Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55792

⸱

20 september 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Immunolabeling methoden voor het analyseren van verschillende populaties van microtubuli in de ontwikkelende hersenen van de zebravis zijn hier beschreven, die over het algemeen van toepassing zijn op andere weefsels. Het eerste protocol schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling stabiele en dynamische microtubuli. Het tweede protocol biedt een methode om beeld en kwantificeren van ontluikende microtubuli specifiek.

Samenvatting

Microtubuli (MTs) zijn dynamisch en broos structuren die uitdagend om te afbeelding in vivo, met name in gewervelde embryo's zijn. Immunolabeling methoden worden hier beschreven om te analyseren verschillende populaties van MTs in de ontwikkelingslanden neurale buis van de zebravis embryo. Terwijl de nadruk op zenuwweefsel ligt, geldt deze methode in grote lijnen voor andere weefsels. De procedures zijn geoptimaliseerd voor vroeg tot midden-somitogenesis-fase embryo's (1 Somiet tot 12 somieten), maar ze aangepast aan een scala aan andere etappes met relatief kleine aanpassingen worden kunnen. Het eerste protocol biedt een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke spreiding van stabiele en dynamische MTs en een kwantitatieve analyse van deze populaties met beeld-verwerkende software uit te voeren. Deze aanpak vormt een aanvulling op bestaande hulpprogramma's voor afbeelding microtubulus dynamiek en distributie in real-time, met behulp van transgene lijnen of voorbijgaande uitdrukking van tagged constructies. Inderdaad, dergelijke hulpmiddelen zijn zeer nuttig, maar ze maken geen gemakkelijk onderscheid tussen dynamische en stabiele MTs. De mogelijkheid om beeld en analyseren van de populaties van deze verschillende microtubulus heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van mechanismen ten grondslag liggen aan de cel polarisatie en voedselproductie. Het tweede protocol schetst een techniek voor het analyseren van ontluikende MTs specifiek. Dit wordt bereikt door het vastleggen van de DOVO groei eigenschappen van MTs na verloop van tijd na microtubulus depolymerization met de nocodazole van de drug en een herstelperiode na drug wassen. Deze techniek heeft nog niet vereffend op de studie van MTs in zebrafish embryo's, maar is een waardevolle assay voor het onderzoeken van de functie in vivo van eiwitten die betrokken zijn bij de vergadering van de microtubuli.

Inleiding

Microtubuli (MTs) zijn polymeren van α - en β-tubuline dat tot lineaire protofilaments samenvoegen, waarvan er verscheidene combineren om te vormen van een holle buis1,2. MTs zijn gepolariseerde structuren, met snelgroeiende plus uiteinden en langzaam groeiende minus uiteinden die zijn verankerd in de centrosoom of andere microtubulus-organiseren center (MTOC)3. DOVO MT vorming wordt geïnitieerd door nucleatie op de complexe γ-tubuline-ring (γ-TURC), waarmee een sjabloon voor MT vergadering4. In een bepaalde cel kunnen twee populaties van MTs worden onderscheiden die draaien tegen verschillende tarieven. Dynamische MTs verkennen hun cellulaire omgeving door te schakelen tussen de fasen van groei en krimp in een proces dat bekend staat als dynamische instabiliteit5. In tegenstelling tot dynamische MTs, stabiele MTs zijn niet-groeiende en hebben een langere halfwaardetijd dan dynamische MTs6.

Decennia van onderzoek in de celbiologie heeft geboden een verfijnde allerlei tools om te studeren MT structuur en functie en resulteerde in een grote hoeveelheid kennis over deze cytoskeletal elementen. Bijvoorbeeld, MTs spelen een centrale rol bij de totstandbrenging en het onderhoud van de polariteit van de cel, die toe te schrijven niet alleen aan hun intrinsieke polariteit, maar ook voor de differentiële subcellular verdeling van stabiel versus dynamische MTs7, is 8. daarentegen veel minder is begrepen over MT architectuur en functie in meer complexe driedimensionale (3-D) omgevingen, zoals het gewervelde embryo, gedeeltelijk als gevolg van de uitdaging van het cytoskelet van de MT op hoge resolutie beeldvormende. Niettegenstaande deze beperking, de recente generatie GFP-uiting te geven aan transgene lijnen dat label MTs of voorbijgaande expressie van fluorescently-tagged MT markers toegenomen ons begrip van de dynamische veranderingen die MTs ondergaan en hun cellulaire en Developmental rol in de zebravis embryo. Het hele MT-netwerk kan worden beeld in transgene lijnen in welke tubuline is ofwel rechtstreeks gelabelde9 of tubuline polymeren niet indirect worden aangeduid met behulp van MT-geassocieerde eiwitten Doublecortin-like-kinase (Dclk) of Ensconsin (EMTB)10, 11. Andere lijnen (en constructies) zijn gegenereerd die beoordeling van MT intrinsieke polariteit inschakelen door specifiek labeling MT plus eindigt of centrosoom-verankerd minus uiteinden11,12,13, 14. de kracht van deze tools ligt in de mogelijkheid te bestuderen van MT dynamiek in leven, ontwikkeling van organismen. Dergelijke studies is gebleken dat, bijvoorbeeld, de ruimtelijke en dynamische verdeling van MTs in specifieke cel populaties, de oriëntatie van de mitotische spindles in weefsels morfogenese (een indicator van het vliegtuig van celdeling), ondergaan de polariteit van het MT-polymeer met betrekking tot processen zoals cel rek en migratie, en MT groeitempo op jaarbasis bepaald door komeet snelheid9,13,15. De beperking van deze tools is dat ze niet gemakkelijk tussen stabiele en dynamische MT populaties discrimineren.

Tekening uit de rijke cel biologie literatuur, worden immunolabeling methoden om het imago van stabiele en dynamische MTs in de zebravis embryo hier beschreven, die zijn een aanvulling op het gebruik van transgene lijnen. Het wijdverbreide gebruik van dergelijke methodes van de immunolabeling in de zebravis enigszins belemmerd door de moeilijkheid in het MT integriteit behouden tijdens de procedure fixatie. Protocol 1 schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling totaal, dynamische, en stabiele MTs in grensoverschrijdende secties van de ontwikkelingslanden zebrafish hindbrain. Bovendien, een eenvoudige methode met behulp van commercieel beschikbare software wordt beschreven om het kwantificeren van de populaties van deze MT. Stabiele MTs onderscheiden zich van dynamische MTs gebaseerd op verschillende posttranslationele modificaties van α-tubuline, zoals acetylation en detyrosination, die op stabiele MTs in de tijd16,17 accumuleren. In het embryo van de zebravis, vindt acetylation plaats op Ciliaire en axonale MTs maar niet op stabiele interfase MTs18, beperking van het nut van deze markering tot een subset van gestabiliseerde MTs. Daarentegen lijkt detyrosination optreden op alle stabiele MTs in de zebravis embryo18. Deze posttranslationele wijziging blootstelt de glutaminezuur carboxy-terminal van α-tubuline (detyrosinated tubuline)18 en kan worden opgespoord met behulp van anti-Glu-tubuline19. Hoewel detyrosination bij voorkeur op stabiele MTs plaatsvindt, experimenteel bewijs geeft aan dat deze posttranslationele wijziging een gevolg van, in plaats van een doodsoorzaak, MT stabiliteit16. De wederzijdse MT bevolking, samengesteld uit dynamische MTs, onderscheidt zich met behulp van een antilichaam, anti-Tyr-tubuline, die specifiek de tyrosinated vorm van α-tubuline19herkent. Na immunolabeling met deze markeringen en confocal beeldvorming, de kwantitatieve analyse van MTs (lengte, aantal en relatieve overvloed) kan worden uitgevoerd in bepaalde regio's van de ontwikkeling van de neurale buis. Een gestroomlijnde methode is hier geboden voor het uitvoeren van deze analyse met behulp van 3D-beeldverwerking software. Deze methode kan worden toegepast om vragen te stellen met betrekking tot voedselproductie en de inrichting of de rijping van cel polariteit20. Inderdaad, de uitwerking van gepolariseerde arrays van stabiele MTs begeleidt veel developmental evenementen, waaronder fotoreceptor morfogenese21, epithelialization van cellen in de ontwikkelingslanden neurale buis18 en axon vorming8.

Protocol 2 beschrijft een in vivo -bewerking van een cel biologie assay voor het analyseren van MTs tijdens hun vergadering fase (nucleatie/anchorage en groei)22,23. Ontluikende MTs zijn nucleated op de centrosoom en vervolgens verankerd aan de subdistal aanhangsels van de moeder centriool23. Een methode voor het analyseren van de ontluikende MT hergroei na depolymerization wordt beschreven. Dit protocol bevat details over de behandeling van de nocodazole aan de depolymerize van MTs, de drug washout-procedure en de herstelperiode na de behandeling. MT uitgroei is gecontroleerd op regelmatige intervals post wassen door immunolabeling met markeringen voor totale MTs (anti β-tubuline) naast markers voor het centrosoom (anti γ-tubuline) en kern (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), volgens de algemene procedures beschreven in Protocol 1. De MT depolymerization stap van dit protocol is essentieel omdat hierdoor beoordeling van DOVO MT groei en uitbreiding van bestaande MTs niet. Deze techniek verschilt dus van andere gepubliceerde procedures voor het meten van MT groeicijfers (in afwezigheid van depolymerization) met behulp van een plus tip marker zoals einde bindende eiwit 3 gesmolten tot groen fluorescent proteïne (EB3-GFP), zoals in Tran et al., 201211. Bovendien, deze bepaling is met name handig voor het analyseren van de embryo's met gebreken in DOVO MT vergadering, zoals de eerder gemelde NEDD1 mutanten waarin rekrutering van γ-tubuline tot de centrosoom bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat resulteert in onvolledige de formatie van de neurale buis en neuronale gebreken24.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

ethische verklaring: de procedures beschreven hieronder volgen de Universiteit van Maryland Baltimore County dierenverzorgers richtsnoeren.

1. analyse van stabiele en dynamische MTs met behulp van Immunolabeling (Protocol 1)

  1. Manual dechorionation van embryo's voorafgaand aan de fixatie
    1. verkrijgen voortgebracht vers embryo's door gieten uit overtollige systeem water en vervolgens resterende embryo's te verzamelen in een plastic petrischaal (Zie Tabel of Materials).
    2. Verwijderen puin van het systeem water en overdracht van embryo's naar een nieuwe schotel gevuld met embryo medium (Zie Tabel van materialen) om ervoor te zorgen dat de embryo's in een schone omgeving ontwikkelen.
    3. Laten de embryo's te ontwikkelen naar het gewenste werkgebied in een temperatuurgevoelig incubator op 28,5 ° C.
    4. Plaats embryo's jonger dan 24 h na bevruchting (hpf) in een glazen schaal vóór dechorionation.
      Opmerking: Dechorionate embryo's voorafgaand aan de fixatie te maximaliseren snelle penetratie van de fixeer en behouden MT-integriteit. Gebruik medium van het embryo in plaats van systeem water zodat de extra Ca 2 + vereist tijdens dechorionation.
      5. De chorions verwijderen
    5. handmatig van embryo's in de petrischaal, met behulp van fijne pincet onder een Microscoop ontleden.
      1. Een klein gebied in de ronde, transparante chorion die het embryo met een paar pincet en zachtjes trekken pincet uit elkaar omsluit aan het maken van een breuk in het membraan van knijpen.
      2. Vergroten de opening door fijn nieuwsgierige op de gescheurde chorion met pincet. Wees voorzichtig niet te raken van het embryo met de verlostang als het kon scheuren.
  2. Fixatie van gefaseerde embryo's
    1. overdracht geënsceneerd, dechorionated embryo's 1,5 mL centrifuge buizen. Verwijder zo veel embryo medium mogelijk met behulp van een glazen pipet van Pasteur.
      Opmerking: Fixatie en drug behandelingen op embryo's young (midden-somitogenesis), voorafgaand aan de vorming van de neurale centra bemiddelen pijn sensatie, waarvoor geen additonal procedure om pijn te verlichten tijdens euthanasie uitvoeren. Ontwikkelingsstadia zijn zoals gedefinieerd in Kimmel et al.., 1995 25. De 4-5 en 11-12 Somiet fasen werden gebruikt voor het verkrijgen van beelden voor figuren 2 en 3.
    2. Bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) /MT vergadering buffer (MAB) fixatief (Zie Tabel van materialen) door het combineren van 1 mL 8% PFA per 1 mL 2 X MAB en het toevoegen van 2 µL 100% Triton X-100 per totale volume 1 mL.
      Let op: Draag handschoenen tijdens het verwerken van oplossingen die PFA en Triton X-100, die huid irriterende stoffen zijn bevatten.
    3. Fix embryo's in 1 mL 4% PFA/MAB fixeerspray voor 5 min op 28,5 ° C. Aspirate de fixeer met een pipet, vervangen door 1 mL verse fixeer en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) op een rocker.
      Opmerking: Monsters moeten worden vastgesteld snel bij hun biologische temperatuur (28,5 ° C voor zebravis) om te voorkomen dat de temperatuur-afhankelijke MT depolymerization.
  3. Gecombineerd fixeer en voeg 1 mL 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met NP40 (TBS-NP40) buffer. Zachtjes doorroeren op RT op een rocker drie keer voor elke 5 min. Opslaan van de embryo's bij 4 ° C in 1 mL vers 1 X TBS-NP40 voor niet meer dan 7 dagen.
    Let op: Draag handschoenen bij het verwerken van oplossingen met NP-40, een huid irriterende.
  4. Sectioning embryo's voor immunolabeling
    1. Heat RT 4% lage smeltpunt (LMP) agarose medium insluiten in een ongeopende verpakking totdat de oplossing wordt duidelijk met een warmhoudplaat ingesteld op 50 ° C geplaatst dichtbij een ontleden Microscoop . Houd de container gesloten tussen monsters en verwarmd tijdens het hele proces insluiten (stappen 1.4.4-1.4.6).
    2. Overdracht embryo's uit de 1,5 mL Centrifugeer buizen naar een petrischaal met behulp van een precisiepipet glas en vul deze met 1 X TBS-NP40.
    3. Verwijder de grote dooier cellen uit de somitogenesis fase embryo's (4-5 en 11-12 somieten) in de petrischaal met fijne pincet onder de vergroting van een ontleden Microscoop 26. Houd het embryo door de staart bud met een paar pincet en schil weg de cellen van de dooier met het andere paar oog op het behoud van het hindbrain weefsel. De de-yolked embryo's overbrengen in een gebied van de petrischaal vrij van vuil van de dooier.
      Opmerking: Het insluiten van embryo's in de agarose gevulde mal individueel om te voorkomen dat vroegtijdige verharding van de LMP agarose.
    4. Vulling een 12 x 5 mm x 3 mm goed van de vectorafbeeldingsbestanden schimmel met 200 µL gesmolten LMP agarose met behulp van een micropipet. Het uitvoeren van de stappen 1.4.5.-1.4.6. snel (binnen 20 s van de mal vullen) embryo insluiten voordat de LMP agarose aan RT afkoelt en stolt.
    5. Fijne pincet gebruiken om een de-yolked embryo door de tailbud van de petrischaal naar de agarose gevulde mal richting de taps toelopende einde onder een Microscoop ontleden.
    6. Gebruik fijne pincet om te oriënteren van het embryo in de mal, zodanig dat de vibratome in het gewenste vlak snijdt. Transversale secties maken door het oriënteren van het embryo, zodat het hindbrain weefsel loopt parallel aan de lengte van de schimmel met de dorsale oppervlak tegenover de rand en de gerichte het einde taps toelopende regio anterior oppervlak. Herhaal stappen 1.4.4-1.4.6 voor de resterende embryo.
    7. Toestaan het agarose insluiten om te stollen voor 5 min op RT.
    8. Genereren 40 µm secties van de langste as van het agarose ingesloten embryo's (stappen 1.4.1-1.4.7) met behulp van een vibratome met de vectorafbeeldingsbestanden schotel gevuld met 1 x TBS-NP40. Secties van belang overbrengen in een 24-well plaat in 500 µL 1 x TBS-NP40 met fijne pincet. Plaats van de secties van slechts één embryo per putje.
      Nota: Verwijs om te verwijzen naar 18 voor meer informatie. Erop toezien dat secties gehydrateerd op alle tijden in ten minste 250 µL van buffer en rock bij lage snelheid (10-25 rpm) voor de resterende stappen blijven om te voorkomen dat de scheiding van het agarose insluiten. Detergentia presenteren het tijdelijk blokkeren en wassen oplossingen moeten verlagen de oppervlaktespanning van de vloeistof en onderdompeling van de secties. Controleer of secties in de putten tijdens en na alle manipulaties blijven. Wees voorzichtig om te voorkomen dat per ongeluk teruggooi secties tijdens wasbeurten.
  5. Verwijderen van de buffer en voeg 500 µL van het blokkeren van de oplossing. Rock gedurende ten minste 1 uur op RT.
    Opmerking: Gebruik een blokkerende oplossing die bevat 5% sera uit de host-soort van elke secundair antilichaam worden gebruikt (Zie Tabel of Materials).
  6. Incubate in 300 µL primaire antilichamen verdund in blokkeerbuffer voor 36-72 uur bij 4 ° C op een rocker. Wassen tweemaal in 600 µL 1 x TBS-NP40 op een rocker voor 30 minuten elk, op RT.
    Opmerking: Double-label secties door broeden in primaire antilichamen tegen totale MTs (anti β-tubuline of anti-α-tubuline) en stabiele MTs (anti-Glu-tubuline) of dynamische MTs (anti-Tyr tubuline). Selecteer primaire antilichamen die naar voren zijn gebracht in andere host soorten als α-tubuline populaties dubbele etikettering voor totaal en post-translationally gewijzigd. Raadpleeg Tabel van materialen voor antilichaam verdunningen.
  7. Incubate in 300 µL van fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in blokkeerbuffer op een rocker voor 16-24 uur, bij 4 ° C in het donker. Wassen tweemaal in 600 µL 1 x TBS-NP40 op een rocker voor 30 minuten elk, op RT.
    Opmerking: Wrap de multi goed schotel met secundair antilichaam in folie vanaf dit moment en na elke manipulatie om te voorkomen dat het blussen. Selecteer secundaire antilichamen die met de host-immunoglobuline van het primaire antilichaam reageren. Kies secundair antilichaam fluorophores moeten afzonderlijke, niet-overlappende emissie spectra. Raadpleeg Tabel van materialen voor antilichaam verdunningen.
  8. Broeden de embryo's 500 µL van DAPI oplossing op een rocker gedurende 30 minuten, bij RT. Wash driemaal in TBS-NP40 schommelen op RT voor elke 5 min.
    Opmerking: Nucleaire labeling biedt cellulaire context voor de kwantificering van de MT uitgevoerd in stap 1.12.
  9. Breng een druppel van montage medium met anti-fade agent in het midden van een dia stofvrij. Gebruik fijne pincet secties overbrengen naar de montage middellange druppel. Plaats een stofvrije dekglaasje aan op de top van het monster. Dia's opslaan in een droge, donkere en koele plek, verpakt in folie, totdat imaging wordt uitgevoerd.
    Opmerking: Cirkelen de secties aan de achterkant van de dia met behulp van een schone-tipped permanent marker vóór imaging zal helpen om te identificeren secties bij het gebruik van de Microscoop.
  10. Confocal Imaging
    1. Mount secties op een omgekeerde laser confocal microscoop scannen door het aanbrengen van de dia naar het werkgebied met het dekglaasje aan geconfronteerd met de doelstelling. Bepalen van de juiste optica (doelstelling, laser en de montages van het kanaal, zoals krijgen en gecompenseerd) op de dia van een besturingselement en houd ze consistente tussen monsters 27. Te voorkomen dat de pixels om gegevensverlies te voorkomen oversaturating.
    2. Z-stacks confocal beelden met behulp van de montages van het kanaal voor de geselecteerde secundair antilichaam fluorophores vastleggen en opslaan van de afbeelding bestanden 27. Z-stacks voor elke sectie verwerven.
      Opmerking: De gehanteerde parameters voor de beelden in de figuren 2 en 3 verkrijgen met behulp van de volgende overname-instellingen repliceren: modus = XYZ; objectieve vergroting = 63 X olie-immersie objectief; objectieve numerieke diafragma = 1.4; Z-stap = 0.1 µm; Z-diepte = 16.23 µm. Gebruik de volgende montages van het kanaal: DAPI excitatie met 20% UV-range laser, emissie filter bereik = 430-480 nm, fotomultiplicator (PMT) winst = 525 V, en bet offset =-1.72%; 448 nm fluorophore (Zie Tabel van materialen) excitatie met 20% 488 laser bij de nm, emissie filter bereik = 493-573 nm, bet winst = 689 V, en bet offset = -0,2%; 594 nm fluorophore excitatie met 32% 594 laser bij de nm, emissie filter bereik = 608-706 nm, bet winst = 768 V, en bet offset =-6.8%.
    3. Ruwe databestanden opslaan met unieke, beschrijvende bestandsnamen en een kopie voor bewerking in de software van de analyse van de afbeelding maken.
  11. Compilatie van Z-stacks voor het weergeven van maximale prognoses
    1. openen van het kopiëren van bestanden van gegevens met behulp van publieke domein 3D-afbeelding analysesoftware (bijvoorbeeld ImageJ). Controleer elk kanaal wordt weergegeven als een reeks afzonderlijke afbeeldingen (Z-stacks).
    2. Afbeelding kanalen splitsen met behulp van de volgende menu-reeks: “ beelden/kleur/Split kanalen ”.
    3. Maakt een samengevoegde afbeelding door te bedekken de kanalen van belang met behulp van de volgende menu-reeks: " beelden/kleur/Merge kanalen. " Selecteer de 594 nm, 488 nm en DAPI kanalen als valse rood, groen en blauw, respectievelijk. Controleer " maken composiet " en selecteer " OK " 28.
      Opmerking: De DAPI kanaal te brengen beter detail specifiek voor MTs in een maximale projectie zoals in Figuur 2 en 3, door alleen valse kleuren voor de andere twee kanalen selecteren weglaten.
    4. Onderzoekt de samengevoegde Z-stack en noteer de begin- en eindposities van de innerlijke beste Z-vliegtuigen voor alle zichtbare kanalen. Ontslaan de buitenste Z-vliegtuigen, die meestal suboptimaal signaal als gevolg van de ongelijke oppervlakken van de sectie hebben. Als u verwijst naar de 29 voor meer informatie verwijzen.
    5. Visualiseren de samengevoegde Z-stack als een enkele 2-D-afbeelding door het uitvoeren van een projectie van maximale intensiteit van de Z-stack met behulp van de volgende reeks van 3D-afbeeldingen analyse menu: " beelden/Stack/Z-project. " invoeren van de begin- en eindpositie van de innerlijke beste Z-vliegtuigen vanaf stap 1.11.3 als de " Start segment " en " Stop segment, " respectievelijk. Selecteer " Max intensiteit " als de projectie type en klik op " OK ". Als u verwijst naar 28 voor meer details verwijzen.
  12. Analyseren MT labeling
    1. de commerciële 3D-afbeelding analysesoftware niet openen. Selecteer " bibliotheek maken " en bieden een beschrijvende naam voor de beeldbank. Klik op " maken. " sleept u raw-afbeeldingsbestanden gegenereerd op basis van de confocal microscoop in de bibliotheek. Grotere bestanden meer tijd nodig om te overdracht.
    2. Selecteer een bestand om te analyseren. Kies " uitgebreid Focus " van de " weergave " menu om het beeld kanaal-samengevoegd in het hoofdvenster.
      3. De drempelmethode aanpassen
    3. door te slepen van de tool van de schuifregelaar voor elk kanaal naar links of naar rechts totdat de achtergrond signaal wordt verminderd en het ware signaal robuust is. Observeren dat elk kanaal geeft een ware signaal voor het molecuul aangeduid (b.v., DAPI kanaal tonen langwerpige of mitotische kernen maar niet auto-fluorescentie van het cytoplasma of agarose).
    4. Selecteer de " Freehand regio van belang (ROI) " gereedschap en een overzicht van de regio van belang om te worden geanalyseerd. Selecteer de " acties " tabblad gevolgd door " gewas aan selectie " bijsnijden van de afbeelding. Sla het bestand van de bijgesneden afbeelding onder een nieuwe naam. Klik op de " metingen " tabblad maken het protocol voor het filteren van specifieke objecten die relevant zijn voor de 3-D analyse.
    5. Drag " objecten vinden " naar het protocol-venster. Naam van het eerste protocol " DAPI. " Selecteer de DAPI-kanaal in het dropdownmenu. De volgende instellingen bij het protocol van de DAPI Sleep en plaats ze hieronder " objecten vinden " in de volgende volgorde (tabel 1): " vullen gaten in de ObjectsŔ " Aparte ObjectsŔ aan te raken " Uitsluiten objecten door SizeŔ " Uitsluiten niet aanraken van ROIs ".
      Opmerking: Het doel van de instellingen in tabel 1 moeten eerst een drempel vaststellen die signalen om de teruggooi waarvan de distributie en grootte in strijd zijn met de grootte van objecten worden geanalyseerd. Bijvoorbeeld, een signaal niet groot genoeg om een kern te wanneer tellen kernen elimineren.
    6. Uitvoeren de volgorde (stap 1.12.9) te monteren de resterende filters voor β-tubuline en andere markeringen met de instellingen in tabel 1.
    7. Selecteer " maatregel " aan de onderkant van elk protocol. Kies " intensiteit en volumemeting " en " skelet lengte " voor alle tubuline labeling, maar alleen de voormalige voor het signaal van de DAPI.
    8. Tekent een ROI rond de regio te meten. Observeren van de metingen onder de " samenvatting " tab nadat de software de regio verwerkt. De gegevens kopiëren en deze opslaan op een werkbare spreadsheet, zoals in tabel 2. Maak een back-up van het werkblad voor een latere anayse.
    9. Selecteer metingen van belang (bijvoorbeeld lengte van MT bundel, aantal MT bundels/kern, zoals geopenbaard met verschillende markeringen) in het werkblad en analyseren om te bepalen van de gemiddelden voor elke groep.
      Opmerking: De gemiddelde MT bundel lengte = de som van het ' skelet lengte voor β-tubuline betekenen ' voor elk embryo gedeeld door het totale aantal embryo's. Verwijzen naar rij 20 van tabel 2. Het werkblad zodat de variabelen en experimentele groepen zijn gemakkelijk opgenomen in een grafiek opmaken.

2. DOVO MT vergadering Assay (Protocol 2)

  1. Construct en test de multi goed doorstroom toestellen ( Figuur 1) 2 dagen voorafgaand aan het experiment.
    Opmerking: Het apparaat kunt gelijktijdige wegspoeling van meerdere experimentele groepen na de nocodazole behandeling met behulp van leveranties uit Tabel van materialen. Siliconen sealer vereist ten minste 24 uur van droogtijd voordat het vormt geen risico van toxiciteit voor het embryo's.
    1. Een centrifugebuis 50 mL in tweeën te splitsen in de lengte, met behulp van een mal of lintzaag.
    2. Cut 7 halve cirkels, met een straal van 3 cm, uit 70 µm nylon gaas en trim laten passen strak in één helft van de splitsing Centrifugeer buis. Lijm de halve cirkels in de centrifugebuis parallel aan de 10 mL gradatie markeringen met behulp van aquarium-safe silicon sealer. Het apparaat te drogen voor 2 dagen en spoel door inweken in een bekerglas water voor 2-3 h.
    3. Lijn van de bovenste (schroefdraad) uiteinde van de centrifugebuis gesneden met het modelleren van klei, zodanig dat de hoogte van de vloeistof bewaard in de doorstroom apparaat een diepte van ¼ inch ( Figuur 1, 2 en 3 heeft).
    4. Bereid het wassen-apparaat door het verwijderen van de zuiger van een 50 mL injectiespuit en invoegen van 12 inch van fijne buizen in de tip. Duw de buis in zover het zal gaan en afdichting rond het gewricht met behulp van modellering klei.
    5. Natte vooraf de Maas embryo medium gebruik zodat de vloeistof om het gehele doorstroom apparaat te doorlopen. Hoek het apparaat op het ijs, zodat die vloeistof in alle compartimenten maar toch zwembaden leegt uit de voorkant waar de rand van de klei zich bevindt. Met behulp van een ring-tribune, schorten het wassen apparaat boven het apparaat doorstroming op ijs ( Figuur 1).
    6. Chill 200 mL van embryo medium op ijs en giet genoeg op het wassen apparaat om ervoor te zorgen dat alle luchtbellen zijn uitgeschakeld en dat het debiet ongeveer 7 mL/min. het debiet aanpassen is door het veranderen van de hoogte van de injectiespuit.
  2. Enzymatisch dechorionate embryo's
    1. Maak een werkoplossing van aspecifieke protease door verder verdunnen 1 mL 10 mg/mL aspecifieke protease voorraad in 20 mL embryo middellange.
    2. De chemische dechorionation uitvoeren op embryo's 1 uur vóór het timepoint wanneer ze worden verwacht om de gewenste ontwikkelings fase te bereiken. Digest chorions door het verwijderen van embryo medium van 100 mm petrischalen met geënsceneerd embryo's en het toevoegen van 20 mL van de werkoplossing aspecifieke protease.
    3. Incubate embryo's bij 37 ° C gedurende 5 minuten
      Opmerking: Niet meer bedragen dan 5 min of gebruik een hogere concentratie van aspecifieke protease oplossing, aangezien dit zal resulteren in de embryo's vallen uit elkaar eenmaal behandeld met nocodazole.
    4. Snel Pipetteer uit aspecifieke protease en bijvullen van de gerechten met ongeveer 25 mL embryo medium. Eenmaal herhaald.
    5. Met behulp van een 1-mL glazen pipet, overdracht embryo's jonger dan 24 hpf aan glas gerechten om hen te beschermen tegen schade.
    6. Complete dechorionation door het handmatig verwijderen van chorions met behulp van een paar fijne pincet, zoals beschreven in stap 1.1.5.
    7. Plaatsen van glas petrischalen met embryo's die dechorionated in een incubator 28,5 ° C gedurende ten minste 30 minuten tot ze de gewenste ontwikkelingsstadium.
  3. Depolymerize de bestaande MTs
    1. bereiden een werkende oplossing van 5 µg/mL nocodazole door het combineren van 50 µL 1 mg/mL voorraad nocodazole met 10 mL ijs koud embryo medium.
      Let op: Gebruik handschoenen bij het verwerken van nocodazole, een huid irriterende.
    2. Wisselen het embryo medium van de nocodazole behandelde groep met 10 mL koude nocodazole werken. Plaats petrischalen op ijs voor een geschikte tijd voor de ontwikkelings fase (bijvoorbeeld, 1 h voor 4-5 Somiet embryo's). Onbehandeld controlegewas embryo's in een petrischaal gereserveerd op ijs vast te stellen naast wassen monsters in stap 2.3.4.1.
    3. Overdracht embryo's met behulp van een precisiepipet spiegelglas van 1 mL brand het doorstroom apparaat, met aparte vakken voor elke experimentele groep. Start de nocodazole wassen door gieten ijs koud embryo medium in de top van de spuit 50 mL.
      Opmerking: Gebruik ten minste 30 embryo's per experimentele groep. Experimentele groepen kon bestaan uit controle embryo's of een verscheidenheid van morfolino of RNA-geïnjecteerd embryo's. Het wassen vereist een totaal van ongeveer 150 mL van embryo medium moet worden toegevoegd elke 8-10 min. wassen de nocodazole terwijl het voortdurend voor de remming van de groei van de MT met ijs. Houden van de embryo's op ijs is van essentieel belang voor het welslagen van deze test omdat MTs unstable bij koude temperaturen en koude de ontwikkeling in vroege embryo's vertraagt.
    4. Toestaan MTs te regrow na 20 min van wassen op RT door overdracht van embryo's naar glas petrischalen met warm (28,5 ° C) embryo medium gebruik een brand gepolijst 1 mL glazen pipet. Zodra de embryo's worden overgedragen, start een timer.
      1. Fix van de embryo's controle- en wassen op 1 min, 5 min en 10 min door ongeveer 10 embryo's pipetteren in een 1,5 mL Centrifugeer buis gevuld met 1 mL 4% PFA/MAB fix (28,5 ° C) en volg de aanwijzingen in stap 1.2.3.
  4. Voorbereiding van monsters voor immunolabeling zoals beschreven in 1.3-1.5 afdelingen.
  5. Immunolabel zwevende secties en afbeelding embryo's als beschreven in secties 1.6-1.10 met de volgende wijzigingen aan de specificaties van het primaire antilichaam: gebruik 1:500 konijn anti-γ-tubuline en 1:200 muis anti-β-tubuline.
  6. Proces en analyseren van beelden met behulp van de software van de analyse van de 3D-afbeelding, zoals beschreven in stap 1.12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Analyse van stabiele en dynamische MTs met behulp van immunolabeling
In Protocol 1, wordt de verdeling van de MT subpopulatie tijdens de vroege (neurale Kiel) en late (neurale rod) stadia van ontwikkeling van de neurale buis onthuld, met behulp van Glu-tubuline en Tyr-tubuline als markeringen voor stabiele en dynamische MTs, respectievelijk. Dynamische MTs overheersen in de hindbrain de neurale Kiel stadium (4-5 somieten) (Figuur 2...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn momenteel vele methoden voor imaging-MT dynamiek in de vroege ontwikkeling van de zebravis, variërend van levende beeldvorming van tagged moleculen tot immunolabeling van vaste weefsel11,12,13,14. Hoewel MTs in één cel kunnen bestaan in dynamische of stabiele staten, is epithelialization een proces waarin de MTs is geleidelijk gestabiliseerd na verloop van tijd. Met behulp van merkers v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De confocal microscoop werd gekocht met geld van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF), subsidie #DBI-0722569. Het onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse nationale instituten van gezondheid/nationale Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) subsidie #GM085290 en Amerikaanse departement van defensie (DOD) subsidie #W81XWH-16-1-0466 toegekend aan R.M. Brewster. E. Vital werd gesteund door een subsidie naar UMBC van het Howard Hughes Medical Institute via de pre college en Undergraduate Science Education Program, verlenen van #52008090. S.P. Brown werd ondersteund door een Amerikaanse departement van onderwijs GAANN Fellowship, een Meyerhoff Graduate Fellowship gefinancierd door subsidie van het NIH/NIGMS, #GM055036, en een onderzoek assistentschap gefinancierd door de V.S. DOD subsidie #W81XWH-16-1-0466.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseWordt gebruikt om petrischalen te behandelen.   Bereid 1% agarose
door een oplossing van  1 gram agarose per 100 ml 1X embryomedium in een magnetron te verwarmen
tot polymerisatie. 
KpipesSigmaP7643
NaClSigmaS7653
Tris-HClSigmaT3253-500G
KClSigmaP9333-500G
CaCl2·2H2OSigmaC5080
NP-40American BioanalyticalsAB01424
EGTASigmaE3889-25G
MgCl2SigmaM2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)FisherBP1605
Triton-xAmerican BioanalyticalsAB02025
Anti-Fade mounting mediumInvitrogenP10144
Muis anti-β-tubulinDevelopmental studies Hybridoma BankE71/200
Konijn anti-γ-tubulinGenetexGTX1132861/500
Konijn anti-α-tubulinGenetexGTX1087841/1000*
Konijn anti-detyrosinated-tubulinMilliporeAB32011/200-1/1000*  Titrateer antilichaam bij eerste gebruik van nieuwe partij.
Konijn anti-tyrosinated-tubulinMilliporeABT1711/500
Muis anti-centrinMillipore04-16241/1000
Geit 488 anti-konijnThermofisherA110081/500
Geit 594 anti-konijnThermofisherA110121/500
Geit 594 anti-muisThermofisherA110051/500
Geit 488 anti-muisThermofisherA110011/500
VibratomeVibratome1500
PincetWorld Precision Instruments555227F
100 mm petrischaalCell treat229693
35 mm petrischaalCell treat229638
50 ml falconbuisFisher14-432-22
Gevlochten nylon gaas 70 umAmazon.comB0043D1SZG 
MicropipetGilsonF123602
Glazen pipetFisherNC-999363-9
Aquarium sealantAmazon.com, door MarineLandSilicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring standFisher14-675BO
Microbore PTFE buis, 0,022"IDCole-ParmerWU-06417-21
ModelleerkleiAmazon.comSargent Art 22-4000Elke was of olie gebaseerde niet-giftige modelleerklei is voldoende
KlemFisher02-215-466
60ml spuitFisher14-820-11
Embryomedium (E3)34,8 g NaCl
1,6 g KCl
5,8 g CaCl2·2H2O
9,78 g MgCl2·6H2O

Om een 60X stockoplossing te bereiden, lost u de ingrediënten in H2O op, tot een eindvolume van 2 L. Pas de pH aan tot 7,2 met NaOH. Autoclaveer. Om 1X medium te bereiden, verdunt u 16,5 mL van de 60X stockoplossing tot 1 L. 
Blocking oplossing50 ml TBS-NP-40
2,5 ml normaal geitenserum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7,6)155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0,1% NP-40
2x MAB (pH6,4)160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commerciële 3-D beeldverwerkingssoftwarePerkinElmerVolocity (V 6,2)
Dry block verwarmer VWR12621-108Wordt gebruikt als een hot plate om agarose in Protocol 1 te smelten.
DissectiemicroscoopLeicaMZ12
Confocale microscoopLeicaSP5
Vlakke inbeddingsvormemsdiasum.comBEEM 70904-01
Public domain beeldverwerkingssoftwareNIHImageJ (V 1,5)
* Het resultaat varieert per partijnummer

Referenties

  1. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
  2. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
  4. Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
  5. Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
  6. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
  7. Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
  8. Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
  9. Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
  10. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
  11. Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
  12. Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
  13. Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  14. Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
  15. Lee, S. -J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
  16. Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
  17. Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
  18. Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
  19. Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
  20. Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1(2016).
  21. Nam, S. -C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
  22. Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
  23. Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
  24. Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  27. FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
  28. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010).
  29. Z-functions - ImageJ. , Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Microtubulisanalysestabiele microtubulidynamische microtubulinocodazol uitspoelingconfocale beeldvormingImageJ analysetubuline markers
Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.