Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Summary

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Abstract

De rol van lange noncoding RNAs (lncRNAs) bij kanker komt naar voren als gevolg van de groeiende interesse in het begrijpen van hun mechanistische functies tijdens de ontwikkeling van kanker en progressie. Desondanks is de globale epigenetische regulering van lncRNAs en repetitieve sequenties bij kanker niet goed onderzocht, vooral bij chronische lymfocytische leukemie (CLL). Deze studie richt zich op een unieke aanpak: de immunoprecipitatie-gebaseerde opname van dubbelstrengige, gemetileerde DNA-fragmenten met behulp van methyl-bindende domein (MBD) eiwitten, gevolgd door volgende generatie sequencing (MBD-seq). CLL patiëntenmonsters die behoren tot twee prognostische subgroepen (5 IGVH gemuteerde monsters + 5 IGVH niet gemuteerde monsters) werden in deze studie gebruikt. Analyse onthulde 5.800 hypermethylated en 12,570 hypomethylated CLL-specifieke differentieel gemethyleerde genen (cllDMGs) in vergelijking met normale gezonde controles. Het is belangrijk dat deze resultaten verschillende CLL-specifieke, differentieel gemethyleerde lncRNAs, opnieuw identificerenPetitieve elementen, en proteïne-coderende genen met potentiële prognostische waarde. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor een MBD-SEQ en bioinformatica pijpleiding die is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van globale methylatie profielen in zeer CpG rijke regio's met behulp van CLL patiëntenmonsters. Tenslotte werden een proteïne coderend gen en een lncRNA gevalideerd met behulp van pyrosequencing, welke een zeer kwantitatieve methode is om CpG methyleringsniveaus te analyseren om de bevindingen verder te bevestigen uit het MBD-seq protocol.

Introduction

Het gebruik van volgende generatie sequencing technieken om globale DNA-methylering profielen te analyseren is in de afgelopen jaren steeds populairder geworden. Genoom-brede methyleringsbepalingen, met inbegrip van microarray- en niet-microarray gebaseerde methoden, werden ontwikkeld op basis van het volgende: de bisulfietomzetting van genomisch DNA, methylatiegevoelige restrictie-enzymverdigingen en de immunoprecipitatie van gemethyleerd DNA onder gebruikmaking van methyl-CpG-specifieke antilichamen .

Aberrant DNA methylering is een van de kenmerken van leukemie en lymfomen, waaronder chronische lymfocytische leukemie (CLL). Vroeger heb....

Protocol

De ethische goedkeuring voor het verzamelen van de CLL-monsters is vanaf 2007-05-21, met het volgende registratienummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL patiënten werden gediagnosticeerd volgens recentelijk gewijzigde criteria ⁸ , en de monsters werden verzameld op het moment van diagnose. De patiënten in de studie werden opgenomen uit verschillende hematologieafdelingen in het westelijke deel van Zweden na schriftelijke toestemming. Alleen in deze studie werden alleen monsters van CLL perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) met een tumorpercentage leukemic cellen ≥70% geselecteerd.

1. Voorbereidingen

1. Iso....

Results

MBD-seq werd recentelijk uitgevoerd op CLL-patiënten en gecombineerde, normale, gezonde controles om CLL-specifieke differentieel hyper- en hypomethyleerde genen te identificeren ⁷ . De experimentele en bioinformatische pijpleiding die wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens die worden gegenereerd uit CLL en normale gezonde monsters, worden getoond in Figuur 1A en 1B . Deze analyses identificeerden verschil.......

Discussion

MBD-seq is een kosteneffectieve, immunoprecipitatie-gebaseerde techniek die gebruikt kan worden om methylatiepatronen te bestuderen met volledige genoombrede dekking. Zowel MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitatie gevolgd door sequencing) en MBD-seq resulteren in de verrijking van CpG-rich methylated DNA. MBD-SEQ toont echter meer affiniteit naar binding aan zeer CpG-rijke gebieden wanneer vergeleken met MeDIP SEQ ¹⁹ . Met behulp van een methylbindende verrijkingskit kan men het DNA fractione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy Blood and tissue kit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D	1114544
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor standard sonication device	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5 mL	Diagenode	C30010010-300
3 M Sodium acetate	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free water	Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5 mL tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake