Analyse van eiwit-eiwitinteracties en co-lokalisatie tussen componenten van kloof-, strakke- en adherentie-knooppunten in muizenmammarysklieren

Summary

Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.

Abstract

Cell-cel interacties spelen een cruciale rol bij het behoud van de weefselintegriteit en de barrière tussen de verschillende compartimenten van de borstklier. Deze interacties worden geleverd door junctionele eiwitten die nexussen vormen tussen aangrenzende cellen. Junctionele eiwit mislokalisatie en verminderde fysieke associaties met hun bindende partners kunnen resulteren in verlies van functie en bijgevolg tot orgaansdisfunctie. Zo is het identificeren van eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties (PPI's) in normale en ziekteverwante weefsels essentieel om nieuwe bewijzen en mechanismen te vinden die leiden tot de voortgang van ziekten of veranderingen in ontwikkelingsstatus. Dit manuscript presenteert een tweetraps methode om PPI's in muizenkliere te beoordelen. In protocol sectie 1 wordt een werkwijze beschreven voor het uitvoeren van co-immunofluorescentie (co-IF) onder gebruikmaking van antilichamen die worden opgewekt tegen de eiwitten van belang, gevolgd door secundaire antilichamen die met fluorochromen gemerkt zijn. Hoewel co-IF allemaalOws voor de demonstratie van de nabijheid van de eiwitten, het maakt het mogelijk om hun fysieke interacties te bestuderen. Daarom wordt een gedetailleerd protocol voor co-immunoprecipitatie (co-IP) gegeven in protocol sectie 2. Deze methode wordt gebruikt om de fysieke interacties tussen eiwitten te bepalen, zonder te bevestigen of deze interacties direct of indirect zijn. In de laatste jaren hebben co-IF en co-IP technieken aangetoond dat bepaalde componenten van intercellulaire kruispunten co-lokaliseren en samenwerken, waardoor stadiumafhankelijke kruispunten ontstaan ​​die variëren tijdens de ontwikkeling van de borstkanker.

Introduction

De groei en ontwikkeling van de mammierklier komt voornamelijk na de geboorte voor. Dit orgaan remodelleert zich voortdurend door het voortplantingsleven van een zoogdier ¹ . Het volwassen embryonale epitheel bestaat uit een binnenlaag van luminale epitheelcellen en een buitenste laag basale cellen, voornamelijk samengesteld uit myoepitheliale cellen, omringd door een keldermembraan ² . Voor een goede beoordeling over de structuur en ontwikkeling van de borstklier kan de lezer naar Sternlicht ¹ verwijzen. Cell-cel interacties via gap (GJ), strak (TJ) en adheren (AJ) kruispunten zijn nodig voor de normale ontwikkeling en functie van de klier ^{1 , 3 , 4 , 5 , 6} . De belangrijkste componenten van deze kruispunten in de muizenkliniek zijn Cx26, Cx30, Cx32 en Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 en -7 enZO-1 (TJ); En E-cadherine, P-cadherine, en β-catenin (AJ) ^{7 , 8} . De expressieniveaus van deze verschillende junctionele eiwitten variëren op een stadiumafhankelijke wijze tijdens de ontwikkeling van de borstkanker, wat de differentiële cel-celinteractievereisten voorstelt ⁹ . GJ, TJ en AJ zijn structureel en functioneel gekoppeld aan andere structurele of regulerende eiwitten aan de naburige plaatsen van aangrenzende cellen, waardoor een knooppunt ^{10 wordt} gecreëerd. De samenstelling van de verbindingsneus kan invloed hebben op de overbruggen van het onderliggende cytoskelet, evenals de doorlaatbaarheid en de stabiliteit van de nexus, en kan derhalve de functie van de klier ^{8 , 9 , 10 , 11} beïnvloeden. De componenten van intercellulaire knooppunten die zich in knooppunten bevinden, of met elkaar in wisselwerking met elkaarGeurende ontwikkelingsfasen van de ontwikkeling van de borstklier werden onlangs geanalyseerd met behulp van co-immunofluorescentie (co-IF) en co-immunoprecipitatie (co-IP) ⁹ . Terwijl andere technieken de evaluatie van de functionele associatie tussen eiwitten mogelijk maken, worden deze methoden niet in dit manuscript gepresenteerd.

Aangezien eiwitten alleen maar alleen functioneren om te functioneren, is het belangrijk om veel onderzoekers te onderzoeken eiwit-eiwit interacties (PPI's), zoals signaaltransducties en biochemische cascades, en kunnen belangrijke informatie over de functie van eiwitten leveren. Co-IF en microscopische analyse helpen bij het evalueren van een paar eiwitten die dezelfde subcellulaire ruimte delen. Het aantal doelen is echter beperkt door de antilichamen die in verschillende dieren moeten worden opgewekt en door de toegang tot een confocale microscoop uitgerust met verschillende golflengtelaser en een spectrale detector voor multiplexing. Co-IP bevestigt of onthult fysische interacties met hoge affiniteit betwEen twee of meer eiwitten die binnen een eiwitcomplex verblijven. Ondanks de ontwikkeling van nieuwe technieken, zoals fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) ¹² en proximity ligation assay (PLA) ¹³ , die gelijktijdig de lokalisatie en interacties van eiwitten kan detecteren, blijft co-IP een geschikte en betaalbare techniek om interacties tussen Endogene eiwitten.

De stap-voor-stap methode die in dit manuscript wordt beschreven, zal de studie van eiwitlokalisatie en PPI's vergemakkelijken en valkuilen verklaren om te vermijden bij het bestuderen van endogene PPI's in de borstklippen. De methodologie begint met de presentatie van de verschillende bewaringsprocedures voor de weefsels die nodig zijn voor elke techniek. In deel 1 wordt gepresenteerd hoe u co-lokalisatie van eiwitten in drie stappen kunt bestuderen: i) het segmenteren van mammekirtels, ii) de dubbele of drievoudige etikettering van verschillende eiwitten met behulp van de co-IF-techniek, en iii) het imago vanEiwit lokalisatie. Deel 2 laat zien hoe een endogeen eiwit neerslag wordt en zijn interactieproteïnen in drie stappen identificeren: i) lysatepreparatie, ii) indirecte eiwitimmunoprecipitatie, en iii) bindingspartneridentificatie door SDS-PAGE en Western blot. Elke stap van dit protocol is geoptimaliseerd voor knaagdierkankerweefsels en produceert hoogwaardige, specifieke en reproduceerbare resultaten. Dit protocol kan ook gebruikt worden als uitgangspunt voor PPI studies in andere weefsels of cellijnen.

Protocol

Alle dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het College Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identificatie van proteïne co-lokalisatie

1. Van weefsel tot microscopische dia's
   OPMERKING: Weefsels en afdelingen moeten op droogijs worden behandeld.
   1. Accijns de borstkieren van een dier (voor een volledige beschrijving van deze procedure, verwijzen naar Plante et al. ) ¹⁴ .
   2. Bevestig het uitgesneden weefsel in het bevriezen / montage medium op droogijs. Voeg voldoende medium toe om de klier te bedekken. Wanneer het medium is verstevigd, doe de weefsels over op een vriezer bij -80 ° C voor later gebruik ⁹ .
   3. Gebruik een cryomicrotoom ingesteld op ≤ -35 ​​° C, snijd de weefsels in 7-10 μm dikke delen en plaats ze op microscoopschuiven.
      OPMERKING: plaats indien mogelijk twee secties op elke dia; Het linker gedeelte wordt gebruikt als eenEgatieve controle om de specificiteit van de antilichamen en de autofluorescentie van het weefsel te verifiëren, terwijl de rechterkant wordt gemerkt met de antilichamen.
   4. Houd de secties bij -80 ° C voor later gebruik.
2. Co-IF kleuring
   1. Haal de juiste microscopische glijbanen uit de vriezer en stel de secties onmiddellijk vast door ze gedurende 15 minuten bij formaldehyde 4% te dompelen bij kamertemperatuur (RT).
   2. Dompel vervolgens de glijbanen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij RT. Verlaat de glijbanen in PBS bij RT totdat u verder gaat naar de volgende stap.
   3. Omcirkel elke sectie van de dia met behulp van een in de handel verkrijgbare hydrofobe barrière of een waterafstotende lab pen (zie de tabel van materialen ). Wees voorzichtig om het weefsel niet aan te raken. Voeg druppels PBS onmiddellijk aan het weefsel toe en plaats de glijbaan in een vochtige histologiekamer voor de rest van de procedure.
      OPMERKING: De weefselsecties moeten vochtig blijven. AlternatiefGebruik een doos met een deksel en plaats natte papieren handdoeken op de bodem.
   4. Blok elk weefsectie met 100-200 μL 3% runderserumalbumine (BSA) -Trisgebufferde zoutoplossing (TBS) -0,1% polysorbaat 20 (zie de Tabel van Materialen ) gedurende 30 minuten bij RT. Terwijl de monsters blokkeren, bereidt u de primaire en secundaire antilichaamoplossingen voor door de antilichamen te verdunnen in TBS-0,1% polysorbaat 20.
      OPMERKING: De vereiste concentratie voor het antilichaam wordt door de fabrikant verstrekt; Zie de tabel van materialen en figuren 1 en 2 voor voorbeelden, evenals Dianati et al. ⁹ . Hoewel het niet nodig is om in het donker te werken bij het gebruik van meeste fluorofore-geconjugeerde antilichamen, vermijd het blootstellen van de antilichaamoplossingen of gekleurde weefsels tot intens, helder licht.
   5. Verwijder de blokkerende oplossing door aspiratie en incubeer de secties in 100-200 μL van het verdunde primaire antilichaam gedurende 60 minuten bij RT. AlternativelY, incuberen met het primaire antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
   6. Verwijder de primaire antilichaamoplossing door aspiratie en wass de afdelingen met 250-500 μL TBS-0,1% polysorbaat 20 gedurende 5 minuten. Verwijder de wasoplossing door aspirasie en herhaal de was twee keer.
   7. Verwijder de wasoplossing door aspiratie en incubeer de secties met 100-200 μl van het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende 60 minuten bij RT.
   8. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing door aspiratie en was de secties gedurende 5 minuten met 250-500 μl TBS-0,1% polysorbaat 20 gewassen. Verwijder de wasoplossing en herhaal tweemaal.
   9. Herhaal stap 2.5-2.8 met behulp van de juiste combinatie van primaire en secundaire antilichamen voor de daaropvolgende eiwitten die van belang zijn.
   10. Verwijder de wasoplossing door aspiratie en voer de nucleuskleuring uit door het gedeelte 5 tot 5 minuten bij 100 tot 100 μl 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in TBS-0,1% polysorbaat 20 te incuberenRT.
   11. Verwijder de DAPI-oplossing door aspirasie en plaats de dia's met behulp van een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium (zie de Tafel van Materialen ) en deksels. Ga één dia tegelijk door.
       OPMERKING: Incuberen van de kernvlek gedurende meer dan 5 minuten verandert de intensiteit van de kleuring niet. Als alternatief, verwijder de DAPI oplossing op alle glijbanen en incubeer de weefsels in PBS tijdens het monteren van de glijbanen.
   12. Plaats de dia's plat in een koelkast van 4 ° C gedurende minstens 8 uur. Ga verder naar de fluorescentiemicroscopische beeldvorming (zie figuren 1 en 2 ).
3. Microscopische beeldvorming
   1. Visualiseer de fluorofore-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van een confocale microscoop uitgerust met de verschillende lasers die nodig zijn om de fluoroforen op hun specifieke golflengten op te wekken.
      Opmerking: Om kanalen en alveolen te visualiseren, wordt een 40X objectief met een numerieke diafragma van 0,95 voorgesteld. Een examplE van de specifieke instellingen wordt weergegeven in figuur 1 .
   2. Verifieer de lokalisatie van elk eiwit individueel door de afbeelding een golflengte op het moment te scannen.
      Opmerking: in dit stadium is het belangrijk om de lokalisatie van de junctionele eiwitten kritisch te analyseren. Om junctionele nexussen te kunnen vormen, moeten deze eiwitten gelokaliseerd worden bij het plasmamembraan.
   3. Bepaal de co-lokalisatie van eiwitten door het samenvoegen van de beelden die met de lasers zijn gescand bij de verschillende golflengten.
      Opmerking: Proteïne co-lokalisatie kan worden geconfronteerd door de kleurwijziging die voortvloeit uit de uitstoot van twee of meer fluoroforen op dezelfde locatie en kan worden gemeten met behulp van de passende software ( figuren 1 en 2 , zie ook referentie 9).

2. Het bestuderen van PPI's

OPMERKING: Abdominale borstklippen dienen te worden gebruikt om PPI's te bestuderen, aangezien borstklippen in nauwe band met de borsspieren. Accijns de borstklippen (voor een volledige beschrijving van deze procedure, zie Plante et al .) ¹⁴ en houd ze bij -80 ° C voor later gebruik.

1. Lysaatbereiding
   1. Plaats weegpapier en 2 ml microcentrifugebuizen op droogijs om ze vooraf te koelen voordat u verder gaat met de volgende stappen.
   2. Neem het weefselweefsel van -80 ° C en houd ze op droogijs.
   3. Weeg de weefsels op de voorgekoelde weegpapieren en laat het weefsel vervolgens overbrengen naar 2 ml microcentrifugebuizen (handvat op droogijs). Gebruik tussen 50 en 100 mg weefsel per monster. Bewaar het weefsel op droogijs tot stap 2.1.5.
   4. Bereid de benodigde hoeveelheid triple detergent lysisbuffer aangevuld met NaF, NaVO ₃ en protease / fosfataseremmers, zoals aangegeven in de Tabel van Materialen , met behulp van de volgende formules. Muizen: vereiste buffer (μL) = muisweefselgewicht (mg) x 3; Rat: vereistBuffer (μL) = weefselgewicht (mg) x 5
   5. Voeg de benodigde hoeveelheid ijskoude lysisbuffer (berekend in stap 2.1.4) toe aan de 2 ml buis die het weefsel bevat.
      OPMERKING: Ga in stap 2.1.5-2.1.6 door met één enkele buis tegelijk.
   6. Homogeniseer het weefsel gedurende 30-40 s met behulp van continue homogenisatie op een weefselmolen; Houd de buis altijd op ijs. Zet het weefselhomogenisator aan op middelmatige snelheid en beweeg de grinder voorzichtig naar boven en onder in de buis.
   7. Herhaal stappen 1.6 en 1.7 met de andere buizen.
   8. Incubeer de lysaten op ijs gedurende 10-30 minuten.
   9. Centrifugeer de buizen bij 170 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   10. Identificeer ondertussen 6-10 microcentrifugebuizen (0,6 ml) voor elk monster en houd ze op ijs.
   11. Zodra de centrifugering is gedaan, controleer de buizen. Zorg ervoor dat ze een bovenste laag vet, heldere, geel-naar-roze lysaten bevatten (afhankelijk van het ontwikkelingsstadium) en een pellet.
   12. Maak een gat in de lipidlaagMet behulp van een 200-liter pipetpunt om toegang te krijgen tot de vloeibare fase. Verander de tip en verzamel het lysaat zonder de pellet te storen of de lipidlaag te aspireren. Aliquot het lysaat in voorgemarkeerde buizen op ijs (stap 2.1.11) en houd ze op -80 ° C.
   13. Gebruik een aliquot om de eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een geschikte, commercieel verkrijgbare kit (zie de Tabel van Materialen ).
2. Indirecte immunoprecipitatie
   1. Op ijs ontdooien twee aliquots van de al eerder bereide mammary gland lysaten.
      OPMERKING: Er wordt één aliquot gebruikt voor het IP van het doel eiwit, terwijl de andere als negatieve controle zal dienen.
   2. Verzamel 500-1000 μg van het lysaat en verdun het in PBS om een ​​eindvolume van 200 μL in elke 1,5 ml buis te bereiken.
      OPMERKING: De hoeveelheid te gebruiken lysaat hangt af van de overvloed van het eiwit van belang en de efficiëntie van het antilichaam (zie Figuur 3 voor eenN voorbeeld , evenals de tabel van materialen ). Om te optimaliseren voor elk doel, dienen verschillende hoeveelheden lysaat ( dat wil zeggen 500, 750 en 1000 μg) en antilichaam ( dwz 5, 10 en 20 μg) te worden gebruikt. Ga verder met de volgende stappen (2.2.3-2.3.7.4).
   3. Voeg het antilichaam tegen het antigeen van belang toe aan de eerste buis lysaat en hou het op ijs.
      OPMERKING: De benodigde hoeveelheid wordt meestal voorgesteld op het instructieblad dat door elk bedrijf wordt verstrekt (zie de Tabel van Materialen ).
   4. Bereid in de tweede buis een negatieve controle op door dezelfde concentratie van isotype-IgG-controle toe te voegen als het antilichaam dat in stap 2.2.3 wordt gebruikt.
   5. Incubeer de buizen overnacht bij 4 ° C op een buisrolmenger bij lage snelheid.
   6. De volgende dag voeg 50 μL magnetische kralen toe aan nieuwe 1,5 ml buizen voor voorwas.
      1. Selecteer ofwel magnetische korrels van eiwit A of eiwit G, gebaseerd op de relatieve affiniteit voor het antilichaam.
      2. Het is belangrijk om te voorkomen dat geaggregeerde kralen worden gebruikt; Meng de kogelophanging voorzichtig totdat het gelijkmatig opnieuw wordt opgehangen voordat u deze aan de buizen toevoegt.
   7. Plaats de buizen die de kralen op de magnetische stand bevinden en laat de kralen migreren naar de magneet. Verwijder de opslagbuffer uit de kralen met een 200 μL pipet.
   8. Was de kralen door 500 μl PBS-0,1% polysorbaat 20 toe te voegen en de buizen krachtig te vortexen gedurende 10 s.
   9. Zet de buizen weer op de magnetische stand en laat de kralen migreren naar de magneet.
   10. Verwijder de overtollige wasbuffer door pipettering met een 200 μL pipet te verwijderen.
   11. Voeg het reactiecomplex (lysaat-antilichaam) van stap 2.2.5 toe aan de kralen en incubeer gedurende 90 minuten bij RT op de roller mixer.
   12. Plaats de buizen op de magnetische stand en laat de kralen migreren naar de magneet. Gebruik een 200 μL pipet, aspireer en doei het lysaat en gooi de buizen op ijs.
   13. Was de kraalS door 500 μL PBS toe te voegen, de buizen op de magnetische stand te plaatsen en de vloeistof te verwijderen met behulp van een 200 μL pipet. Herhaal deze wasstap. Vermijd vortexing tijdens de wasstappen en houd de monsters op ijs.
   14. Was de kralen eenmaal met PBS-0,1% polysorbaat 20 zonder vortexing en wis de laatste wasbuffer met behulp van een 200 μL pipettip.
   15. Om te elueren voeg 20 μL 0,2 M zuurglycine (pH = 2,5) toe aan de buizen en schud ze gedurende 7 minuten op de roller mixer.
   16. Centrifugeer gedurende een paar seconden bij hoge snelheid en snijd de supernatant in een frisse ijskoude buis.
   17. Herhaal de stappen 2.2.14 en 2.2.15 voor elke buis.
       OPMERKING: Het uiteindelijke volume bedraagt ​​40 μL.
   18. Voeg 10 μl 4x Laemmli buffer toe aan het 40 μl geëlueerde monster uit stap 2.2.16.
       OPMERKING: De kleur wordt geel door de zure pH.
   19. Voeg onmiddellijk 1 M Tris (pH = 8), 1 druppel per keer, toe aan het geëlueerde monster van stap 2.2.18 tot de kleur ervanWordt blauw. Ga door naar de volgende buizen.
   20. Kook de monsters van stap 2.2.18 bij 70-90 ° C gedurende 10 minuten. Ga onmiddellijk door naar gelelektroforese. Als alternatief, steek de monsters over op een vriezer bij -80 ° C tot het laden.
3. Aanwaartse toepassing: gelelektroforese gevolgd door Western blot
   1. Bereid het scheiden en stapelen van SDS-PAGE acrylamide gels (1,5 mm dikte) volgens standaardprocedures ¹⁵ .
      OPMERKING: De keuze van gel (8-15% acrylamide, gradiënt: zie de Tabel van Materialen ) moet worden bepaald op basis van de moleculaire grootte van het te precipiteren eiwit en van de mogelijke bindende partners die geanalyseerd moeten worden. Deze eiwitten moeten van elkaar worden opgelost om de juiste immunodetectie mogelijk te maken.
   2. Doe de immunoprecipitatie (IP) -geluide monsters (stap 2.2.20) op ijs.
   3. Bereid eiwitlysaten uit dezelfde monsters (gebruikt voor de bovenstaande IP-procedure). Gebruik 50Μg totaal lysaat en voeg 4X Laemmli monsterbuffer toe. Kook de monsters bij 70-90 ° C gedurende 5 minuten en plaats op ijs tot het laden.
      OPMERKING: Deze monsters worden naast het geëlueerde IP-monster geladen om de aanwezigheid van geprecipiteerde eiwitten in het totale lysaat aan te tonen.
   4. Laad de bereide lysaten van stap 2.3.3 en de geprecipiteerde monsters van stap 2.2.20 naast elkaar in een acrylamidegel en laat ze in lopende buffer lopen (10x loopbuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g glycine en 10 G SDS in 1 liter gedestilleerd water) bij 100 V gedurende ongeveer 95 minuten, of tot de rand van de migrerende eiwitten de bodem van de gel bereikt.
   5. Breng de gels over naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan met behulp van een standaardprotocol ^{9 , 15} .
   6. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur op een rocker bij lage snelheid in 5% droge melk-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl en 0,05% polysorbaat 20).
   7. Identificeer of het neerslag succesvol wascesvol.
      1. Probeer het membraan met behulp van het eerste antilichaam tegen het geprecipiteerde eiwit, verdund in 5% droogmelk-TTBS bij de door de fabrikant aanbevolen concentratie, overnacht bij 4 ° C op een schommelplatform met langzame roering.
         OPMERKING: Raadpleeg de Tabel van Materialen voor aanbevelingen.
      2. De volgende dag was de membraan 3 keer gedurende 5 minuten elk met TTBS op een schommelplatform met hoge agitatie.
      3. Incubeer het membraan in het geschikte secundaire antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP), verdund in TTBS, gedurende 1 uur bij RT op een schommelplatform met langzame roering.
         OPMERKING: Alternatief kan een secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorochroom gebruikt worden indien een geschikt apparaat voor het detecteren van het signaal beschikbaar is.
      4. Voer 3 tot 6 wassen, elk 5 minuten, met TTBS op een schommelplatform met hoge agitatie. Analyseer het signaal van het secundaire antilichaam door het membraan te incuberen met een commercieel aBeschikbare luminoloplossing (zie de Tabel van Materialen ) en volg de instructies van de fabrikant. Ontdek het signaal met behulp van een chemiluminescentie beeldvormingssysteem (zie de Tabel van Materialen ).
         OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol over Western blot analyse, zie Referentie 16.
   8. Om interactieproteïnen te identificeren, voer stappen 2.3.7.1-2.3.7.4 uit met behulp van de juiste antilichamen op dezelfde blote.
      OPMERKING: Als eiwitten elkaar interpreteren, zullen de bindingspartners co-immunoprecipiteerd worden met het doel eiwit en zullen derhalve door Western blotting detecteerbaar zijn. Stap 2.3.8 kan worden herhaald met meer antilichamen om te bepalen of andere eiwitten zich in hetzelfde eiwitcomplex bevinden, zolang de molecuulgewichten van de eiwitten voldoende verschillen om goed gescheiden te zijn op de gel en het membraan.
   9. Om te bevestigen dat de geïdentificeerde bindende partners geen artefacten zijn, moet wederkerig IP worden uitgevoerd.
      OPMERKING: dit wordt uitgevoerd door te herhalenStappen 2.2.1-2.2.20 met hetzelfde lysaat maar precipiteren van een van de bindingspartners geïdentificeerd in stap 3.8. Vervolgens worden stappen 3.1-3.8 herhaald met behulp van het primaire antilichaam tegen het eerste eiwit van belang.

Results

Om te bepalen of GJ, AJ en TJ componenten samen kunnen werken in de borstklier, werden co-IF assays eerst uitgevoerd. Cx26, een GJ-eiwit, en β-Catenin, een AJ-eiwit, werden met specifieke antilichamen getest en geopenbaard met behulp van respectievelijk fluorofore-geconjugeerde respectievelijke (respectievelijk Figuur 1B en C ) geverfde muis 647 (groen, pseudocolor) en geiten-568 (rood) . De gegevens toonden aan dat zij co-lokaliseren bij het celmembraan...

Discussion

Cell-cel interacties via kruispunten zijn nodig voor de juiste functie en ontwikkeling van veel organen, zoals de borstklier. Studies hebben aangetoond dat junctionele eiwitten de functie en stabiliteit van elkaar kunnen regelen en signaaltransductie activeren door elkaar te binden aan het celmembraan ¹⁰ . De protocollen die in het huidige manuscript zijn gepresenteerd, hebben interessante bevindingen geleverd over de interactie tussen de eiwitverschillen, lokalisatie en interactie tijdens de nor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strain and stage	St. Constant, Quebec, Canada		C57BL/6 Vrouwtjes; zwangerschapsdag 18 (P18) en lactatiedag 14 (L14), Charles River Canada
PBS 10x (stock)			1) Los 80 g NaCl (F.W.: 58,44), 2 g KCl (F.W. 74,55), 26,8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268,07) en 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136,09) in 800 mL gedestilleerd water op; 2) Pas de pH aan op 7,4; 3) Voeg water toe om het eindvolume van 1 L te bereiken.
TBS 10x (stock)			1) Los 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl op in 800 mL gedestilleerd water; 2) Pas de pH aan op 7,5; 3) Voeg water toe om het eindvolume van 1 L te bereiken.
Deel 1: Immunofluorescentie
Bevriezingsmedia	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	VMR frozen sections compound
Microtoom	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada	BLM1001C	High profile gold coated blades
Pap pen	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopische glijmiddelen	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Formaldehyde
Bovine Serum Albumine (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blokkingsoplossing			3% BSA in TBS
Wasoplossing			TBS-Tween 20 0,1%
Polysorbaat 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Montagemedia	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
Eerste & secundaire antilichamen	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) met anti-muis IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling
Eerste & secundaire antilichamen	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) met anti-konijn IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)
Eerste & secundaire antilichamen	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada	Zie opmerkingen	β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) met anti-geit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
Eerste & secundaire antilichamen	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) met anti-muis IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
Kleurstof voor nucleïnezuren	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1.000 in PBS
Fluorescentiemicroscoop	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		Nikon A1R+ confocal microscopische laser uitgerust met een spectrale detector
Software voor IF-beeldanalyse	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		NIS-elements software (versie 4)
Deel 2: Immunoprecipitatie
Triple-detergent lysisbuffer (100 mL) pH=8,0			1) Meng 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150 mM NaCl (F.W.: 58,44), 0,02% Natriumazide, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% Natriumdeoxycholaat in 80 mL gedestilleerd H2O. 2) Pas de pH aan op 8,0 met HCl 6 N (~0,5 mL). 3) Pas het volume aan tot 100 mL. Bewaar in de koelkast. Op de dag van de eiwitextractie, gebruik 1/100 NaVo3, 1/100 protease/fosfatase-remmer en 1/25 NAF in de berekende hoeveelheid Triple detergent lysisbuffer: Natriumfluoride (stock) oplossing 1,25 M (F.W.: 41,98), Natriumorthovanadate (stock) oplossing 1 M (F.W.: 183,9)
Protease/fosfatase-remmer	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-vrij (100x)
Eiwitdosering	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Pierce BCA-eiwitdoseringskit
Weefselmolen	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Magneetkralen en standaard	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wasoplossing voor IP			PBS of PBS-Tween20 0,1% afhankelijk van de stap
Primaire antilichamen voor immunoprecipitatie	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	Zie opmerkingen	IgG Konijn (konijn (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling)