Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Samenvatting

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Samenvatting

Wanneer hoge kwaliteit kristallen die diffract van x-stralen worden verkregen, kan de kristalstructuur op in de buurt van atomaire resolutie worden opgelost. De voorwaarden om te kristalliseren eiwitten, Ani, RNAs en hun complexen kunnen echter niet worden voorspeld. Dienst van een breed scala van voorwaarden is een manier om het verhogen van het rendement van kwaliteit diffractie kristallen. Twee volledig geautomatiseerde systemen ontwikkeld op het MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, Engeland, MRC-LMB) die kristallisatie screening tegen 1.920 uitgangsvoorwaarden vergemakkelijken door damp diffusie in nanoliter druppels. Semi-automatische protocollen zijn ook ontwikkeld om te optimaliseren van voorwaarden door het veranderen van de concentraties van de reagentia, de pH, of door de invoering van additieven die eigenschappen van het resulterende kristallen potentieel te verbeteren. Alle bijbehorende protocollen zullen worden in detail beschreven en kort besproken. Tezamen, hierdoor handig en zeer efficiënte macromoleculaire kristallisatie in een multi-user-faciliteit, terwijl het geven van de gebruikers controle over essentiële parameters van hun experimenten.

Inleiding

Röntgendiffractie wordt uitgebreid toegepast op verder ons begrip van de mechanismen van de biologische en ziekte op het atomaire niveau en vervolgens bij het rationele aanpak van drug discovery¹. Voor dit, gezuiverd en geconcentreerde (2-50 mg/mL) macromoleculaire monsters van eiwitten, DNA, RNA, andere liganden en hun complexen zijn trialed want hun neiging om vorm besteld driedimensionale roosters door kristallisatie^{2,3 ,4}. Wanneer hoge kwaliteit kristallen worden verkregen die diffract van x-stralen, kan de kristalstructuur worden opgelost op in de buurt van atomaire resolutie^5,6. Cruciaal, de voorwaarden om een nieuwe steekproef kristalliseren niet kan worden voorspeld en de opbrengst van hoge kwaliteit kristallen is meestal zeer laag. Een onderliggende reden is dat veel monsters van belang hebben uitdagende biochemische eigenschappen, waardoor ze unstable op het bijbehorende tijdschema voor de kristallisatie (meestal een paar dagen). Tot slot, het proces wordt nog verergerd door de tijd die nodig is om monsters en varianten van de steekproef te produceren, en voor het optimaliseren van hun zuivering en kristallisatie^7,-⁸.

Een voorwaarde van kristallisatie is een oplossing met een neerslaande dat vermindert de oplosbaarheid van de steekproef en voorwaarden bevatten vaak ook buffers en additieven. Honderden van dergelijke reagentia zijn geschikt om te veranderen van de parameters van de kristallisatie experimenten zoals ze weinig geneigd hebben te bemoeien met monster integriteit (zoals eiwit of nucleïnezuur ontvouwen). Terwijl miljoenen combinaties van kristallisatie reagentia testen is niet haalbaar, is testen verschillende te veel screening kits - geformuleerd met verschillende strategieën^9,10 - het mogelijk met verkleinde proeven en geautomatiseerde protocollen. In dit perspectief moet is het meest vatbaar techniek waarschijnlijk damp verspreiding met 100-200 nL druppels zittend op een kleine ruim boven een reservoir met de kristallisatie voorwaarde (25-250 µL), uitgevoerd in gespecialiseerde kristallisatie platen^{11 , 12}. het eiwitSteekproef en voorwaarde die vaak worden gecombineerd in een 1:1 verhouding voor een totaal volume van 200 nL bij het opzetten van de druppels in de bovenste-putten. Robotic nanoliter eiwit kristallisatie kan worden geïmplementeerd met alternatieve technieken en platen zoals de minderjarigen olie batch¹³ en de Lipidic kubieke fase¹⁴ (de laatste een worden specifiek toegepast op trans-membraaneiwitten die zijn zeer slecht oplosbaar in water).

De kristallisatie faciliteit in het MRC-LMB werd gestart in de vroege 2000s, en een vroege overzicht van onze geautomatiseerde protocollen werd gepresenteerd in 2005¹⁵. Een historische inleiding aan eiwit kristallisatie werd gepresenteerd en ook een overzicht van de voordelen van robotic nanoliter benaderen (en vervolgens een nieuwe benadering voor routinematige experimenten). Sinds macromoleculaire kristallisatie is in wezen een stochastisch proces met zeer weinig of geen nuttige informatie vooraf, met een breed scala van de initiële voorwaarden op grond (geschikt) verhogen het rendement van kwaliteit diffractie kristallen¹⁶. Bovendien, is een vaak vergeten voordeel van een grote aanvangsscherm aanzienlijk te verminderen de noodzaak voor optimalisatie van monsters en kristallen in veel gevallen. Natuurlijk kan een nog moeten gaan met de optimalisering van een aantal initiële voorwaarden later. De concentratie van de reagentia en de pH zijn meestal daarna systematisch onderzocht. Meer reagentia kunnen ook worden ingevoerd in de geoptimaliseerde of meerdere voorwaarden parameters van kristallisatie verder te wijzigen. Zeker, men kristallisatie moet proberen met een vers bereide monster, vandaar de bijbehorende protocollen moet eenvoudig en beschikbaar elk moment.

Hier twee volautomatische systemen ontworpen op het MRC-LMB (systemen 1 en 2) en de bijbehorende protocollen volledig worden beschreven. De belangrijkste toepassing van deze twee systemen is eerste screening door damp diffusie in drop kristallisatie platen zitten. Systeem 1 integreert een vloeibare handler, een geautomatiseerde carrousel op voorraad platen, een inkjet-printer voor het labelen van de plaat en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 1, zijn 72 96-wells-platen gevuld met verkrijgbare screening kits (80 µL van voorwaarde overgedragen aan reservoir van een startende volume van 10 mL in proefbuizen), label en verzegeld. De platen worden vervolgens opgeslagen in een incubator van de 10 ° C waar ze beschikbaar voor gebruikers op elk gewenst moment (als eerste schermen zijn 'LMB platen' genoemd).

Systeem 2 integreert een vloeibare handler, een nanoliter dispenser en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 2, druppels (100-1000 nL) zitten voor damp diffusie experimenten worden geproduceerd door het combineren van voorwaarden en het monster in de bovenste-putten van 20 48 - of 96-wells-platen vooraf gevuld met voorwaarden. Dit betekent 1.920 eerste screening voorwaarden trialed bij het gebruik van 20 LMB platen op het systeem 2.

Robots zijn ook individueel gebruikt voor de optimalisatie van de geselecteerde voorwaarden, en de bijbehorende semi-geautomatiseerde protocollen zijn ook beschreven. De 4-hoek methode¹⁷ is routinematig aangewend om te produceren optimalisatie schermen. Het bijbehorende protocol vereist eerst de handmatige voorbereiding van 4 oplossingen ('A, B, C en D'). Twee lineaire verlopen van concentraties (voor twee belangrijkste kristallisatie agenten) worden dan automatisch gegenereerd rechtstreeks in de reservoirs van een plaat van kristallisatie. Hiervoor opleidingscyclus een spuit-gebaseerde vloeibare handler de 4 hoekoplossingen in verschillende verhoudingen.

Voor het verder optimaliseren van een voorwaarde, kan een additief schermen die potentieel de eigenschappen van de resulterende kristallen^{18 verbeteren}dienst. Twee benaderingen zijn beschikbaar voor additieve screening: een protocol beginnen met additieven in de reservoirs van de kristallisatie platen afgeleverd vóór de oprichting van de druppels (protocol 1) en een ander protocol waar het additieve scherm wordt aangeboden direct op de druppels (protocol 2).

Andere nuttige ontwikkelingen die ingeleid bij het MRC-LMB ter vergemakkelijking van de geautomatiseerde macromoleculaire kristallisatie, worden ook gepresenteerd. In wezen, kristallisatie platen en bijbehorende voorzieningen zoals een stapelbare samenleving van biomoleculaire Screening (SBS) deksel dat minimaliseert verdamping van voorwaarden bij het gebruik van het systeem 2.

Bij beknoptheid, wordt ervan uitgegaan dat gebruikers bekend met de basisfuncties en het onderhoud van de nanoliter dispenser, de inkjetprinter en de zelfklevende plaat sealer zijn. Tenzij anders vermeld, platen op het dek van de robots zijn geplaatst zodat het goed A1 ('A1-corner') is naar de hoek van de rug links van de drager van een plaat.

Protocol

1. de twee geautomatiseerde volledig systemen (eerste screening)

1. Systeem 1: voorbereiding van 72 kristallisatie van de 96-wells-platen gevuld met screening kits (LMB platen)
   1. Voordat u de procedure uitvoert, ervoor zorgen dat het systeem robots worden geïnitialiseerd en hun controlerende software open is. Zet de chiller van de buis-koeling vervoerder ongeveer 30 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.
   2. Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en controleer dat de film correct wordt toegepast. Herhaal deze test twee keer meer om te controleren dat de plaat sealer klaar is.
   3. Dan, Voeg 20 L gedeïoniseerd water aan de belangrijkste container van de vloeibare handler. Koppelt de koppeling invoegt vanuit de kleine container (20% ethanol oplossing spoelen) en sluit de inzetstukken op de belangrijkste container.
   4. Voer de juiste schermnaam (tabel 1) op de inkjet printer touchscreen. Vervolgens opent en sluit de deur van de carrousel om te activeren van de rotatie van de carrousel. De deur open wanneer de eerste stack zichzelf presenteert.
   5. Volledig laden de eerste stack met 22 kristallisatie platen, elk met kolom 1 naar beneden uit. De volgende twee stapels op dezelfde manier volledig te laden.
   6. De resterende 6 platen in de hoogste posities van de vierde stack worden geladen. Vervolgens sluit u de deur van de carrousel.
   7. Verifiëren dat de chiller display 14 ° C. verschijnt Zachtjes en herhaaldelijk omkeren de geselecteerde screening kits voor 1 minuut. Open vervolgens het voorpaneel van de vloeibare handler.
   8. Open de tubes en plaats ze in de koeling vervoerder volgens de standaard indeling van de 96-Wells (A1, A2, enz.). Bij het plaatsen van elke buis in de vervoerder, plaats de deksel op een dienblad in dezelfde 96-Wells-indeling.
   9. Toetsing de buis posities en ervoor zorgen dat alle buizen niveau zijn en vestigde zich in de drager. Vervolgens sluit het voorpaneel.
   10. In het venster 'Opstarten' van de vloeibare handler-software, selecteert u 'Run onderhoud' en open de afboekingsmethode programma. Voer het programma om de 20%-ethanol uit het systeem spoelen en te wassen van de buitenkant van de vloeistof-verstrekking tips.
   11. Wanneer spoelen voltooid is, klikt u op 'Annuleren' om terug te keren naar 'Opstarten'. Selecteer 'Uitvoeren een bestaand proces' en klik op 'Start uw selectie'. Open het programma 'MRC kit dispensing'. Invullen '18' voor 'Exemplaren' in de configuratie scherm en het programma start.
   12. Monitor het systeem als de eerste vier platen worden aangeduid, gevuld en verzegeld.
   13. Zodra alle 72 platen zijn opgesteld en de koppeling invoegt vanuit de belangrijkste container geplaatst terug in de carrousel, naar de kleine container overschakelen. Voer het programma 'Start omhoog vloed' (zie stap 1.1.10).
   14. Uitschakelen van de chiller en gooi de lege screening kit buizen. Verwijder voorzichtig de 72 bereid platen van de carousel. Gooi ten onrechte gevulde of slecht-verzegeld platen. Opslaan van de kant-en-klare platen bij 10 ° C.
2. Systeem 2: instellen van kristallisatie druppels (100 nL eiwit + 100 nL voorwaarde) vanuit één sample in 20 LMB platen
   1. Controleer eerst dat het systeem robots zijn op de nanoliter dispenser met haar open software is geïnitialiseerd en de vloeibare handler methode manager geopend is. Zet de vervoerder microtube-koeling ongeveer 15 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.
   2. Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en verifiëren dat de plaat goed wordt verzegeld. Test de plaat sealer driemaal.
   3. Voer vervolgens de nanoliter dispenser om in te stellen 100-nL druppels van meetoplossing ligt in een test-plaat. Kijk onder een Microscoop dat de druppels goed zijn ingesteld. Sluit de nanoliter dispenser software en verwijder het strip-houder blok van het dek.
   4. Steek vervolgens in de houder plaat maat ontworpen (Zie Vertegenwoordiger resultaten: kristallisatie apparaten ontwikkeld op de LMB) de LMB plaat met de hoogste relatieve hoeveelheid vluchtige reagentia in de voorwaarden (tabel 1). Verwijder de zelfklevende folie van de plaat.
   5. Open het voorpaneel vloeibare handler en plaats van de onverharde plaat op het dek, aan de achterkant van de eerste drager van de glijdende (Sliding vervoerders kan worden teruggetrokken voor gemakkelijke toegang).
   6. De afdekplaat met een SBS aluminium deksel. Genoegen nemen met het deksel naar de achterste linker hoek van de vervoerder door zachte druk toe te passen naar de tegenoverliggende hoek van het deksel.
   7. Verzegelde, in de glijdende vervoerders laden en dekking van de overige 19 platen op dezelfde manier, werken van meest naar minst vluchtige voorwaarden. Zodra de vervoerder microtube-koeling bij 4 ° C, is zoals aangegeven door een groen licht, verwijder de cover.
   8. Afgesneden het deksel van een microtube met (ten minste) 440 µL van eiwitSteekproef (tabel 2). Zorg ervoor dat het monster geen schuim boven de meniscus, als dit met het vloeibare detectiesysteem interfereren zal. Plaats de buis in positie 1 van de vervoerder microtube-koeling.
   9. Plaats een PCR-plaat op het dek met vloeibare handler voor de adapter plaat voortbewegende vervoerder. Vervolgens sluit het voorpaneel.
   10. Na het laden van het dek, ervoor zorgen dat het nanoliter dispenser dek duidelijk van het blok van de strip-houder is en dat de dragers aan de achterkant van de 50-µL tip stapels duidelijk van de aluminium SBS deksels zijn.
   11. Selecteer in de vloeibare handler ' methode ' beheerinterface, 'Setup platen'. De initialisatie van beide systemen controleren en invullen van de parameters uitvoeren. Volg de richtlijnen van de methode beheerinterface (aanwijzingen, cijfers en een tip-management systeem helpen met voorbereiding).
   12. Controleer of alle vereiste componenten zijn klaar en start het proces.
   13. Monitor het systeem zeehonden als de dispenser nanoliter de druppels in de eerste plaat en de plaat sealer vervolgens ondergaat de plaat.
   14. Zodra alle 20 platen zijn bereid met kristallisatie druppels en automatisch terug naar de glijdende dragers, open het voorpaneel en de platen voorzichtig te verwijderen. Controleren dat de platen goed alvorens ze op te slaan voor de kristallisatie zijn verzegeld.
   15. Reinig de SBS deksels met een oplossing van 20% ethanol voordat stapelen ze op de linker kant van de vloeibare handler voor opslag. De PCR-plaat en de microtube negeren.
   16. Uitschakelen van de vervoerder microtube-koeling en veeg weg de condensatie. Laat een papieren handdoek op de top van het koeler te absorberen verder condensatie oppervlak. Dan, breng het klepje van de vervoerder en sluit het voorpaneel.

2. optimalisering van de voorwaarden

1. Spuit-gebaseerde vloeibare handler: produceren van twee lineaire verlopen van concentraties in de reservoirs van een kristallisatie plaat (de 4-hoek-methode).
   1. Controleer eerst dat de vloeibare handler brandt en geïnitialiseerd met haar open software.
   2. Op het 'verloop' tab: Open het vereiste programma, selecteert u het type van de plaat kristallisatie en het eindvolume in de reservoirs (tabel 3). De geavanceerde instelling voor 'max shot vol' van 6.000 tot 3000 moet worden verlaagd wanneer met behulp van oplossingen met [isopropanol en] > 10% v/v en [MPD] > 20% v / v.
   3. Voorbereiding van het spuiten. Plaats een zuiger in elke spuit (spits uiteinde naar beneden) en de achterkant van de spuiten invoegen de aangewezen groeven onder het hoofd van de robot. Draai een spuit met de klok mee om het te vergrendelen in positie (alleen met alle vereiste spuiten goed aangesloten zal het programma starten).
   4. Bereiden de troggen. Verwijder het roestvrijstalen frame en plaats van de troggen. De 4 standpunten aan de linkerkant komen overeen met de 4 hoeken A, B, C, D. gaat u naar 'Instellen' tabblad waarin de volumes van oplossingen nodig in elke spuit (op tabel 3, 0,5 mL dood volume werd toegevoegd aan de volumes weergegeven). Giet de hoekoplossingen in hun respectieve troggen en plaats het frame terug op het dek (het frame heeft in positie met 2 kleine magneten, gelegen aan de voorzijde van het dek). Een alternatieve manier om door te gaan met deze stap is om te gieten de oplossingen in de troggen wanneer zij al op het dek geplaatst zijn.
   5. Plaats de kristallisatie plaat op de gemotoriseerde SBS vervoerder.
   6. Klik op 'Gecombineerd' en wacht tot deze stap voltooid moet zijn (wanneer zuigers op hun weg omhoog gestopt).
   7. Ga naar het tabblad 'Uitvoeren' en start programma.
   8. Na voltooiing van het programma, ga terug naar het tabblad instellen en klik op 'Verwijderen': het systeem zuiveringen van het spuiten van overgebleven oplossingen, en dan het liften van de zuigers helemaal naar boven. 'Leegmaken' in plaats van 'Verwijderen' kunnen worden verzocht; dit de zuigers laat in de onderste positie, klaar om meer oplossingen met de dezelfde spuiten gecombineerd.
   9. Verwijder de spuiten door deze linksom te draaien.
   10. Spuiten en troggen in de juiste bak negeren (of spoel ze af met gedeïoniseerd water en vervolgens 20% v/v ethanol oplossing voor hergebruik).
   11. Afdichting van de plaat en plaats deze op de microplate-mixer voor 3 min op 1000 toeren per minuut, of 10 min wanneer zijn zeer viskeuze oplossingen worden vermengd. De plaat is klaar voor het opzetten van kristallisatie druppels op de nanoliter dispenser.
2. Additief screening van protocol 1 (het opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat vooraf gevuld met additieve scherm)
   1. Ten eerste bereiden de voorwaarde met een initiële concentratie van reagentia verhoogd met 10% (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler).
   2. Zorg ervoor dat de vloeibare handler bereid is te werken. Open het programma 'Scherm toevoegen aan additieven' voor een enkele plaat (voer volume in reservoirs: '72 µL'). Wordt gevraagd, cijfers en een tip-beheer systeem (12 x 1.000 µL tips nodig) hulp met ervoor te zorgen dat de robot is klaar om te werken volgens de selecties.
   3. Ophalen van de additieve scherm uit de incubator van-20 ° C en verwijderen zijn aluminium zegel onmiddellijk (gebruik de plaat houder), dan plaatst de plaat op het dek van de vloeibare handler. Het programma werkt volgens een portret lay-out (de plaat is geplaatst met de A1-hoek gelegen in de voorkant-links van de drager). Ook plaatsen ook de container gevuld met de voorwaarde. Voer het programma.
   4. Zodra de reservoirs van de plaat zijn ingevuld, plaats het op het schudapparaat microplate en start het programma. Spoel de container van de conditie met gedeïoniseerd water en 20% ethanol voor hergebruik.
   5. Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser. Eerst, unseal de kristallisatie plaat (gebruik de houder plaat). Dan, plaats de plaat en de proteïne 8-well strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder. De 'Setup'-tab op de controlerende software toont de werkelijke positie van elk onderdeel op het dek. Laden elk goed van de strip met eiwitSteekproef volgens de grootte van de druppel nodig (tabel 4). Uitvoeren van het programma voor te bereiden van druppels.
   6. Na voltooiing van het programma, verwijderen de plaat uit het dek en verzegel het onmiddellijk (gebruik de plaat sealer, 3-inch breed plakband). Gooi de strip in de juiste bak.
   7. Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.
3. Additief screening van protocol 2 (opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat met een herbruikbare additieve scherm)
   1. Eerst, het voorbereiden van het additief scherm: laat de overeenkomstige bevroren 96-Wells-cel cultuur plaat te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Vervolgens Centrifugeer het additieve scherm bij 1.000 x g gedurende 2 min.
   2. De voorwaarde (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler) voor te bereiden.
   3. Vul de reservoirs van een kristallisatie van de 96-wells-plaat met de voorwaarde. Van de vloeistof-handler, gaan op dezelfde manier als protocol 1, 2.2.2 stap, maar het invoeren van '80 µL' voor het volume in reservoirs.
   4. Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser met 3 componenten op het dek (de plaat met de additieve scherm, samen met de kristallisatie-plaat en de 8-well eiwit strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder, tabel 4).
   5. Zegel van de cel cultuur plaat met het scherm met een aluminium blad en plaats deze terug in de incubator van-20 ° C.
   6. Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.

Resultaten

1. systeem 1 en LMB platen

Figuur 1A blijkt het systeem 1 op basis van een vloeibare handler die werken met een vloeistof-systeem (gedeïoniseerd water). De vloeistof-systeem bestaat uit een container, een pomp, leidingen, 8 spuiten voorzien van kleppen en 8 vaste tips. De vloeibare klasse-instellingen werden geoptimaliseerd voor aspirate/afzien van een breed scala aan oplossingen en multi-afzien in 4 platen (multi-afzien vereist een relatief grote overmaat van aanzuiging volume). Een 22 L watercontainer en een kleinere container (5 L) met 20% v/v ethanol worden opgeslagen onder het systeem te voeden de vloeistof-systeem. Elke container is uitgerust met twee koppeling inzetstukken. Één invoegen (blauw) feeds het systeem met vloeistof, de andere een (rood) is een stroom-terug naar het verminderen van overdruk. Na gebruik spoelen met water en vervolgens 20% v/v ethanol oplossing voorkomt dat microbiële groei. Een koelaggregaat (ook gevestigd onder het systeem) is verbonden met een op maat gemaakte buis-koeling carrier. Systeem 1 is 2050 mm breed, met inbegrip van de carrousel en 760 mm diep, 88 mm hoog. Een extra 550 mm is verplicht aan de voorkant voor de werktafel die in het bezit van de controle-eenheid van de inkjetprinter en de zelfklevende plaat sealer. Extra ruimte is ook naast het systeem voor de controle PC nodig. Het programma voor de productie van 72 vooraf ingevulde platen (dat wil zeggen 18 rondes van 4 platen) duurt 3 uur en 50 minuten.

Figuur 1B is een close-up van het main-dek die is uitgerust met 8 vaste uiteinden (Figuur 1 c) gemonteerd op een geautomatiseerde pipetting arm, een tweede arm met een grijper, een tip wash station, 2 x 4-positie dragers voor SBS platen en de vervoerder buis-koeling. Het hoofdprogramma verwerkt 4 platen op een moment dat zijn genomen uit automatisch van de carousel en geplaatst op het dek waar ze zijn gevuld met kristallisatie voorwaarden (80 µL in reservoirs, Figuur 1 d). Zoals de tips geleidende zijn vloeistof niveaus automatisch gedetecteerd. Terwijl de vloeibare handler opleidingscyclus voorwaarden in een aantal platen, is een ander aantal lege platen genomen van de carousel, label en geplaatst op het main-dek. Een kleine custom-built houder en venster in het achterpaneel van de vloeibare handler dienden te plaatsen van het hoofd van de printer en de sensor aan de achterkant van het hoofddek. De 8 tips zijn gespoeld en daarna elke verstrekking stap die uit 4 aliquots in de corresponderende kolommen van reservoirs bestaat gewassen met water uit de belangrijkste container. Na 4 platen zijn ingevuld, zij automatisch afgesloten en weer in hun oorspronkelijke positie in de carrousel geplaatst. De plaat sealer wordt geactiveerd door een specifiek stuurprogramma (genoemd door de controlerende software). De sealer gebruikt een worp van 3-inch breed plakband die wordt toegepast op een plaat met rollen onder mechanische druk. Na voltooiing van het programma, worden de vooraf ingevulde platen handmatig verwijderd uit de carrousel stacks en opgeslagen in een 10 ° C incubator gelegen binnen de faciliteit.

Figuur 1 : Het vullen van de reservoirs met eerste screening kits. (A) overzicht van het volledig geautomatiseerde systeem 1. De carrousel is een geautomatiseerde eenheden met stapels van de plaat en het is gehuisvest in een goed gemaakt van heldere acryl platen aan de rechterkant het hoofddek. (B) het main-dek van het vloeibare handler in samenwerking met (een) vervoerder buis-koeling (verbonden aan een huiveringwekkende eenheid daaronder niet weergegeven), (b) de snelle wash station (verbonden met drainage, niet afgebeeld), (c) de pipetting arm het vullen van 8 reservoirs van een kristallisatie van de 96-wells-plaat, (d) de arm van de grijper brengen een gevulde plaat op (e) de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Aan de achterkant van het dek is hoofd van de (f) de afdrukken van de inkjetprinter verbonden met (g) de inkjet controle-eenheid onder de sealer. (C) A label plaat (naam van het scherm) en datum van productie wordt opgevuld met kristallisatie voorwaarden door 8 geleidende vaste tips gemaakt van polytetrafluorethyleen-bekleed roestvast staal. (D) dwarsdoorsnede van een verzegelde kristallisatie goed. Het reservoir bevat 80 µL van kristallisatie aandoening (terwijl de bovenste goed leeg is). Reservoir en Opper-well diepte specificaties zijn in millimeters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1 toont de verschillende formuleringen voor de verkrijgbare screening kits in proefbuizen. De kits worden gebruikt voor het vullen van de reservoirs van de kristallisatie van de 96-wells-platen (LMB01-LMB22) op een regelmatige basis met het systeem 1.

De naam van de plaat	de naam van de kit	leverancier	catalogusnummer	buizen	eenvoudige beschrijving
LMB01	Crystal scherm 1	Hampton onderzoek	HR2-110	48	Sparse Matrix (pH 4.6-8.5)
	Crystal scherm 2	Hampton onderzoek	HR2-112	48	Stochastische bemonstering (pH 4.6-9.0)
LMB02	Wizard 1	Rigaku	1009530	48	Stochastische bemonstering (pH 4.5-10.5)
	Wizard 2	Rigaku	1009531	48	Stochastische bemonstering (pH 4.5-10.5)
LMB03	Raster scherm ammoniumsulfaat	Hampton onderzoek	HR2-211	24	Raster scherm, [AmS] = 0.8-3.2 M en buffers pH 4.0-9.0
	Raster scherm PEG/LiCl	Hampton onderzoek	HR2-217	24	Raster scherm, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, conc. LiCl = 1,0 M en buffers pH 4.0-9.0
	Scherm snel aan de	Hampton onderzoek	HR2-221	24	Raster scherm, [NaKPO4] = 0,8-1,8 M met een pH van 5.0-8.2
	Raster scherm natriumchloride	Hampton onderzoek	HR2-219	24	Raster scherm, [NaCl] = 1.0-4.0 M en buffers pH 4.0-9.0
LMB04	Raster scherm PEG 6000	Hampton onderzoek	HR2-213	24	Raster scherm, [PEG 6000] = 5-30 %w/v en buffers pH 4.0-9.0
	Raster scherm MPD	Hampton onderzoek	HR2-215	24	Raster scherm [MPD] = 10-65 %w/v en buffers pH 4.0-9.0
	MemFac	Hampton onderzoek	HR2-114	48	Sparse Matrix voor membraaneiwitten (pH 4.6-8.5)
LMB05	PEG-Ion	Hampton onderzoek	HR2-126	48	Raster scherm, [PEG 3350] = 20 %w/v en verschillende zouten op 0,2 M (geen buffers)
	Natrix	Hampton onderzoek	HR2-116	48	Onvolledige faculteit (pH 5.6-8.5)
LMB06	Crystal scherm Lite	Hampton onderzoek	HR2-128	48	Crystal scherm 1 met de helft van de oorspronkelijke precipitant concentraties
	Aangepaste Lite scherm	Moleculaire afmetingen	n/b	48	Aanvullende voorwaarden met lage concentraties van precipitant
LMB07	Wizard Cryo 1	Rigaku	1009536	48	Stochastische bemonstering met voorwaarden cryoprotected met behulp van lage MW haringen (pH 4.5-9.4)
	Wizard Cryo 2	Rigaku	1009537	48	Stochastische bemonstering met voorwaarden cryoprotected met behulp van lage MW haringen (pH 4.5-10.1)
LMB08	JBS1	JenaBioScience	CS - 101L	24	Onvolledige faculteit gebaseerd op verschillende haringen (pH 4.6-9.0)
	JBS2	JenaBioScience	CS - 102L	24	Onvolledige faculteit op basis van PEG 4000 (pH 4.6-8.5)
	JBS3	JenaBioScience	CS - 103L	24	Onvolledige faculteit op basis van PEG 4000 (pH 4.6-8.5)
	JBS4	JenaBioScience	CS - 104L	24	Onvolledige faculteit op basis van middellange MW haringen (pH 6,5-8,5)
LMB09	JBS5	JenaBioScience	CS - 105L	24	Onvolledige faculteit gebaseerd op zware MW haringen (pH 6,5-9.5)
	JBS6	JenaBioScience	CS - 106L	24	Onvolledige faculteit gebaseerd op AmS (pH 4.6-8.5)
	JBS7	JenaBioScience	CS - 107-L	24	Onvolledige faculteit gebaseerd op MPD (pH 4.6-8.5)
	JBS8	JenaBioScience	CS - 108L	24	Onvolledige faculteit op basis van MPD en ethanol (pH 4.6-8.5)
LMB10	JBS9	JenaBioScience	CS - 109L	24	Onvolledige faculteit op basis van gemeenschappelijke zouten en 2-propanol (pH 4.6-8.5)
	JBS10	JenaBioScience	CS - 110L	24	Onvolledige faculteit gebaseerd op common zouten (pH 4.6-8.5)
	Duidelijke strategie scherm 1 pH 4,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 1 pH 5.5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
LMB11	Duidelijke strategie scherm 1 pH 6,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 1 pH 7.5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 1 pH 8,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 2 pH 4,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
LMB12	Duidelijke strategie scherm 2 pH 5.5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 2 pH 6,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 2 pH 7.5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
	Duidelijke strategie scherm 2 pH 8,5	Moleculaire afmetingen	MD1-16LMB	24	Raster scherm met diverse pinnen
LMB13	Index	Hampton onderzoek	HR2-144	96	Kleine sparse matrix en raster schermen (pH 3.0-9.0)
LMB14	SaltRX 1	Hampton onderzoek	HR2-107	48	Raster scherm inclusief 22 unieke zouten versus zoute concentratie en pH (4.1-9.0)
	SaltRX 2	Hampton onderzoek	HR2-109	48	Raster scherm inclusief 22 unieke zouten versus zoute concentratie en pH (4.1-9.0)
LMB15	MemStart	Moleculaire afmetingen	MD1-21	48	Sparse matrix voor membraaneiwitten (pH 4.0-10,0)
	MemSys	Moleculaire afmetingen	MD1-25	48	Raster scherm voor membraaneiwitten (meestal pinnen, pH 3,5-9.5)
LMB16	JCSG +	Qiagen	130720	96	Sparse Matrix (pH 4.0-10,0)
LMB17	MORPHEUS scherm	Moleculaire afmetingen	MD1-46	96	Raster scherm met inbegrip van de mengelingen van additieven en de voorwaarden van de cryoprotected (pH 6,5-8,5)
LMB18	Pi minimale scherm	JenaBioScience	CS-127	96	Onvolledige faculteit (pH 4.0-9.5)
LMB19	Pi-PEG scherm	JenaBioScience	CS-128	96	Onvolledige Faculteit voor membraaneiwitten (pH 4.8-8,8)
LMB20	MORPHEUS II-scherm	Moleculaire afmetingen	MD1-91	96	Raster scherm met inbegrip van de mengelingen van additieven (zware atomen) en cryoprotected voorwaarden (pH 6,5-8,5)
LMB21	LMB kristallisatie scherm	Moleculaire afmetingen	MD1-98	96	Sparse matrix met inbegrip van voorwaarden geselecteerd van LMB publicaties
LMB22	MORPHEUS III scherm	Moleculaire afmetingen	n/b	96	Raster scherm met inbegrip van de mengelingen van additieven (drug compounds) en cryoprotected voorwaarden (pH 6,5-8,5)

Tabel 1: formuleringen van de kits gevonden in LMB platen. Elke commerciële screening kit bestaat uit 24/48/96 voorwaarden aanvankelijk in proefbuizen. De LMB platen zijn voorradig in 10 ° C starterscentra gelegen binnen de faciliteit waar ze beschikbaar zijn voor gebruikers op elk gewenst moment.

2. systeem 2 en eisen voor het opzetten van druppeltjes

Figuur 2A toont het systeem 2 gebaseerd op een vloeibare handler¹⁹ met positieve verplaatsing en wegwerp tips. De wegwerp tips worden geleverd in stapelbare rekken geschikt voor automatische verwerking. Een 3-positie dek nanoliter dispenser²⁰ werd geïntegreerd aan de rechterkant van het systeem. Aspirate/afzien op de dispenser nanoliter ook werkt met positieve verplaatsing met behulp van wegwerp microsyringes (meegeleverd in grote spoelen). Als een zelfstandige robot, wordt een verwijderbare strip-houder-blok gebruikt voor het laden van eiwit elk exemplaar. Voor het volledig geautomatiseerde proces vervangt een 384-well PCR plaat de strip-houder. Een soortgelijke zelfklevende plaat sealer systeem 1 werd geïntegreerd aan de linker kant. De sealer en nanoliter dispenser staan op custom-built, verhoogde bureaus om de belangrijkste grijper te bereiken de plaat dragers van deze twee geïntegreerde robots (een venster moest worden gesneden in beide zijwanden van de vloeibare handler voor de grijper toegang buiten het hoofddek). Het hoofdprogramma roept specifieke stuurprogramma's naar trigger nanoliter verstrekking programma's en de sealer ter bestemder tijd. Het systeem 2 is 2.850 mm breed, 800 mm diep en 800 mm hoog. Extra ruimte nodig naast de robot voor de weergave van de controlerende PC. Twee afvalbakken bevinden zich onder het stelsel voor de tips en microsyringes verwijderd tijdens het proces (de controlerende PC wordt ook opgeslagen onder). Een belangrijk kenmerk van het systeem 2 is de algemene lay-out, die gemakkelijke toegang tot de drie robots behoudt, zodat ze kunnen individueel worden gebruikt voor de protocollen van de optimalisering die eerder zijn beschreven, of andere protocollen elders beschreven zoals kristallisatie screening van membraaneiwitten in lipidic mesophases²¹ en willekeurige microseed matrix²².

Figuur 2B is een close-up van het dek dat is uitgerust met een enkele robotic arm. De arm integreert 12 onafhankelijke pipetting sondes en de belangrijkste gripper. De posities van de sondes kunnen individueel worden aangestuurd in één richting om toegang tot verschillende locaties langs de as tussen de sondes of zelfs één buizen. De sondes kunnen oprapen van wegwerp tips (1-12) of een paar plaat voortbewegende adapters. Twee sets van 4 stapels met 50 µL wegwerp tips worden in eerste instantie geladen. Zoals de tips geleidende zijn vloeistof niveaus automatisch gedetecteerd. De plaat voortbewegende adapters zijn ontworpen met 2 scherpe pinnen aan de binnenkant die een optionele grijper vormen wanneer nodig. Op het main-dek is gelegen een 24-positie microtube koeling drager voor het monster, hoewel slechts 1-2 posities worden hier gebruikt. Daarnaast is er een drager voor de PCR-plaat en ook 2 opslag dragers voor stapelbaar, op maat gemaakte SBS deksels (figuur 2C). Tot slot, zijn er 4 schuifdeuren vervoerders, elk met 5 locaties voor kristallisatie platen (4 x 5 = 20 platen).

Figuur 2 : Instellen van druppeltjes voor damp diffusie experimenten. (A) overzicht van het volledig geautomatiseerde systeem 2. (B) het main-dek van het vloeibare handler ingebruikzijn met (een) de opslag dragers voor stapels van SBS deksels, (b) de stapelbare tips, (c) de koeling-carrier met een steekproef in microtube, (d) drager voor de 2 voortbewegende plaat adapters, (e) de PCR-plaat voor het overbrengen van eiwitten aan de nanoliter handling robot, (f) 9 verzegeld platen die zijn gebracht terug in hun oorspronkelijke posities, (g) de optionele gripper verwijderen van de SBS-deksel voor de 10^th plaat over te vervoeren op het dek van de vloeibare handler, (h) de volgende 10 platen worden bereid met SBS deksels bovenop, (ik) de belangrijkste grijper, die wordt gebruikt voor het vervoer van de PCR en kristallisatie platen, (j) de belangrijkste geautomatiseerd arm integratie 12 pipetting sondes (2 wordt gebruikt om te opereren als optionele grijper) en de belangrijkste grijper en (k) het dek van de nanoliter dispenser. (C) In-house aangepaste SBS deksels gemaakt van aluminium. De deksels integreren een rubberen vel dat om te voorkomen dat de verdamping van de voorwaarden en twee kleine gaatjes te worden nauwkeurig opgehaald door de optionele gripper. (D) dwarsdoorsnede van een verzegelde kristallisatie goed waar het reservoir is gevuld met een voorwaarde en de upper-well bevat een droplet samengesteld uit zowel de eiwitSteekproef en de voorwaarde. Omdat de neerslaande in de druppel minder geconcentreerd dan in de voorwaarde is, water de concentraties van al de componenten in de daling stijgen door verlies tijdens het proces van evenwichtsinstelling door damp diffusie (zeer schematisch voorgesteld door een pijl). (E) lichte microfoto van 100 nL en (F) 200 nL druppels geproduceerd door de nanoliter dispenser met een blanco-oplossing (20% v/v polyethyleenglycol 400, 0,001% w/v Safranine als rode kleurstof). De grootte en vorm van de druppels kunnen variëren naargelang de chemicophysical eigenschappen van de aandoening. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De belangrijkste programma begint met de optionele gripper de SBS-deksel verwijderen uit de eerste plaat van kristallisatie. Nadat het deksel werd overgebracht naar de bijbehorende vervoerder van de opslag, wordt de kristallisatie plaat getransporteerd naar het dek van de nanoliter dispenser. Vervolgens brengt de pipetting arm de hoeveelheid monster nodig zijn voor het instellen van de druppels van de normaal gekoeld microtube tot de eerste kolom van de PCR-plaat. Vervolgens beweegt de belangrijkste gripper de PCR-plaat op het dek van de nanoliter dispenser die zal bereiden de druppels na de opties geselecteerd door de gebruiker aan het begin (bv. druppel grootte). Voor dit, de eiwitSteekproef eerst in de bovenste-putten (met een enkele set van 8 microsyringes en multi-verstrekking) wordt aangeboden, dan de kristallisatie voorwaarden worden afgeleverd op de eiwit druppels (elke rij nu vereist 8 nieuwe microsyringes te vermijden kruisbesmetting). Na voltooiing van het programma op te zetten van druppels, de belangrijkste gripper vervoert de bijbehorende plaat aan de plaat sealer, dan plaatst de PCR-plaat terug in de oorspronkelijke positie (meer eiwit zal worden afgeleverd in de volgende kolom van de PCR-plaat voor de volgende plaat ). Tot slot de verzegelde kristallisatie plaat is verhuisde terug naar de oorspronkelijke positie op het dek: damp diffusie experimenten zijn al begonnen in deze plaat (figuur 2D). Deze cyclus herhaalt zich volgens het aantal platen. Wanneer nodig, verwijdert de optionele grijper een lege tip rek waardoor de pipetting arm tot meer tips. Het programma duurt 2 uur en 20 min en 440 µL van monster te bereiden enkele druppeltjes in 20 platen met behulp van 100 nL monster + 100 nL voorwaarde (figuur 2E en 2F).

Wanneer u de nanoliter dispenser als stand-alone robot voor twee extra platen (Zie Protocol, stap 1.2.3), de hele set van eerste screening platen beschikbaar in de incubator van 10 ° C kan worden ingesteld (22 LMB platen x 96 voorwaarden 2,112 voorwaarden =).

Tabel 2 toont de vereisten voor het hoofdprogramma volgens selecties van de gebruiker op het systeem 2.

Platen		Druppelgrootte (nL)	Elk exemplaar		Tip van eisen		Duur
Nummer	Type		Vol. 1 (µL)	Vol. 2 (µL)	50 µL tips	Microsyringes
10	96-Wells	100	240	0	80	1040	1 h 12 min
20	96-Wells	100	440	0	160	2080	2 h 20 min
10	96-Wells	100	240	240	160	2080	1 h 45 min
20	96-Wells	100	440	440	320	4160	3 h 05 min
10	48-well	1000	624	0	80	560	1 uur 10 min
20	48-well	1000	1208	0	160	1120	2 uur 16 min

Tabel 2: voorbeelden van de belangrijkste programmaopties beschikbaar op het systeem 2 voor het opzetten van kristallisatie druppeltjes. De benodigde hoeveelheid eiwitSteekproef, tips en microsyringes, is afhankelijk van het programma. De hoeveelheid monster ' vol. 1' (drop-1) en ' vol. 2' (drop 2) worden als volgt berekend: (8 tips x vereist, Delta volume per putje van PCR plaat + 4 µL verloren volume) x aantal kristallisatie platen + 40 µL dood volume in microtube. Het vereiste volume per putje van PCR plaat voor 100 nL druppels in 96-Wells kristallisatie plaat is 2 µL terwijl 6.8 µL vereist voor 1.000 nL druppels in een 48-well-plate is (dood volume in putjes van de plaat PCR: 0.8 µL). Een extra hoeveelheid monster is rekening ('verloren volume') als gevolg van verdamping van de microtube en andere verliezen (bijvoorbeeld monster steken op tips). Bijvoorbeeld, voor 20 MRC platen, 100 nL, 1 druppel protocol, de hoeveelheid monster nodig is: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (dat wil zeggen, het equivalent van 22 µL per plaat). Acht wegwerp 50 µL tips zijn vereist voor elke plaat en elk monster. Bijvoorbeeld, voor 10 platen, 2 neerzetten protocol, het aantal tips nodig is 8 x 10 x 2 = 160 tips. Het aantal microsyringes wordt berekend als volgt: (8 + aantal voorwaarden per plaat) x aantal monsters x aantal platen. Bijvoorbeeld, voor 10 x 48-Wells-platen, het aantal vloeibare handler tips nodig is: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 tips.

3. formulering, voorbereiding en behandeling van de 4-hoekoplossingen

Beide formuleringen van de 4 hoekoplossingen ('A, B, C en D') en het bijbehorende optimalisatie scherm (figuur 3A) worden automatisch gegenereerd door een Excel-werkblad. Er zijn verschillende werkbladen voor verschillende aantallen voorwaarden — in wezen 24, 48 en 96 voorwaarden — en ook spreadsheets te bereiden van twee verschillende optimalisatie schermen in een enkele plaat. Een typisch bereidt een set van 4 x 10 mL hoekoplossingen in proefbuizen van die 2-3 optimalisatie schermen kunnen bereid worden, afhankelijk van het aantal en de omvang van de vereiste voorwaarden. De oplossingen worden gegoten in troggen waaruit ze zijn aanzuiging door een spuit-gebaseerde vloeibare handler en later afgeleverd direct in platen (figuur 3B). De twee lineaire verlopen van concentraties het gevolg zijn van het mengen van A, B, C en D bij systematisch verschillende ratio's (Figuur 3 c).

Figuur 3: het 4-corner-methode voor het voorbereiden van optimalisatie schermen. (A) weergave van de twee gradiënten van concentraties in een lay-out van de 96-wells-plaat. (B) de spuit gebaseerde vloeibare handler gaan voorbereiden van een scherm met 4 spuiten ingevoegd in het hoofd van de robot. Een kristallisatie plaat zit in de gemotoriseerde SBS vervoerder en de 4-oplossingen (A, B, C en D) starten hebben reeds is afgezien in hun respectieve troggen (de oplossingen zijn rood gekleurd voor demonstratie-doeleinden alleen). (C) verhoudingen van de oplossingen A, B, C en D over 96 reservoirs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 3 toont de vereisten voor de programma's beschikbaar voor gebruikers op de injectiespuit gebaseerde vloeistof-handler.

Plaat type	Nr. voorwaarden	Vol in de plaat (reservoirs, µL)	Vol. in trog (mL)	Duur
96-Wells	48	80	1.6	2 min 5 sec
96-Wells	96	80	2.5	3 min 50 sec
96-Wells	2 x 48	80	1.6	2 min 50 sec
48-well	24	200	1.8	2 min 25 sec
48-well	48	200	3	4 min 20 sec

Tabel 3: programma's beschikbaar op de spuit-gebaseerde vloeibare handler voor het voorbereiden van optimalisatie schermen volgens de methode 4-hoek. De 96-wells-plaat kan worden gebruikt voor het bereiden van 96 - of 48-conditie optimalisatie scherm (wanneer er twee 48-conditie schermen tegelijkertijd worden opgesteld de robot moet worden uitgerust met 8 spuiten en 8 troggen). Andere programma's in staat stellen het gebruik van 48-Wells-platen. De vermelde volumes in troggen omvatten de vereiste dood volume (0,5 mL).

4. additieve screening

Figuur 4 toont de stappen voor het uitvoeren van een additief screening beginnen ofwel met 96 additieve oplossingen al in de reservoirs van de kristallisatie plaat (protocol 1) of de putten van een laag-profiel cultuur plaat gebruikt als een herbruikbaar additieve scherm (cel Protocol 2). Tabel 4 bevat de programma's beschikbaar op de dispenser nanoliter volgens de twee soorten protocollen.

Figuur 4: de twee soorten protocollen voor additieve screening. De 96-additief schermen worden opgeslagen bij-20 ° C. Naar aanleiding van protocol 1, het additieve scherm is in eerste instantie aan de reservoirs van de kristallisatie platen toegevoegd (en ideaal voorradig op deze manier). Een vloeibare handler of multipipette wordt gebruikt om het afzien van de voorwaarde in de reservoirs met additieve oplossingen (de hoeveelheid additief scherm vertegenwoordigt 10% van het uiteindelijke volume in reservoirs: 8 µL voor 80 µL eindvolume). Na het mengen van de omstandigheden op een microplate-mixer (niet afgebeeld), wordt de microsyringe gebaseerde nanoliter dispenser gebruikt voor het instellen van de druppels (tabel 4). Naar aanleiding van protocol 2, wordt het additief scherm pas later toegevoegd tijdens het opzetten van de kristallisatie druppels. Ditmaal de nanoliter dispenser is aangewend om te bereiden druppels met extra materiaal op zijn dek (de herbruikbare cel cultuur-plaat met het additief scherm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol		Druppelgrootte (nL)			Strip type	Monster vol. (µL)		Nr. van microsyringes	Duur
Type	Bron van additieven	Eiwit	Voorwaarde	Additief		In elk putje (strip)	Totaal
1	kristallisatie van de 96-wells-plaat	100	100	0	2 ΜL	2	16	104	2 min
1	kristallisatie van de 96-wells-plaat	200	200	0	5 ΜL	3.8	31	104	2min 10 sec
2	96-Wells cel cultuur plaat	200	200	100	5 ΜL	3.8	31	200	3min 45 sec
2	96-Wells cel cultuur plaat	500	500	100	5 ΜL	7.4	60	200	4min 15 sec

Tabel 4: programma's beschikbaar op de microsyringe gebaseerde nanoliter dispenser voor additieve screening. De vereiste hoeveelheid monster in elk putje van de 8-well strip wordt als volgt berekend: dood volume + 12 x inktdruppels. Er zijn 2 soorten strips (2 µL en 5 µL). De dode volumes zijn 0.8 µL voor de 2 µL putten (dat kan eigenlijk bevatten 3.2 µL max.) en 1.4 µL voor de 5 µL putten (7,5 µL max.). De totale hoeveelheid eiwit nodig is: 8 x volume in put van de strip (ronde-up waarde). Het dode volume van de V-vormige putjes van de plaat van de cultuur 96-Wells-cel is 2.5 µL. Het vereiste aantal microsyringes is afhankelijk van het geselecteerde programma (8 + 96 = 104; of 8 + 2 x 96 = 200).

Vanwege de verdunning van de conditie met het toevoegingsmiddel tijdens de oorsprongsregels in protocol 1 moet de voorwaarde worden voorbereid op een proportioneel hogere concentratie dan in eerste instantie. De toename van de eindconcentraties is gemakkelijkst bereikt doordat de laatste toevoeging van water aan de berekende eindvolume. Na deze opbrengsten een gewoon met de normale set up van druppeltjes die Meng de voorwaarde en de monster (bijvoorbeeld, 100 nL eiwit + 100 nL voorwaarde al vermengd met additieven). Protocol 2 (b.v., 200 nL eiwit + 200 nL voorwaarde + 100 nL toevoegingsmiddel) vergemakkelijkt de screening in verschillende concentraties van additieven door het simpelweg het variëren van de hoeveelheid additief scherm toegevoegd. Protocol 2 impliceert min of meer verdunning van de druppels (die kunnen veranderen kristallisatie).

De vloeibare handler van systeem 2 kan worden gebruikt om voldoende voorwaarde in 12 tips gecombineerd en 8 aliquots afzien in de reservoirs van een 96-wells-plaat (Zie Protocol, stap 2.2.2), hoewel deze stap kan natuurlijk handmatig worden gedaan met een meerkanaalspipet ( Figuur 4). Verschillende platen kunnen worden ingevuld in een tijd met dezelfde voorwaarde bij het gebruik van de vloeibare handler (om te testen verschillende additieve schermen later). Bij de voorbereiding van 2 platen, vul de container reagens met minstens 23 mL. Bij de voorbereiding van 3 platen, vul de container reagens met ten minste 31 mL.

5. kristallisatie platen en bijbehorende voorzieningen

Het ontwerp van beide MRC vergadering neerzetten damp diffusie kristallisatie platen (96-Wells 2-drop en 48-well 1 neerzetten, figuur 5A en 5B van de figuur) biedt kenmerken waarmee betrouwbare en efficiënte geautomatiseerde kristallisatie experimenten, met name de bolvorm van de Opper-putten en een lichte V-vorm van de reservoirs die verstrekking van nauwkeurige en ook centrifugeren te vergemakkelijken wanneer de centrering van de druppeltjes is vereist. Bovendien, hebben de Opper-putten een lens effect voor optimale verlichting onder een stereomicroscoop (het polymeer is UV overdraagbare voor de detectie van UV-absorberende of TL kristallen²³).

Een aangepaste zegel (figuur 5C) kunt instellen van opknoping drop kristallisatie experimenten binnen beide soorten platen met behulp van een nanoliter dispenser (protocollen niet weergegeven). Tot slot hebben beide platen MRC dezelfde buitenmaten en rand. De velg past in de groeven van onze op maat gemaakte plaat houder (figuur 5D), die wordt gebruikt voor het handmatig plaatsen/verwijderen van afdichtende tape zonder spatten van vloeistoffen.

Figuur 5: de MRC kristallisatie platen en bijbehorende voorzieningen ontwikkeld op de LMB. (A) A1-hoek van de 96-wells-plaat. Het reservoir (langwerpig) is aan de linkerkant van de kristallisatie put, de twee sferische boven-putten aan de rechterkant. Afmetingen zijn in millimeters. (B) A1-hoek van de plaat van 48-well. Het reservoir is aan de rechterkant van de put (1 grote Opper-Nou ja alleen). (C) MRC opknoping drop zegel. (D) In-house aangepaste plaat houder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

6. eiwit kristallen

Figuur 6 ziet u voorbeelden van nuttig kristallen verkregen met behulp van onze geautomatiseerde protocollen.

Figuur 6: licht microfoto van druppels met kristallen verkregen na de geautomatiseerde protocollen. (A, B) Kristallen van het eerste scherm van OmpF en MreB in platen bereid met de 2 volledig geautomatiseerde systemen (Zie Protocol punten 1.1 en 1.2, voorwaarden: LMB07 goed A4 en LMB20 goed D12, respectievelijk, grootte van de druppels is 100 nL eiwit + 100 nL voorwaarde, werk van Andrzej Szewczak, LMB)²⁴. (C, D) Bar domein kristallen vóór en na de optimalisatie van de initiële voorwaarden met de methode 4-hoek (stap 2.1, LMB02 B6, 1.000 nL + 1.000 nL, ongepubliceerd werk van Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Zware ketting van menselijke dynein 1 N-terminale domein kristallen vóór en na de optimalisatie van de initiële voorwaarden met de methode 4-hoek (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, vervolgens 500 nL + 500 nL, ongepubliceerd werk van Edgar Morales-Ríos, LMB). (G, H) Aanvullen van factor D kristallen vóór en na de optimalisatie van de conditie met additieve screening (stap 2.2, de eerste conditie van in-house aangepaste scherm, 200 nL + 200 nL, additieve D6 van het additief scherm van 96-conditie, ongepubliceerd werk van Matthias Bauer, LMB). (I, J) Virale envelop glycoproteïne²⁵ kristallen vóór en na de optimalisatie van de conditie met additieve screening (stap 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, dan 200 nL + 200nL + 100 nL toevoegingsmiddel E5 van het additief scherm van 96-conditie, ongepubliceerd werk van Yorgo MODIS, Universiteit van Cambridge, UK). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

1 - voorbereiding en het gebruik van de eerste schermen opgeslagen in platen

Screening van kits moet worden vermengd voordat het wordt afgeleverd in platen, omdat lichte neerslag of fase scheiding in sommige buizen tijdens de opslag plaatsvindt. Wanneer een scherm is samengesteld uit twee kits (2 x 48 buizen), is de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie E1 van de koeling vervoerder. Wanneer een scherm bestaat uit 4 kits (4 x 24 buizen), de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie C1, de eerste buis van de derde kit wordt geplaatst in de locatie E1 en de eerste buis van de vierde kit is geplaatst in de locatie G1. Bij het invoegen van de buizen in hun koeling carrier, worden deksels geplaatst op een dienblad na de lay-out van de standaard 96-Wells-landschap. Aangezien goed nummers worden aangeduid op de top van de deksels met de fabrikanten, hierdoor kruiscontroles als alle buizen zijn geplaatst in de juiste volgorde. Dit helpt ook om de juiste deksels op de buizen vervangen bij het invullen van een beperkt aantal platen.

We slaan de vooraf ingevulde platen bij 10 ° C, een compromis invriezen en opslag bij 4 ° C, die leiden verslechtering van de omstandigheden en problemen met de afdichting tot kan te vermijden. Platen worden opgeslagen voor tot enkele maanden met normaal geen merkbare condensatie op de binnenzijde van het zegel. Dat geldt minder voor LMB05, LMB06, LMB09 en LMB10 platen zoals deze voorwaarden met relatief hoge concentraties van vluchtige reagentia (tabel 1 bevatten). Kleine hoeveelheid condensatie aan de binnenkant van het zegel afdichting efficiëntie vermindert en kruisbesmetting tussen putten terwijl de platen ontzegeling kan veroorzaken. Om te helpen met het voorkomen van condensatie tijdens eerste koeling, kunnen de platen eerst vanuit de carrousel in een geïsoleerde picknick koeler, dat is opgeslagen in een koelruimte van 4 ° C's nachts worden overgezet. De zeer langzame afkoeling minimaliseert de ontwikkeling van temperatuurgradiënten binnen de verzegelde putten en vandaar vermindert condensatie algemene¹⁵. Bovendien, zodra de platen worden opgeslagen in de 10 ° C incubator, wordt een in-house aangepaste SBS polystyreen deksel gezet op de plaat aan de bovenkant van elke stack (niet afgebeeld).

Het geheel van onze vooraf ingevulde platen kan worden gebruikt als een groot eerste scherm tegen een roman, in water oplosbare, eiwitSteekproef. Als alternatief kunnen minder platen worden geselecteerd om aan specifieke eisen voldoen. Bijvoorbeeld, LMB15 en LMB19 zijn schermen geformuleerd speciaal voor membraan eiwit monsters^26,27, of LMB20 is een scherm met zware-atomen om experimentele fasering van diffractie gegevens²⁸ geformuleerd (Zie ook : Formulering van de MORPHEUS eiwit kristallisatie schermen).

2. het opzetten van kristallisatie druppels

Wanneer u het systeem 2, moet screening kits met aanzienlijke hoeveelheid vluchtige reagentia worden verwerkt eerst. Dit vermijdt condensatie vormen op het rubber van de SBS-deksels, die invloed kunnen zijn op de behandeling van de deksel en plaat afdichting. Een SBS-deksel heeft een beetje van goedkeuring wanneer op de bovenkant van een plaat, dat is waarom ze moeten in eerste instantie worden aangepast (Zie Protocol, stap 1.2.6). De dode volumes van eiwit in de putjes van de plaat PCR zijn relatief genereuze (0.8 µL, zie legende van tabel 2). Merk op dat even gul dode volumes worden ingezet bij het gebruik van de dispenser nanoliter individueel met eiwit in 8-well strips (tabel 4). Kleinere dode volumes kan werken, maar sommige monsters voldoen aan de tips, kalibratie van een robot kan worden enigszins onnauwkeurig, de kamer kan worden warmer dan gebruikelijk, enz. Al leiden tot monster verliezen gedekt door de gulle dode volumes om te consolideren van de aanpak.

Recente ontwikkelingen ingeschakeld verdere miniaturisatie van experimenten en dus de hoeveelheid monster nodig voor het screenen van kristallisatie voorwaarden kan aanzienlijk worden verkleind door de integratie van de bijbehorende technologie^29,30 . Bepaalde aspecten van verdere miniaturisatie moeten echter zorgvuldig, zoals de verdamping van druppels³¹ en de manipulatie van microcrystals³².

Ten slotte, centrifugeren van de plaat (2.000 rpm, 1 min) kan worden geïntegreerd als een routine laatste stap bij het instellen van kristallisatie druppels (in sferische boven-wells). Een meer consistente grootte en vorm van druppels als gevolg van centrifugeren kunnen verminderen reproduceerbaarheid kwesties^33,34. Zeker, gecentreerd druppels zal verlichten de latere evaluatie van experimenten met behulp van een Microscoop, zoals de vereiste brandpuntsafstand gelijk over de gehele plaat zijn zullen.

3. de voordelen van de methode 4-hoek

Het belangrijkste voordeel van de methode 4-corner is de eenvoud, die minimaliseert fouten en eenvoudige geautomatiseerde protocollen vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, zal de 4 hoekoplossingen altijd worden geplaatst op het dek van een vloeibare handler na de dezelfde lay-out. Ook zijn alle programma's gebaseerd op vaste verhoudingen tussen de oplossingen (Figuur 3 c).
Handmatige voorbereiding van de 4 hoekoplossingen verdient de voorkeur aan geautomatiseerde behandeling van oplossingen bij hoge concentraties die zeer viskeuze kunnen. Relatief snel en accuraat aspiratie/verstrekking is dan mogelijk op de meeste soorten vloeibare handlers met minimumeisen voor optimalisatie van vloeibare klassen. Toch, sommige hoekoplossingen mogelijk nog niet al te visceus voor een robot met een vloeistof-systeem efficiënt kan werken. Daarom hebben we gekozen voor een vloeibare handler met verdringerpomp (figuur 3B).

Naast de 2 lineaire verlopen van concentraties, kan een derde component (dat wil zeggen, een aantal buffers/additieven) met een constante concentratie worden getest in een handige manier. Hiervoor is eerst een relatief grote hoeveelheid een kernset van hoekoplossingen op een voldoende hogere concentratie, met uitzondering van het onderdeel worden gevarieerd, bereid. Vervolgens voorraadoplossingen met inbegrip van dit onderdeel wordt toegevoegd aan de eindconcentraties aanpassen. Bijvoorbeeld zijn 50 mL een reeks van 4 hoekoplossingen bereid bij 10% hogere concentraties dan in eerste instantie. Dit basispakket is vervolgens opgesplitst in 5 kleinere subsets van 4. Tot slot, 10% in volume van verschillende buffer-pH oplossingen wordt toegevoegd aan elke deelverzameling.

4. formaten en soorten additieve schermen

De schermen worden normaal gesproken opgeslagen bij-20 ° C (Figuur 4) omdat ze niet regelmatig worden gebruikt en volatile/unstable verbindingen bevatten. Het gebruik van een bevroren additieve scherm opgeslagen in een diep goed blok (1 mL in putten) moet vroeg worden gepland, omdat het duurt 12-24 hr voor alle additieve oplossingen te volledig ontdooien bij kamertemperatuur. Ook een groot aantal gebruikers delen hetzelfde additief scherm, mogelijk veroorzaakt problemen met inbegrip van kruisbesmetting. Tot slot, de hoogte van diep goed blokken maakt ze ongeschikt voor de meeste nanoliter dispensers. Als een handige oplossing voor het omzeilen van deze kwesties, moet het scherm van het diep goed blok worden overgedragen aan laag-profiel platen (Figuur 4).

Historisch, additieve schermen die een breed scala aan enkele reagentia (met enkele concentraties omvatten) geweest zeer populaire^35,,³⁶. Echter, andere soorten additieve schermen hebben ontwikkeld die mixen van additieven³⁷ of een beperkt aantal één additieven vinden op verschillende concentraties^{38 integreren}. Tenslotte is een aanvullende benadering om te onderzoeken van het effect van additieven op de monsters voorafgaande aan de kristallisatie^39,40.

5. meer overwegingen

Goede praktijken: De meeste schermen schadelijk of zelfs giftige stoffen bevatten en vandaar adequate persoonlijke bescherming moet worden ingezet tijdens de protocollen. Even, bewegende delen van de robots kan leiden tot verwondingen, vooral wanneer het proberen om handmatig een conflict veroorzaakt terwijl een programma wordt uitgevoerd (hoewel de meeste van de robots noodstop/knopsysteem hebben). Vanwege de technische complexiteit betrokken, regelmatige controle van de robots, schermen en programma's met eerder gekenmerkt monsters zijn belangrijk voor de aanhoudende hoge niveaus van reproduceerbaarheid.

Doorvoer: Als een indicatie, tussen 4000 tot 8000 LMB worden platen geproduceerd jaarlijks met het systeem 1 (en vervolgens werknemer door gebruikers voor de eerste screening). Het is niet aangepast aan de voorraad een grote hoeveelheid vooraf ingevulde platen bij 10 ° C wanneer de verwachte omzet veel lager, als na 4-5 maanden, sommige voorwaarden is beginnen zal te verslechteren en verdampen. Verschillende benaderingen van automatisering protocollen zijn doorgevoerd voor kleine tot middelgrote laboratoria⁴¹.

Opslaan en de evaluatie van experimenten: Na de voorbereiding van de druppels, worden platen opgeslagen op de planken van de lage-trillingen in een kamer op 4 of 18 ° C met strak gecontroleerde temperatuur (± 0,5 ° C maximale afwijking). Experimenten worden beoordeeld met behulp van koude licht bron microscopen. Verschillende geautomatiseerde beeldvormingssystemen commercieel beschikbaar zijn, maar men moet alle aspecten zorgvuldig overwegen: de snelheid die is vereist voor het scannen van een plaat zullen volstaan voor hoge doorvoersnelheid? Objecten die geen kristallen verstoort autofocus? De resulterende kwaliteit van beelden voldoende zal zijn om ter plaatse zeer kleine kristallen (met name rond de rand van de druppels)? ^{42 , 43 , 44}

Vergelijking van kristallisatie voorwaarden: Na zorgvuldig onderzoek over de aard van de aanvankelijk verkregen kristallen, kunt een trends en overeenkomsten over voorwaarden gebruik van de LMB scherm database of de C6 Webtool⁴⁵analyseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Robots
Freedom EVO®	Tecan	n/a	Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.
Microlab® STAR™	Hamilton	n/a	Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito®	TTP Labtech	n/a	Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.
Dragonfly®	TTP Labtech	n/a	Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.
Adhesive plate sealer	Brandel	n/a	Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232	Markem-Imaje	n/a	Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1	Hampton Research	HR2-110	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™	Hampton Research	HR2-112	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1	Rigaku	1009530	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2	Rigaku	1009531	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate	Hampton Research	HR2-211	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl	Hampton Research	HR2-217	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™	Hampton Research	HR2-221	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride	Hampton Research	HR2-219	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000	Hampton Research	HR2-213	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD	Hampton Research	HR2-215	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™	Hampton Research	HR2-114	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™	Hampton Research	HR2-126	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™	Hampton Research	HR2-116	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™	Hampton Research	HR2-128	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen	Molecular Dimensions Ltd	n/a	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1	Rigaku	1009536	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2	Rigaku	1009537	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1	JenaBioScience	CS-101L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2	JenaBioScience	CS-102L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3	JenaBioScience	CS-103L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4	JenaBioScience	CS-104L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5	JenaBioScience	CS-105L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6	JenaBioScience	CS-106L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7	JenaBioScience	CS-107L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8	JenaBioScience	CS-108L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9	JenaBioScience	CS-109L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10	JenaBioScience	CS-110L	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5	Molecular Dimensions Ltd	MD1-16LMB	Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2