidY van het opstellen van de volgende transgene lijnen was beperkt.

Een dergelijke beperking werd overwonnen toen Gordon et al. Genereerde de eerste transgene muislijn door microinjectie ^{5 , 6} . Dit begon het tijdperk van recombinante DNA technologie, en de parameters die het resultaat van een microinjectiesessie beïnvloeden zijn in grote mate bestudeerd ⁷ . Hoewel microinjectie geen controle biedt op de integratieplaats van het transgeen (dat uiteindelijk resulteert in specifieke expressieniveaus voor elke oprichtermuis), blijft het voornaamste voordeel van pronucleaire microinjectie de vorming van concatemers ( dat wil zeggen arrays van meerdere kopieën van het transgene, Gekoppeld in serie) voor genomische integratie ⁵ . Dit kenmerk is door de jaren heen gebruikt om duizenden transgene muislijnen te vormen die een gen van belang uitdrukken. Sindsdien is transgenese, de aRtmatige modificatie van het genoom van een organisme, is uitgebreid gebruikt om de rol van enkele genen bij het optreden van ziekten te identificeren.

Een verdere belangrijke prestatie bij het manipuleren van het muisgenoom werd bereikt toen Mario Capecchi succesvol een enkel gen in de muis ontwricht, waardoor het tijdperk van gen targeting ^{8 werd} geopend. Echter, grote nadeel kwam snel uit ES-cel gebaseerde gen targeting, met inbegrip van de uitdagingen van het cultiveren van ES cellen, de ietwat variabele mate van chimerisme en de lengte van het proces ( dat wil zeggen 12-18 maanden, minimum, om de muis te verkrijgen) .

Onlangs zijn vooruitgang geboekt in nieuwe technologieën, zoals geanimeerde endonucleasen (bijvoorbeeld zinkvinger nucleasen (ZFN), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALEN) en clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR / Cas9)) Versnellen het proces van gen targeting in micE ^{9 , 10} . Deze endonucleasen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd in muis-oocyten door microinjectie, waardoor de generatie van gen-gerichte muizen in zo weinig als 6 weken mogelijk wordt.

Sinds het eerste rapport over het gebruik van CRISPR voor genoombewerking ¹¹ , heeft dit bacteriële adaptieve immuunsysteem ZFN en TALEN vervangen door zijn vele voordelen, waaronder het gemak van de synthese en het vermogen om meerdere loci tegelijk te richten (aangeduid als "multiplexing "). CRISPR werd voor het eerst gebruikt voor gen targeting in muizen ¹² en is sindsdien toegepast op ontelbare soorten, van planten tot mensen ^{13 , 14} . Tot op heden is er geen rapport van een enkele soort resistent tegen CRISPR genoom bewerking.

De twee hoofdbeperkende stappen van de generatie transgene muizen zijn de injectie van oocyten en de reimplantatieVan deze oocyten in pseudo-zwangere vrouwtjes. Hoewel deze techniek is beschreven door ons ¹⁵ en anderen ¹⁶ , hebben de recente technische verbeteringen in de muisembryologie en genoverdrachtstechnieken het proces om genetisch gemodificeerde muizen te generen, omgezet. Deze verbeteringen zullen hierin beschreven worden.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de University of New South Wales Animal Care and Ethics Committee.

1. Bereiding van het transgeen (willekeurige integratie)

1. Analytische agarosegel-elektroforese.
   1. Digest het plasmide om het transgen te accentueren door gebruik te maken van geschikte enzymen (1 u incubatie) of snel verteerbare enzymen (15 tot 30 min incubatie) in een thermocycler volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie figuur 2A en zijn legende).
   2. Giet een 1% tris-acetaat-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TEA) agarosegel, gekleurd met 0,5-1,0 μg / ml ethidiumbromide (EtBr).
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het gebruik van EtBr; Het is een krachtige mutage. Gebruik geschikte persoonlijke beschermende uitrusting (raadpleeg het veiligheidsinformatieblad).
   3. Laad een 1 kb molecuulgewicht aan.
   4. Laad de gelineariseerde fragmenten ( dwz transgen en ruggengraat).
   5. Doe de elektroforese bij 100 V gedurende 45 minuten.
   6. Visualiseer de gel op een ultraviolette (UV) transilluminator om te controleren of de spijsvertering volledig is en om de juiste grootte van het transgen te bevestigen ( dwz 7.333 bp, zie figuur 2A ).
2. Preparatieve agarosegel-elektroforese.
   1. Giet een 1% TAE-agarosegel, gekleurd met een laag-toxiciteitsgelvlek. Laad 8 porties (1 μg elk) gelineariseerd transgeen zonder een molecuulgewichtmarkering en voer de elektroforese bij 100 V gedurende 45 minuten. Gebruik een scalpel om alle 8 bands die overeenkomen met het gelineariseerde transgen, te accijnzen.
   2. Extract het DNA met behulp van een gel extractie kit door de aanbevelingen van de fabrikant te volgen (zie de tabel van materialen ).
      1. Smelt de gelfragmenten gedurende minstens 15 minuten bij 50 ° C in 1,5 ml buizen. Precipiteer het met isopropanol en voeg vervolgens de bindingsbuffer toe.
      2. Combineer de hele DNA door het allemaal in één kolom te pipetteren. Uitsluiten in nuclease-vrije microinjectiebuffer (8 mM Tris-HCl en 0,15 mM EDTA). Filter door een 0,22 μm microcentrifugefilter en centrifuge gedurende 60 s bij 12.000 x g.
   3. Meet de concentratie en de kwaliteit van het DNA met behulp van een spectrofotometer. Controleer of de A260 / A280-verhouding ongeveer 1,8 bedraagt ​​( dat wil zeggen geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen). Verdun tot 3 ng / μL in nuclease-vrije microinjectiebuffer, aliquot (20-50 μl) en vries bij -20 ° C.

2. Synthese van CRISPR Components (Gene Targeting)

1. Cas9 mRNA.
   1. Verdun het Cas9 mRNA (verkregen uit een commerciële bron, zie de Tabel van Materialen ) tot een concentratie van 1 μg / μL in nuclease-vrije microinjectiebuffer.
   2. Aliquot in 2 μL en gratis Ze bij -80 ° C.
2. Single-guide RNA (SgRNA).
   1. Identificeer de gewenste twee-target genomische sequenties (gidsen) met behulp van een computergebruikswerktuig waardoor minimaal potentiële off-target-activiteit ^{17 mogelijk is} .
      1. Voor genknock-out selecteer systematisch twee gidsen die een paar honderd base-pairs (bp) bevinden, in tegengestelde richtingen, en omvat het startcodon van het gen van belang. Voor homologie directe reparatie, selecteer twee overlappende gidsen (indien mogelijk), in tegengestelde richtingen.
         OPMERKING: Bijvoorbeeld, de volgende handleidingen zijn recentelijk succesvol gecojecteerd om de eerste exon van het TPM4.2 gen te verstoren :
         Gids 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
         Gids 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
   2. Bestel een reeks primers zoals beschreven in Tabel 1 .
   3. Synthese een lineaire DNA-sjabloon.
      1. Verdun px330Ref "> 12 plasmide tot 10 ng / μl in nuclease-vrij water.
      2. Bereid de master mix zoals aangegeven in Tabel 1 . Voeg het polymerase aan het einde toe en hou de meermix op ijs.
      3. Meng en verdeel dit in 8 PCR buizen (19 μL / buis). Voeg 1 μL px330 per buis toe en voer de PCR onder de volgende omstandigheden: 1 min bij 98 ° C; 40 cycli van 98 ° C gedurende 10 s, 64 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 15 s; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Houd bij 4 ° C.
      4. Reinig de PCR-producten met een PCR-zuiveringsset (zie de Tabel van Materialen ), een verdeelstuk en een vacuümbron (voor snellere verwerking). Breng de maximale vacuümsterkte ( dwz 8 mbar) aan.
         1. Voeg 5 volumes (100 μl) bindingsbuffer toe aan 1 volume van het PCR-monster en meng.
         2. Plaats een (voorziene) siliciumdioxide membraan spin kolom in een (voorziene) 2 ml collectibuis voor centrifugering, of op de manifold voor vacuümprocesing. Om DNA te binden, past alle 8 monsters achtereenvolgens toe op de kolom en vacuüm of centrifugeer gedurende 60 s bij 12.000 xg voor elke lading.
         3. Om te wassen, voeg 0,75 ml wasbuffer (buffer PE) toe aan de kolom en vacuüm of centrifuge gedurende 60 s bij 12.000 x g. Centrifugeer de kolom gedurende 60 s bij 12.000 xg om resterende ethanol te elimineren.
         4. Plaats de kolom in een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Om het DNA te elueren, voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan het midden van het membraan, laat de kolom gedurende 1 minuut staan ​​en centrifugeer gedurende 60 s bij 12.000 g.
      5. Meet de concentratie met behulp van een spectrofotometer; Typisch zou de concentratie 100 ng / μl of hoger moeten zijn. Controleer of de A260 / A280-verhouding ongeveer 1,8 bedraagt ​​( dat wil zeggen geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen).
   4. In vitro transcriptie met behulp van een T7 RNA synthese kit.
      1. Bereid tHij mengt, zoals aangegeven in tabel 1 , en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C in een thermocycler. Voeg 28 μL nuclease-vrij water en 2 μl DNase I toe en incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij 37 ° C in een thermocycler.
   5. RNA zuivering met behulp van spin kolommen.
      1. Los de poeder in de voorziene spinkolom op in 650 μL nuclease-vrije microinjectiebuffer. Verwijder alle luchtbellen zorgvuldig. Pak de buis en hydrateren gedurende 5 - 15 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Verwijder de blauwe dop onderaan en plaats de kolom in een 2 ml buis. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 750 xg en kamertemperatuur. Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml buis en plaats druppelsgewijs 50 μL van de RNA-oplossing, zonder de kolomwand aan te raken. Spoel de kolom gedurende 2 minuten bij 750 x g.
      3. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (de typische opbrengst van een reactie is 30-50 μg). Controleer of de A260 / A280-verhouding een a isRond 2,0 ( dus geen contaminatie door eiwitten) en de A260 / A230 verhouding is ten minste 2,0 ( dus geen verontreiniging door organische oplosmiddelen). Bewaar de sgRNA's bij -80 ° C tot gebruik.
      4. Bepaal de kwaliteit van het RNA met behulp van de 1% TAE gels die routinematig gebruikt worden voor DNA elektroforese. Run 200-400 ng van het DNA sjabloon en het bijbehorende sgRNA parallel. De RNA-band (≈ 100 bp) moet iets groter zijn dan de DNA-band (zie Figuur 3A ).

3. Donor Template

1. Commercieel gesynthetiseerde enkelstrengige oligonucleotiden (ssOligos, zie de Tabel van Materialen ) voor puntmutaties bestellen of voor de integratie van kleine sequenties tot 50 bp; Homologie armen zijn typisch 60-90 bp lang.
2. Voor grotere invoegingen gebruik een donorplasmide als een sjabloon. Genereer een geschikt plasmide met behulp van de klassieke kloneringsmethode of de novo synthese uit aCommerciële bron.
   OPMERKING: Minimaal 800 bp per homologie arm wordt aanbevolen. De grootte van de ruggengraat heeft geen invloed op de efficiëntie van homology direct repair (HDR).

4. Spuitmengsel

1. Verdun het Cas9 mRNA tot 50 ng / μL en de sgRNA's tot 12,5 ng / μl (25 ng / μl in totaal) onder gebruikmaking van nuclease-vrije microinjectiebuffer voor gen-knock-out experimenten. Voeg de donorsjabloon (ssOligo of plasmide) toe bij een concentratie van 200 ng / μL voor experimenten met genoomredigering op basis van homologie directe reparatie.
   OPMERKING: Verdunningsvolumes kunnen gemakkelijk worden bepaald met behulp van online gereedschappen, zoals een resuspensieregelaar ¹⁸ .
2. Houd elke portie op ijs tijdens de microinjectiesessie en wis daarna af (doe de injectiemengsel niet opnieuw bevriezen).

5. Scrotale Vasectomie

OPMERKING: Twee soorten vasectomie worden vaak uitgevoerd in muizen: buik- en scrotale buikspieren. Het laatsteIs minder invasieve en is eerder beschreven ¹⁵ .

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten in roestvrij staal.
2. Bepaal het gewicht van de muis met behulp van een weegschaal en verdov de mannen door intraperitoneale (ip) injectie met injecteerbare verdoving (ketamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
3. Controleer het verlies van de klinkreflex van de teen en als de muis zacht is, plaats het op de bovenkant van een verwarmingsblok.
4. Desinfecteer de huid rond de testes met afwisselende doekjes van een actueel antiseptisch middel zoals chlorhexidine en 70% ethanol.
5. Duw de testes in de scrotal sac en maak een huid incisie met een scalpel.
6. Visualiseer de testis, cauda epididymis en vas deferens.
7. Grijp de vaatdeferens met pincet, houd deze vast en scherp aan elke kant van de tang om 3 mm van de vaatdeferens te verwijderen.
8. Voer dezelfde procedure uit op de tweede testis.
9. Sluit de huidinsnijdingen met wondklemmen en controleer deMuis nauwgezet tot volledig herstel.

6. Superovulatie (Oocytes Donors) en Time-paring (Pseudo-zwangere Vrouwen)

OPMERKING: De techniek om een ​​geschikt aantal bevruchte oocyten te genereren en geploegde pleegvrouwen voor reimplantatie te hebben is elders ¹⁵ beschreven.

1. Spuit 10 vrouwelijke ip met 5 IE van de zwangere merens serumgonadotropine (PMSG, in 100 μl) omstreeks 12 uur op dag 1.
2. Spuit de vrouwelijke ip met 5 IE van menselijke chorionische gonadotropine (hCG in 100 μl) 46-48 uur later (omstreeks 11 uur op dag 3).
3. Zet de vrouwtjes onmiddellijk met eengezins mannen overnacht.

7. Pronucleaire (willekeurige integratie) en cytoplasmatische (Gene-targeting) injecties

1. Vang de superovultaire muizen door cervicale ontwrichting, ontbloot de buik en toegang tot de eierstokken en oviducten, zoals eerder beschreven ¹⁵ . Dissect de oVellen en oogsten van de cumulus-oocyt-complexen (COC's) onder een stereomicorscoop ¹⁵ . Plaats ze in een druppel kalium simplex optimalisatie medium aangevuld met aminozuren (KSOMaa) volgens de traditionele methode ¹⁵ .
2. Reinig de oocyten door ongeveer 1 μl hyaluronidase (10 mg / ml) toe te voegen aan de druppel KSOMaa-medium met behulp van een aspirator mondstuk en plaats de schotel in een 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende 30 s tot 1 min.
3. Was de oocyten met 4 verse druppels KSOMaa-medium door het mondstuk van de aspirator te gebruiken en over te brengen naar een laatste druppel KSOMaa-medium dat overgaat met minerale olie (ongeveer 2 ml). Plaats de schotel in de 37 ° C / 5% CO ₂ incubator totdat de oocyten klaar zijn voor injectie.
4. Pronucleaire injectie (willekeurige integratie).
   1. Visualiseer de eieren onder de stereoscopische microscoop en overzetten ongeveer 50 eieren naar de injectiekamer (a droP van M2 medium bedekt met minerale olie) met behulp van het aspirator mondstuk.
   2. Breng de injectiekamer over naar de omgekeerde microscoop en injecteer de bevruchte oocyten (twee zichtbare pronuclei) met een paar picoliters van de injectiemix, gericht op een pronucleus (elk van de pronuclei kan worden gericht). Visualiseer een succesvolle injectie door de zwelling van de pronucleus in acht te nemen.
5. Cytoplasmische injectie (gen targeting).
   1. Zet ongeveer 50 eieren over op een druppel KSOMaa die 5 μg / ml Cytochalasin B bevat met behulp van het mondstuk en incubeer gedurende 5 minuten in de 37 ° C / 5% CO ₂ -cubator.
   2. Breng de eieren naar de injectiekamer met behulp van het mondstuk.
   3. Spuit enkele picoliters van de injectiemengsel in de cytoplasma bij zeer lage druk (50-100 hPa), met behulp van de compensatiedruk van de geautomatiseerde microinjector waar mogelijk.
   4. Vervolgens na injectie de oocyten terug in een druppel KSOMaa (met behulp van het mondstuk) en houd ze in de 37 ° C / 5% CO ₂ incubator, totdat deze geladen is voor reimplantatie in het oviduct van pseudo-zwangere vrouwtjes.

8. Reimplantatie

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten in roestvrij staal.
2. Bepaal het gewicht van de muis met behulp van de weegschaal en verdov de vrouwen door intraperitoneale (ip) injectie met injecteerbare verdoving (ketamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
3. Controleer het verlies van de klinkreflex van de teen en als de muis zacht is, plaats het op de bovenkant van een verwarmingsblok.
4. Knip een groot gedeelte van de vacht om de dorsale middenlijn van de vrouwelijke muis.
5. Desinfecteer de blootgestelde huid met wisselende doekjes van een actueel antiseptisch middel zoals chlorhexidine en 70% ethanol.
6. Ontdek het voortplantingsstelsel volgens traditionele methode ¹⁵ . Maak een 1 cm lange huidinsnijding evenwijdig aan de dorsale middenlijn, snij de spier en pak de vetkussen wiDoe een tang en trek de ovary voorzichtig uit totdat de bevestigde ovulaat en de baarmoeder duidelijk zichtbaar zijn.
7. Bevestig het vetpaneel met een schroefklem. Visualiseer het oviduct onder de stereoscopische microscoop en maak gebruik van een paar microsensjes een snede in de wand van het oviduct enkele millimeter stroomopwaarts van de ampulla.
8. Onder de stereoscopische microscoop laadt u 25 microinjecteerde eieren in de glazen capillaire die verbonden is met het mondstuk (de inwendige diameter van de capillaire moet ongeveer 120 μm breed zijn). Introduceer de glazen capillaire in het oviduct en verdrijf totdat een luchtbelletje in de ampulla zichtbaar is.
9. Verwijder de glazen capillaire voorzichtig en plaats het voortplantingsstelsel terug in de buik. Soteer de incisie met 3-0 niet-absorbeerbare chirurgische hechtingen, sluit dan met wondklemmen. Monitor de muis nauwlettend tot volledig herstel.

9. Genotyping Strategies / Sequencing

OPMERKING: Isoleer de genomicDNA uit 2 mm staart of oorbiopsies, in overeenstemming met de relevante dieretische regelgeving.

1. Snelle genomische DNA-extractie (willekeurige integratie).
   1. Licht de weefselmonsters (~ 2 mm) bij 95 ° C gedurende 1 uur in 100 μl alkalisch lysisreagens (25 mM natriumhydroxide en 0,2 mM EDTA, pH = 12).
   2. Voeg 100 μL neutraliserend reagens (40 mM Tris-HCl, pH = 5) toe.
   3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 g en 4 ° C.
2. Hoge kwaliteit genomische DNA-extractie (gen targeting).
   1. Voeg 500 μl staartbuffer (50 mM Tris, pH = 8; 100 mM EDTA, pH = 8; 100 mM NaCl; 1% SDS; 0,5 mg / ml protease K, vers toegevoegd).
   2. Incubeer overnacht bij 55 ° C.
   3. Meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex).
   4. Voeg 250 μL verzadigd NaCl (6 M) toe en meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex).
   5. Spin 5-10 minuten bij 12.000 xg en 4 ° C en giet het supernatant in een nieuwe buis.
   6. Voeg 500 μl isopropanol toe en meng gedurende 5 minuten door inverteren (niet vortex).
   7. Spin gedurende 10 minuten bij 12.000 xg en kamertemperatuur.
   8. Dek de supernatant (de pellet is onzichtbaar en stokt aan de buis).
   9. Was met 1 ml 70% ethanol.
   10. Spin 5-10 minuten bij 12.000 xg en kamertemperatuur. Verwijder de supernatant met zorg, want de witte pellet is niet meer kleverig en kan verloren gaan.
   11. De lucht droog dit voor ~ 1 uur.
   12. Voeg 400 μl TE-buffer (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH = 8) toe.
   13. Los het DNA op 55-60 ° C gedurende 2 uur op.
3. Primer ontwerp.
   1. Ontwerp primers minimaal 20 bp lang met behulp van een computergereedschap ¹⁹ .
      OPMERKING: Voor willekeurige integratie moeten de primers hybridiseren met het transgeen, waardoor een duidelijk fragment van 200-800 bp wordt genereerd. Voor gen targeting, ontwerp de primers, zodat ze hybridiseren met het genomische DNA, waardoor een aparte f wordt genereerdStel een paar honderd bp om de snijplaatsen. Voor grote inserties kunnen de primers op het transgen zitten, maar bevestiging van de gerichte integratie moet vervolgens worden uitgevoerd met behulp van primerwandeling of een soortgelijke techniek.
4. PCR genotypering.
   1. Voor elke genomische modificatie, ontwerp een nieuw PCR protocol en test het empirisch. Overweeg de lengte van het gegenereerde fragment en de smeltemperatuur (Tm) van elk paar primers.
5. Sequencing.
   1. Voor gen targeting, stuur PCR producten naar een Sanger sequencing service provider.

Results

Hieronder worden de werkstromen voor microinjectie in het geval van willekeurige integratie en CRISPR-gemedieerde gen targeting beschreven ( Figuur 1 ).

Figuur 1: Typische werkstroom voor de generatie van genetisch gemodificeerde muizen. Voor willekeurige integratie wordt het gezuiverde trans...

Discussion

Kritieke stappen binnen het protocol

De opkomst van genetisch gemodificeerde muizen is technisch uitdagend. Het hier gepresenteerde protocol is echter een geoptimaliseerde en vereenvoudigde methode waarmee men de techniek in recordtijd kan beheersen en oplossen. Er zijn twee stappen nodig om de techniek succesvol af te ronden. Ten eerste kan de synthese van lineaire DNA templates (voor de synthese van sgRNAs) worden bereikt zonder magnesiumchloride (MgCl2). Het wordt echter sterk aanbevolen om ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette 0.1-2.5 μL	Eppendorf	4920000016
Micropipette 2 - 20 μL	Eppendorf	4920000040
Micropipette 20 - 200 μL	Eppendorf	4920000067
Micropipette 100 - 1.000 μL	Eppendorf	4920000083
Molecuulgewichtsmarker	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Molecuulgewichtsmarker	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - Verdunnen tot 1x
Ethidiumbromide	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gelkleuring	Invitrogen	S33102
Gel extractie kit	Qiagen	28706
PCR zuiveringskit (Qiaquick)	Qiagen	28106
Vacuumsysteem (Manifold)	Promega	A7231
Nuclease-vrije micro-injectiebuffer	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifugefilter	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR-expresserend plasmide (px330)	Addgene	42230
Nuclease-vrij water	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion polymerase	New England Biolabs	M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit	New England Biolabs	E2050S
RNA zuiveringsspinkolommen (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Donorplasmide	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa embryocultuurmedium	Zenith Biotech	ZEKS-100
Mineralolie	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalasine B	Sigma-Aldrich	C6762
Mondstuk	Sigma-Aldrich	A5177
Glas microcapillairen	Sutter Instrument	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 pincet	Fine Science Tools	91150-20
Irisschaar	Fine Science Tools	91460-11
Vesselaar	Fine Science Tools	18374-43
Wondclips	Fine Science Tools	12040-01
Clipsapplicatie	Fine Science Tools	12018-12
Microschaar	Fine Science Tools	15000-03
Cauterisator	Fine Science Tools	18000-00
Niet-absorbeerbare chirurgische hechtdraden (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 incubator	MG Scientific	Galaxy 14S
Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Elektroforese instelling	BioRad	1640300
UV Transilluminator	BioRad	1708110EDU
Thermocycler	Eppendorf	6334000069
Stereoscopische microscoop	Olympus	SZX7
Omgekeerde microscoop	Olympus	IX71
2x Micromanipulatoren	Eppendorf	5188000.012
Oöcyten manipulator	Eppendorf	5176000.025
Microinjector (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Muizen C57BL/6J-stam	Australian BioResources	C57BL/6JAusb