Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Samenvatting

Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.

Samenvatting

Cell-cel interacties spelen een cruciale rol bij het behoud van de weefselintegriteit en de barrière tussen de verschillende compartimenten van de borstklier. Deze interacties worden geleverd door junctionele eiwitten die nexussen vormen tussen aangrenzende cellen. Junctionele eiwit mislokalisatie en verminderde fysieke associaties met hun bindende partners kunnen resulteren in verlies van functie en bijgevolg tot orgaansdisfunctie. Zo is het identificeren van eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties (PPI's) in normale en ziekteverwante weefsels essentieel om nieuwe bewijzen en mechanismen te vinden die leiden tot de voortgang van ziekten of veranderingen in ontwikkelingsstatus. Dit manuscript presenteert een tweetraps methode om PPI's in muizenkliere te beoordelen. In protocol sectie 1 wordt een werkwijze beschreven voor het uitvoeren van co-immunofluorescentie (co-IF) onder gebruikmaking van antilichamen die worden opgewekt tegen de eiwitten van belang, gevolgd door secundaire antilichamen die met fluorochromen gemerkt zijn. Hoewel co-IF allemaalOws voor de demonstratie van de nabijheid van de eiwitten, het maakt het mogelijk om hun fysieke interacties te bestuderen. Daarom wordt een gedetailleerd protocol voor co-immunoprecipitatie (co-IP) gegeven in protocol sectie 2. Deze methode wordt gebruikt om de fysieke interacties tussen eiwitten te bepalen, zonder te bevestigen of deze interacties direct of indirect zijn. In de laatste jaren hebben co-IF en co-IP technieken aangetoond dat bepaalde componenten van intercellulaire kruispunten co-lokaliseren en samenwerken, waardoor stadiumafhankelijke kruispunten ontstaan ​​die variëren tijdens de ontwikkeling van de borstkanker.

Inleiding

De groei en ontwikkeling van de mammierklier komt voornamelijk na de geboorte voor. Dit orgaan remodelleert zich voortdurend door het voortplantingsleven van een zoogdier ¹ . Het volwassen embryonale epitheel bestaat uit een binnenlaag van luminale epitheelcellen en een buitenste laag basale cellen, voornamelijk samengesteld uit myoepitheliale cellen, omringd door een keldermembraan ² . Voor een goede beoordeling over de structuur en ontwikkeling van de borstklier kan de lezer naar Sternlicht ¹ verwijzen. Cell-cel interacties via gap (GJ), strak (TJ) en adheren (AJ) kruispunten zijn nodig voor de....

Protocol

Alle dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het College Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identificatie van proteïne co-lokalisatie

1. Van weefsel tot microscopische dia's
   OPMERKING: Weefsels en afdelingen moeten op droogijs worden behandeld.
   1. Accijns de borstkieren van een dier (voor een volledige beschrijving van deze procedure, verwijzen naar Plante et al. ) ¹⁴ .
   2. Bevestig het uitgesneden weefsel in het bevriezen / montage medium op droogijs. Voeg voldoende medium toe om de kl....

Resultaten

Om te bepalen of GJ, AJ en TJ componenten samen kunnen werken in de borstklier, werden co-IF assays eerst uitgevoerd. Cx26, een GJ-eiwit, en β-Catenin, een AJ-eiwit, werden met specifieke antilichamen getest en geopenbaard met behulp van respectievelijk fluorofore-geconjugeerde respectievelijke (respectievelijk Figuur 1B en C ) geverfde muis 647 (groen, pseudocolor) en geiten-568 (rood) . De gegevens toonden aan dat zij co-lokaliseren bij het celmembraan.......

Discussie

Cell-cel interacties via kruispunten zijn nodig voor de juiste functie en ontwikkeling van veel organen, zoals de borstklier. Studies hebben aangetoond dat junctionele eiwitten de functie en stabiliteit van elkaar kunnen regelen en signaaltransductie activeren door elkaar te binden aan het celmembraan ¹⁰ . De protocollen die in het huidige manuscript zijn gepresenteerd, hebben interessante bevindingen geleverd over de interactie tussen de eiwitverschillen, lokalisatie en interactie tijdens de nor.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mice strain and stage	St. Constant, Quebec, Canada		C57BL/6 Vrouwtjes; zwangerschapsdag 18 (P18) en lactatiedag 14 (L14), Charles River Canada
PBS 10x (stock)			1) Los 80 g NaCl (F.W.: 58,44), 2 g KCl (F.W. 74,55), 26,8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268,07) en 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136,09) in 800 mL gedestilleerd water op; 2) Pas de pH aan op 7,4; 3) Voeg water toe om het eindvolume van 1 L te bereiken.
TBS 10x (stock)			1) Los 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl op in 800 mL gedestilleerd water; 2) Pas de pH aan op 7,5; 3) Voeg water toe om het eindvolume van 1 L te bereiken.
Deel 1: Immunofluorescentie
Bevriezingsmedia	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	VMR frozen sections compound
Microtoom	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada	BLM1001C	High profile gold coated blades
Pap pen	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopische glijmiddelen	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Formaldehyde
Bovine Serum Albumine (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blokkingsoplossing			3% BSA in TBS
Wasoplossing			TBS-Tween 20 0,1%
Polysorbaat 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Montagemedia	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
Eerste & secundaire antilichamen	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) met anti-muis IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling
Eerste & secundaire antilichamen	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) met anti-konijn IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)
Eerste & secundaire antilichamen	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada	Zie opmerkingen	β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) met anti-geit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
Eerste & secundaire antilichamen	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) met anti-muis IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
Kleurstof voor nucleïnezuren	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1.000 in PBS
Fluorescentiemicroscoop	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		Nikon A1R+ confocal microscopische laser uitgerust met een spectrale detector
Software voor IF-beeldanalyse	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		NIS-elements software (versie 4)
Deel 2: Immunoprecipitatie
Triple-detergent lysisbuffer (100 mL) pH=8,0			1) Meng 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150 mM NaCl (F.W.: 58,44), 0,02% Natriumazide, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% Natriumdeoxycholaat in 80 mL gedestilleerd H2O. 2) Pas de pH aan op 8,0 met HCl 6 N (~0,5 mL). 3) Pas het volume aan tot 100 mL. Bewaar in de koelkast. Op de dag van de eiwitextractie, gebruik 1/100 NaVo3, 1/100 protease/fosfatase-remmer en 1/25 NAF in de berekende hoeveelheid Triple detergent lysisbuffer: Natriumfluoride (stock) oplossing 1,25 M (F.W.: 41,98), Natriumorthovanadate (stock) oplossing 1 M (F.W.: 183,9)
Protease/fosfatase-remmer	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-vrij (100x)
Eiwitdosering	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Pierce BCA-eiwitdoseringskit
Weefselmolen	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Magneetkralen en standaard	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wasoplossing voor IP			PBS of PBS-Tween20 0,1% afhankelijk van de stap
Primaire antilichamen voor immunoprecipitatie	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	IgG Konijn (konijn (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling)