Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

Rebecca J. McFarland; Sharlene P. Brown; Eudorah Vital; Jonathan M. Werner; Rachel M. Brewster

doi:10.3791/55792

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55792

⸱

20 september 2017

Rebecca J. McFarland^*¹ , Sharlene P. Brown^*¹ , Eudorah Vital¹ , Jonathan M. Werner¹ , Rachel M. Brewster¹

¹Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Immunolabeling methoden voor het analyseren van verschillende populaties van microtubuli in de ontwikkelende hersenen van de zebravis zijn hier beschreven, die over het algemeen van toepassing zijn op andere weefsels. Het eerste protocol schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling stabiele en dynamische microtubuli. Het tweede protocol biedt een methode om beeld en kwantificeren van ontluikende microtubuli specifiek.

Samenvatting

Microtubuli (MTs) zijn dynamisch en broos structuren die uitdagend om te afbeelding in vivo, met name in gewervelde embryo's zijn. Immunolabeling methoden worden hier beschreven om te analyseren verschillende populaties van MTs in de ontwikkelingslanden neurale buis van de zebravis embryo. Terwijl de nadruk op zenuwweefsel ligt, geldt deze methode in grote lijnen voor andere weefsels. De procedures zijn geoptimaliseerd voor vroeg tot midden-somitogenesis-fase embryo's (1 Somiet tot 12 somieten), maar ze aangepast aan een scala aan andere etappes met relatief kleine aanpassingen worden kunnen. Het eerste protocol biedt een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke spreiding van stabiele en dynamische MTs en een kwantitatieve analyse van deze populaties met beeld-verwerkende software uit te voeren. Deze aanpak vormt een aanvulling op bestaande hulpprogramma's voor afbeelding microtubulus dynamiek en distributie in real-time, met behulp van transgene lijnen of voorbijgaande uitdrukking van tagged constructies. Inderdaad, dergelijke hulpmiddelen zijn zeer nuttig, maar ze maken geen gemakkelijk onderscheid tussen dynamische en stabiele MTs. De mogelijkheid om beeld en analyseren van de populaties van deze verschillende microtubulus heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van mechanismen ten grondslag liggen aan de cel polarisatie en voedselproductie. Het tweede protocol schetst een techniek voor het analyseren van ontluikende MTs specifiek. Dit wordt bereikt door het vastleggen van de DOVO groei eigenschappen van MTs na verloop van tijd na microtubulus depolymerization met de nocodazole van de drug en een herstelperiode na drug wassen. Deze techniek heeft nog niet vereffend op de studie van MTs in zebrafish embryo's, maar is een waardevolle assay voor het onderzoeken van de functie in vivo van eiwitten die betrokken zijn bij de vergadering van de microtubuli.

Inleiding

Microtubuli (MTs) zijn polymeren van α - en β-tubuline dat tot lineaire protofilaments samenvoegen, waarvan er verscheidene combineren om te vormen van een holle buis¹^,². MTs zijn gepolariseerde structuren, met snelgroeiende plus uiteinden en langzaam groeiende minus uiteinden die zijn verankerd in de centrosoom of andere microtubulus-organiseren center (MTOC)³. DOVO MT vorming wordt geïnitieerd door nucleatie op de complexe γ-tubuline-ring (γ-TURC), waarmee een sjabloon voor MT vergadering⁴. In een bepaalde cel kunnen twee populaties van MTs worden onde....