Methodenartikel

Microkristallografie van eiwitkristallen en

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

21 juli 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Samenvatting

De komst van microfocus van hoge kwaliteit bij veel synchrotronfaciliteiten heeft de routineanalyse van kristallen kleiner dan 10 μm in hun grootste dimensie toegestaan, die een uitdaging vertegenwoordigde. We presenteren twee alternatieve workflows voor de structuurbepaling van eiwitmicrokristallen door röntgenkristallografie met een speciale focus op in vivo gekweekte kristallen. De microkristallen worden ofwel geëxtraheerd uit cellen door sonicatie en gezuiverd door differentiële centrifugatie, of geanalyseerd in cellulose na celsortering door stromingscytometrie van kristalbevattende cellen. Eventueel worden gezuiverde kristallen of kristalbevattende cellen geweekt in zware atoomoplossingen voor experimentele fase. Deze monsters worden vervolgens op diffra- tieve experimenten op soortgelijke wijze bereid door toepassing op een micromesh-ondersteuning en flashkoeling in vloeibare stikstof. We beschrijven en vergelijken serie-diffractie-experimenten van geïsoleerde microkristallen en kristal-Bevattende cellen met behulp van een microfocus synchrotron beamline om datasets te produceren die geschikt zijn voor fasering, modelbouw en verfijning.

Deze werkstromen worden geïllustreerd met kristallen van het Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrine geproduceerd door infectie van insectencellen met een recombinant baculovirus. In deze casestudy is celluloanalyse efficiënter dan analyse van gezuiverde kristallen en levert een structuur in ~ 8 dagen van expressie tot verfijning.

Inleiding

Het gebruik van röntgenkristallografie voor de bepaling van hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen heeft de afgelopen twee decennia een constante progressie beleefd. De groeiende opname van röntgenkristallografie door niet-deskundige onderzoekers illustreert de democratisering van deze benadering op vele gebieden van de levenswetenschappen 1 .

Historisch gezien zijn kristallen met afmetingen onder ~ 10 μm beschouwd als uitdagend, indien niet onbruikbaar, voor structuurbepaling. De toenemende beschikbaarheid van toegewijde microfocus bundellijnen voor synchrotron stralingsbronnen wereldwijd en technologische vooruitgang, zoals de ontwikkeling van gereedschappen om microkristallen te manipuleren, hebben veel van deze barrières verwijderd die het brede gebruik van röntgen microkristallografie hebben verbannen. Vooruitgang in seriële röntgen microkristallografie 2 , 3 en micro elektronen diffractie 4 haHet is gebleken dat het gebruik van micro- en nanokristallen voor het bepalen van de structuur niet alleen haalbaar is, maar ook soms voor het gebruik van grote kristallen 5 , 6 , 7 .

Deze vooruitgang werd eerst toegepast op de studie van peptiden 8 en natuurlijke kristallen geproduceerd door insectenvirussen 9 , 10 . Ze worden nu gebruikt voor een breed scala van biologische macromoleculen, waaronder de moeilijkste systemen zoals membraanproteïnen en grote complexen 11 . Om de analyse van deze microkristallen te vergemakkelijken, zijn ze geanalyseerd in meso , in het bijzonder membraaneiwitten 12 en in microfluidica chips 13 .

De beschikbaarheid van deze nieuwe microkristallografie methodologieën heeft de mogelijkheid geboden om in te gebruikenVivo kristallisatie als een nieuwe route voor structurele biologie 14 , 15 , 16 die een alternatief biedt voor klassieke in vitro kristallogenese. Helaas, zelfs wanneer in vivo kristallen kunnen worden geproduceerd, blijven verschillende obstakels zoals de afbraak of verlies van liganden tijdens de zuivering van cellen, moeilijkheid bij manipulatie en visualisatie van de kristallen bij de synchrotronbundel en vervelende röntgendiffractie-experimenten. Als alternatieve kristallen zijn ook direct in de cel geanalyseerd zonder enige zuiveringstap 17 , 18 , 19 . Een vergelijkende analyse suggereert dat dergelijke in cellulo- benaderingen efficiënter kunnen zijn dan de analyse van gezuiverde kristallen en levert data van hogere resolutie 20 op .

Dit protocol is inGeneigd om onderzoekers nieuw te helpen bij microcrystallografie van eiwitten. Het biedt methodologieën die zich richten op steekproefbereiding en manipulatie voor röntgendiffractie-experimenten op een synchrotronbundel. Twee opties worden voorgesteld met behulp van geïsoleerde kristallen voor klassieke microkristallografie of kristalbevattende cellen gesorteerd door flowcytometrie voor celluloanalyse ( Figuur 1 ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: In vivo is kristallisatie gemeld in veel organismen, ook in bacteriën, gist, planten, insecten en zoogdieren (gecontroleerd in referentie 21 ). Kristallisatie van recombinante eiwitten is ook bereikt in het laboratorium onder toepassing van transiënte transfectie van zoogdiercellen en baculovirusinfectie van insectencellen. Het volgende protocol is ontwikkeld met behulp van het Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin gen gekloneerd in een recombinant baculovirus onder de baculovirus polyhedrin promotor, geproduceerd volgens instructies in referentie 22 . Alhoewel dit protocol kan worden aangepast aan andere celtypes ( bijv. Zoogdiercellen), beschrijven we hier de procedures voor insectencellen. Het protocol veronderstelt dat overexpressie van het eiwit van belang al is bereikt. Methoden voor de productie van een recombinant baculovirus en het gebruik ervan voor expressie van het geïnde eiwit zijn avVerwijzbaar in referenties 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Identificatie van kristalbevattende cellen

  1. Als cellen in monolaag worden geteeld, controleer ze ze direct in de fles. Als cellen in vloeibare cultuur worden gekweekt, gebruik dan het volgende protocol.
    1. Met een steriele serologische pipet, overdragen 500 μL cellen in een microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat de steriliteit van de hoofdcultuur wordt gehandhaafd; Hanteer de cellen in een klasse II biosafety kabinet en volg standaard aseptische technieken.
    2. Pipet 5 μL cellen uit de microcentrifugebuis op een glazen glijbaan.
    3. Zet een glazen deksel op de vloeistof voorzichtig en vermijd de vorming van luchtbellen. Als de glijbaan niet binnen 15 minuten zichtbaar kan worden, sluit de deksel met vacuümvet aan om de verdamping te vermijdenatie.
  2. Beeld de fles of schuif met een omgekeerde microscoop. Indien beschikbaar, gebruik fase contrast en / of differentiële interferentie contrast microscopie (DIC). Beide technieken verbeteren het contrast in transparante monsters en benadrukken lijnen en randen, waardoor de identificatie van in vivo kristallen wordt vergemakkelijkt.
  3. Controleer de cellen zorgvuldig. Begin bij 200X vergroting en zoom in bij maximale vergroting bij het detecteren van een potentiaal kristal. De aanwezigheid van kristallen kan indirect worden voorgesteld door veranderingen in de celmorfologie ( Figuur 2 ). Kijk voor scherpe randen en veranderingen in de refractiviteit (bij gebruik van fase contrast of DIC). Bekende in vivo kristallen nemen verschillende vormen aan, waaronder staven, stapels naalden, kubussen, piramides en polyhedra (zie figuur 2 en tabel 1 voor enkele voorbeelden).
    Opmerking: het aantal cellen dat kristallen bevat, zal in ieder geval anders zijn en kan vooravondN variëren tussen preparaten maar in het algemeen mag men niet verwachten dat kristallen in alle cellen worden gevonden. Evenzo is het aantal kristallen per cel ook variabel (zie tabel 1 ), en meer dan één kristal kan in één cel gevonden worden. Deze factoren moeten zo mogelijk worden geoptimaliseerd door de veelheid van infecties aan te passen, de lengte van de expressie te wijzigen en het eiwitconstructie te variëren. Aan de ene kant zullen de condities van eiwituitdrukking en celgroei die het aantal kristalbevattende cellen maximaliseren de productiviteit verbeteren ( bijv. Een hogere veelheid van infectie en late oogst van celcultuur). Aan de andere kant kunnen condities waarbij cellen een enkel kristal bevatten, gegevensverzameling vergemakkelijken ( bijvoorbeeld lage infectiegroei). Gezien de verrijking die wordt geboekt door stromingssoorten beschreven in stap 2.2, raden wij aan om grotere kristallen ( bijv. Een enkel kristal per cel) te gebruiken, zelfs als het aandeel van kristalbevattende cellen laag is.
  4. Als kristalS worden geïdentificeerd, hun positie opnemen (bij het imaging van een monolaag in een fles), en schat het percentage kristalbevattende cellen. Indien beschikbaar, gebruik een microscoop uitgerust met een camera die in staat is om wijzigingen op één celniveau te volgen.
  5. Voor cellen in suspensie bepaalt u de mate van cellevendigheid volgens het protocol dat in referentie 28 is beschreven . Voor cellen die in een monolaag zijn gekweekt, schat bij visuele inspectie de geschatte mate van samenloop en hoeveelheid losstaande cellen.
  6. Monitor de kristalgroei, celgroei en levensvatbaarheid tweemaal per dag.
  7. Oog de cellen zo snel als kristalgroei lijkt te stoppen. Voor opvallend robuuste kristallen zoals virale polyhedra, verlengde incubatietijden (> 4 dagen) verhogen het aantal grote kristallen. Voor typische eiwitkristallen raden we echter aan om cellen te oogsten wanneer de levensvatbaarheid lager is dan 80% om schade door cellysis te voorkomen.
  8. Verwijder de fles uit de incubator en ga verder naarStap 2.2 zo snel mogelijk. Houd de cellen op ijs tijdens de volgende stappen, tenzij anders vermeld.

2. Sample Purification

Opmerking: We beschrijven twee analysemethoden van de in vivo kristallen van gezuiverde kristallen en in cellulose .

  1. Zuivering van kristallen
    Opmerking: Tenzij er bewijs is dat de belangstellingskristallen gevoelig zijn voor lage temperaturen, werken op ijs en gebruik ijskoude buffers om kristalleden te vermijden.
    1. Pipet 50 ml geïnfecteerde Sf9-cellen in een 50 ml conische centrifugebuis. Dit vertegenwoordigt ~ 4 x 10 8 cellen in een typisch experiment.
    2. Pelletcellen bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    3. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in 40 ml gekoelde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4.
      Opmerking: PBS wordt voorgesteld als uitgangspunt voor zuivering als een standaard isotonische buffer met het doel van mimNiet in de celomgeving waar de in vivo kristallen groeien. Het is gebruikt voor de meeste in vivo kristallen die in celcultuur zijn gegroeid tot op heden 9 , 14 , 29 . Als alternatief is DMEM media ook succesvol gebruikt bij de zuivering van in vivo kristallen van zoogdiercellen 19 . Als kristallen zichtbaar lijden aan hun overdracht in PBS of tegenwoordig slechte diffractie, moet deze parameter worden beschouwd als een mogelijke bron van afbraak.
    4. Soniceer de geresuspendeerde pellet gedurende 30 s bij 10 mA met behulp van een sonicator uitgerust met een 19 mm sonde. Om te voorkomen dat het monster wordt verhit, plaats het in een beker die met ijs is gevuld tijdens het soniceren. Chemische of mechanische celontbreking kan als alternatief worden gebruikt als kristallen lijken te beschadigen door sonicatie, zoals bepaald in stap 2.1.7.
    5. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Na centrifugeren zijn 2 lagen duidelijk:Een bovenste laag cellulair afval, dat is lichtbruin en een lagere pellet van polyhedrin kristallen, die wit en kalkachtig is.
    6. Gooi de supernatant weg en verwijder de bovenste laag door voorzichtig te pipetteren. Resupend de onderste pellet in 40 ml gekoelde PBS.
    7. Bepaal de kwaliteit van de monsters door beeldvorming met een lichtmicroscoop.
      1. Pipet 5 μL cellen of gezuiverde kristallen op een glazen glijbaan. Dit kan bij kamertemperatuur gebeuren.
      2. Zet een glazen deksel op de vloeistof voorzichtig en vermijd de vorming van luchtbellen.
      3. Beeld de dia met een omgekeerde microscoop bij 200X vergroting. Beeld het monster binnen 15 minuten van de voorbereiding op de dia. Als de dia niet binnen 15 minuten zichtbaar kan worden, sluit de deksel met vacuümvet af om afdamping te vermijden.
        OPMERKING: Bij polyhedra zullen kristallen verschijnen als refringentblokjes van ~ 1 - 10 μm per zijde. Controleer de integriteit van de kristallen op zoek naar tekenen van scherpteverlies( Bijv. Ronde randen), scheuren of ontbinding. Controleer ook de aanwezigheid van celresten die verschijnen als klompen en voorwerpen van onregelmatige grootte en vorm.
    8. Herhaal stappen 2.1.5 tot 2.1.7, halvering van het volume PBS dat gebruikt wordt om de pellet te resuspenderen in elke cyclus tot de kristallen vrijkomen van puin. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in 1 ml gekoelde PBS en draag de kristallen over op een microcentrifugebuis. Bewaar de gezuiverde kristallen bij 4 ° C.
    9. Schat de concentratie van kristallen door gebruik te maken van een hemocytometer zoals beschreven door de fabrikant. Tel kristallen alsof cellen tellen.

figure-protocol-1
Figuur 3 : Gezuiverde In Vivo Microkristallen. Representatieve zuivering van kristallen van het BmCPV1 polyhedrine uit Sf9 insectencellen die ( a ) gepelleteerde celresten en huilenStal na sonication, en ( b ) close-up op de puin en kristallagen. Debris laag kan zorgvuldig geresuspendeerd worden in de supernatant en weggegooid worden voor snellere kristalzuivering. ( C ) Optische microscopie afbeelding van gezuiverde polyhedra. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Isolatie van kristalbevattende cellen door flowcytometrie
    Opmerking: Voor het vergemakkelijken van de definitie van poorten in stromingscytometrie, wordt het aanbevolen om een ​​controlecultuur parallel te laten groeien met die welke het eiwit van belang uitmaakt. Dit kan gedaan worden door een fles Sf9-cellen te infecteren met een niet relevant recombinant baculovirus, of door het voorbereiden van mock-geïnfecteerde cellen. Sorteren en afbeelden van monsters wordt gewoonlijk bij kamertemperatuur uitgevoerd.
    VOORZICHTIG: Propidiumjodide is een vermoedelijk kankerverwekkend middel en moet worden behandeldmet zorg.
    1. Pipet 4 ml geïnfecteerde Sf9-cellen - vertegenwoordigen ~ 3 x 10 7 cellen - in een buis aangepast aan flowcytometrie analyse. Bereid ook een tweede buis voor met een equivalent aantal Sf9-cellen die geïnfecteerd zijn met een niet-recombinant baculovirus.
    2. Voeg propidiumjodide (PI) toe aan beide monsters bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg / ml net voor de flowcytometrische evaluatie. Deze stap is nodig om dode cellen, celklontjes en puin te identificeren die de verspreiding van cellen kunnen veranderen of maskeren op het voor- en zijverspreidingsteken. Bereid PI-voorraden van 1 mg / ml in water en houd deze bij 4 ° C tegen licht beschermd.
    3. Breng cellen aan op een standaard flow cytometer die in staat is om cellen te sorteren volgens forward- (FSC) en side-scattering (SSC). Analyseer ten minste 20.000 gebeurtenissen van de controle ( dwz niet-kristal bevattende) monster. Na het vernietigen van dode cellen, genereren celcellen en puin uit de analyse de FSC naar SSC plot.
    4. Analyseer tenminste 20.000 zelfsTs van het kristal bevattende monster. Vergelijk de FSC naar SSC-plot met de mock one. Zoek naar het verschijnen van een duidelijke populatie die overeenkomt met kristalbevattende cellen. Typisch zullen cellen met intracellulaire kristallen een hoger SSC hebben als gevolg van een toename in morfologische complexiteit. De FSC kan ook toenemen als kristalgroei een toename van het volume van de cel veroorzaakt. Definieer de poorten van de stromingssorter om celbevolkingen te isoleren die overeenstemmen met de gebieden van het scatterplot dat verschilt van het plot. Beeld de gesorteerde monsters door lichtmicroscopie zoals beschreven in stap 1 om te bevestigen welke populatie is geassocieerd met kristalbevattende cellen.
    5. Gebruik de poorten die zijn omschreven in stap 2.2.4, sorteer kristalhoudende cellen in PBS of in elke andere isotonische buffer. Noteer het aantal kristal bevattende cellen, evenals het uiteindelijke volume, om de volgende stappen te vergemakkelijken. Bewaar de gesorteerde cellen op ijs of bij 4 ° C.
      Opmerking: in een uur,> 300.000 polyhedra-conBehoudende cellen worden gesorteerd op een cel sorteren met een 100 mm mondstuk (138 kPa met een frequentie van 39 kHz). Deze hoeveelheid cellen is voldoende om> 1000 mazen te bereiden.
    6. Volg het in stap 2.1.7 beschreven protocol, beeld de cellen met een lichte microscoop om de verrijking in kristalbevattende cellen te bevestigen. Proefbereiding voor gegevensverzameling dient zo snel mogelijk na cellesortering te gebeuren, aangezien kristallen zich in de loop der tijd kunnen degraderen of worden vrijgegeven door cellysis.

figure-protocol-2
Figuur 4 : Cell-sortering. Representatieve flowcytometrie scatter plots van ( a ) niet-geïnfecteerde cellen (mock), die geen kristallen bevatten, en ( b ) Sf9-cellen die zijn geïnfecteerd door een recombinant baculovirus over expressie voor het BmCPV1 polyhedrine. Verschillen in het verstrooiingspatroon tussen de twee populaties alVerzwakking van de kristalbevattende celpopulatie (rode poort, hoge SSC-waarden). Elke plot vertegenwoordigt 20.000 sorteringsgebeurtenissen. SSC: zijlicht verstrooiing; FSC: vooruit licht verstrooiing. ( C ) Optische microscopie afbeelding van een representatieve populatie van de gesorteerde cellen, waarbij de aanwezigheid van intracellulaire kristallen wordt weergegeven. Schaal = 50 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbeeld Voorbereiding Data Collection

Opmerking: als cellen of kristallen moeten worden afgeleid voor het experimentele fasevolgingsprotocol, gedetailleerd beschreven in sectie 3.1. Anders ga direct naar sectie 3.2 voor gezuiverde kristallen of 3,3 voor in celluloanalyse .

  1. Derivatisatie van gezuiverde of in cellulo microkristallen
    VOORZICHTIG: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik.De meeste chemicaliën die worden gebruikt voor experimentele fasering zijn acuut giftig. Gebruik alle passende veiligheidspraktijken zoals het gebruik van een chemische dampkap en persoonlijke beschermingsmiddelen. Verwijder afvalstoffen volgens uw instellingsbeleid.
    Opmerking: De aard van zware atomen, hun concentratie en incubatietijd worden op indicatieve basis gegeven voor kristallen van het BmCPV1 polyhedrine. Deze parameters moeten experimenteel worden bepaald voor elk nieuw doel. De daaropvolgende kleuring met trypan blauw in stap 3.3.2 kan worden weggelaten als cellen gemakkelijk worden gekleurd door de chemische verbinding die wordt gebruikt voor fasering.
    1. Bereid verzadigde oplossingen van de gewenste zware atomen (of oplossingen van andere chemicaliën die worden gebruikt voor experimentele fase). Gewoonlijk zullen volumes lager dan 100 μl nodig zijn voor elk zwaar atoom. Onopgeloste zouten en puin verwijderen door centrifugeren bij maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Bereid porties van ~ 50.000 kristallen voorOf gesorteerde cellen per zware atoomverbinding. Als PBS niet compatibel is met de chemische stof die wordt gebruikt voor derivatisatie ( dwz neerslagvormen en de oplossing wordt bewolkt) pellet de kristallen bij 4000 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een microcentrifuge, of de cellen bij 150 xg gedurende 3 minuten, verwijder de Supernatant en zet de kristallen of cellen zachtjes opnieuw in 20 μl van een geschikte buffer. Herhaal pelleteren en resuspension om ervoor te zorgen dat er geen sporen van PBS achterblijven. Pas het eindvolume op op 20 μL voor alle porties.
    3. Voeg 20 μL zware atoomoplossing of andere chemische verbinding van keuze aan de kristallen of cellen toe. De optimale concentratie van zwaar atoom hangt af van een combinatie van cellulaire parameters (permeabiliteit, off-target proteïnen ...) en de aard van het kristal van het eiwit van belang. Als uitgangspunt, test 3 verschillende concentraties: volledige verzadiging, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Bewaar de monsters bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen. Kristallen van de polyhEdrine zijn zeer bestand en dicht en vereisen langdurige zachtingen om de zware atomen op te nemen; Voor andere typen kristallen moet de incubatieperiode en de concentratie van zware atomen experimenteel worden bepaald. Te korte incubatietijden zullen de juiste hoeveelheden van het zware atoom niet toestaan, terwijl lange incubatietijden de integriteit van de kristallen kunnen beïnvloeden, waardoor hun diffractiekwaliteit kan worden verlaagd of zelfs opgelost kunnen worden. Als uitgangspunt, probeer 3 verschillende incubatietijden voor elke zware atoomoplossing ( bijv. 1 min, 1 uur en 's nachts). Succesvolle derivatisatie wordt beoordeeld door analyse van diffractiedata zoals kort beschreven in sectie 5 en verwijzingen daarin.
    5. Was de overmaat zware atoomoplossing weg door de kristallen bij 4 000 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een microcentrifuge of de cellen bij 150 xg te pelleteren, de supernatant te verwijderen en de kristallen of cellen zachtjes opnieuw in 10 μl buffer te resuspenderen .
  2. Bereiding van micromesh ondersteuning met gezuiverde microkristallen
    VOORZICHTIG: Het gebruik van vloeibare stikstof is geassocieerd met gevaren zoals versmetting, koude brandwonden, brand in zuurstofverrijkte atmosfeer en explosie. Raadpleeg alstublieft het risicobeheer en de veilige werkpraktijken van uw instelling.
    1. Op basis van de kristalkoncentratie berekend in stap 2.1.9, zet de concentratie op 10 7 kristallen / ml door het verdunnen van het monster; Of door de kristallen bij 4 000 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een microcentrifuge te pelleteren, het eindvolume aan te passen door supernatant te verwijderen en de kristallen voorzichtig te resuspenderen.
    2. Als de monsters vooraf worden bevroren, moet u de droge vervoermiddel of dewar met vloeibare stikstof afkoelen. Bereid de flesjes of pucks, indien nodig, op en afkoelen met vloeibare stikstof.
    3. Resuspendeer de kristalpellet en voeg een 0,5 μL druppel kristallen toe op een micromesh door pipettering. Gebruik 700 μm mazen met 25 μm vierkantGaten als uitgangspunt. Het oppervlak van het gaas is niet kritisch, maar een groter gebied biedt meer kristallen per maas en leidt tot langzamere verdamping tijdens de bereiding. De grootte van de gaten moet mogelijk worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de grootte van kristallen groter dan 25 μm. Indien nodig voor systematische studies, zijn geïndexeerde mazen beschikbaar om een ​​methodische roosterscan tijdens de gegevensverzameling te vergemakkelijken.
    4. Verwijder het merendeel van de overmaat vloeibare door blotting met een papierwick. De kristallen moeten gelijkmatig op het maas verspreid worden, zonder elkaar aan te raken. Herhaal stap 3.1.1. Voor optimalisatie van de monsterconcentratie. Ga snel door en verwijder niet teveel van de vloeistof. Bij afwezigheid van cryoprotectant verdampt de vloeistof snel met het risico op zoutkristalvorming en / of verlies van de film.
    5. Voeg cryoprotectant toe: pipet 0,5 μl van een oplossing van 50% ethyleenglycol in water op het netwerk (de samenstelling van de cryobuffer moet aan het monster worden aangepast; suggesties voor optimalisatie van cRyoprotectant kan worden gevonden in referentie 30 ). Verwijder de overtollige vloeistof door te plotten met een papierwick. In tegenstelling tot de vorige stap, moet de resterende film van oplosmiddel zo dun mogelijk zijn om de parallax-effecten te verminderen die het proces van uitlijning tussen het kristal, het straalpad en de goniometer compliceren; En om de achtergrond als gevolg van verstrooiing van röntgenstralen door vloeistof in het straalpad te minimaliseren.
    6. Onmiddellijk knipperen de micromesh in vloeibare stikstof en overbrengen naar een flesje of robotpuck, dan naar een droge verzender of dewar voor opslag.
  3. Bereiding van micromesh met kristal bevattende cellen
    VOORZICHTIG: Het gebruik van vloeibare stikstof is geassocieerd met gevaren zoals versmetting, koude brandwonden, brand in zuurstofverrijkte atmosfeer en explosie. Raadpleeg alstublieft het risicobeheer en de veilige werkpraktijken van uw instelling.
    1. Breng de gesorteerde cellen over op een 1,5 ml microcentrifugebuis. Op basis van de cel cOunts opgenomen door de cel sorteren, pas de concentratie aan op 10 7 cellen / mL door het verdunnen van het monster met PBS; Of door de cellen bij 150 xg gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een microcentrifuge te pelleteren, het eindvolume aan te passen door supernatant te verwijderen en de cellen zacht te resuspenderen.
    2. Meng de cellen met een gelijke hoeveelheid trypanblauwe oplossing (0,4% w / v) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% w / v.
    3. Als de monsters vooraf worden bevroren, koelt u de droge vervoermiddel of dewar met vloeibare stikstof af. Bereid de flesjes of pucks, indien nodig, op en afkoel ze ook met vloeibaar stikstof.
    4. Zet de cellen en pipet voorzichtig opnieuw op 0,5 μL gesorteerde cellen op een micromesh.
    5. Verwijder de overtollige vloeistof door te plotten met een papierwick. De cellen moeten gelijkmatig worden verspreid op het gaas, zonder elkaar aan te raken. Indien geen cryoprotectant gebruikt wordt (stap 3.3.6), dient de resterende film van oplosmiddel zo dun mogelijk te zijn om parallax-effecten te verlagen die complicerenE het proces van uitlijning tussen het kristal, het straalpad en de goniometer; En om de achtergrond als gevolg van verstrooiing van röntgenstralen door vloeistof in het straalpad te minimaliseren.
    6. Optioneel voeg cryoprotectant toe aan de cellen: pipet 0,5 μL 50% ethyleenglycol, 50% PBS oplossing op het netwerk. De samenstelling van de cryobuffer moet aangepast worden aan het monster; Suggesties voor optimalisatie van cryoprotectant zijn te vinden in referentie 30 . Verwijder de overtollige vloeistof door blotting met een papierbakje, waarbij alleen een dunne film van oplosmiddel wordt gelaten.
      Opmerking: Uitlating van de cryoprotectiestap veranderde niet de kwaliteit van röntgendiffractie wanneer kristallen van het polyhedrine in cellulose werden geanalyseerd, terwijl deze stap nodig was voor gezuiverde kristallen 20 . Dit geldt alleen voor de incubatie van de cellen met cryoprotectantoplossing; Het monster moet nog steeds geanalyseerd worden op 100K om de effecten van stralingsschade op de kristallen te minimaliseren.
    7. onmiddelFlash-koel de micromesh in vloeibare stikstof en verplaats deze naar een flesje of een robotpuck, dan naar een droge verzender of opslagdewar, indien van toepassing.

4. Gegevensverzameling

Opmerking: Parameters die worden gebruikt voor dataverzameling worden als een handleiding gegeven en dienen voor elke kristal- en synchrotronbundel te worden geoptimaliseerd.

  1. Verzamel gegevens op een microfocus-kristallografiebundel (zie referentie 7 voor een lijst van microfocusbundellijnen en hun kenmerken). Gebruik indien mogelijk een collimated beam die overeenkomt met de grootte van de kristallen.
  2. Voor experimentele fasering door de Anomalous Dispersion Method (SAD) met één golflengte, verzamelen bij een energie die het anomale signaal van het zware atoom van keuze kiest. Voor het phasing met behulp van de Multiple Isomorphous Replacement methode (MIR), verzamelt u de energie van een geschikte absorptierand voor het zware atoom van keuze (beschikbaar op http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter / AS_periodic.html).
  3. Nadat u het gaas op de goniometer hebt geladen, begint u door de micromesh met het straalpad te centreren met behulp van de aan de voorzijde (convexe zijde) en zijrichting. Dan, met de micromesh face-on, verfijn de uitlijning door het midden van een bepaalde horizontale baan van de micromesh in te stellen (bijvoorbeeld met de centrale). Verzamel dan gegevens langs deze horizontale baan met slechts kleine aanpassingen aan de uitlijning. Indien beschikbaar, gebruik centering op basis van rastering bij röntgendiffractie met lage dosis om de uitlijning te verfijnen (raadpleeg het lokaal contact op de synchrotronbundel).
    Opmerking: Aangezien een beperkte hoeveelheid gegevens op microkristallen kan worden verzameld door stralingsschade (typisch 10 tot 30 beelden met 1 ° oscillatie), moet het kristal in theorie alleen met het straalpad 10-30 ° uitlijnen. Het is echter van cruciaal belang dat de uitlijning juist is zoals het kristal makkelijk kan missen door de microbeam (meestal gecollimiseerd tot een diameterEr van ~ 10 μm of kleiner).
  4. Versamel diffractiedata totdat diffractie verloren gaat door stralingsschade. Voor kristallen van het polyhedrine wordt de belichtingstijd van 10 sec typisch gebruikt voor een 1 ° oscillatie voor een flux van ongeveer 3,6 x 10 11 fotonen / s bij 13 keV met een CCD-detector (totale dosis <30 MGy). Optimaliseer deze instellingen afhankelijk van de bundel en aard van het gebruikte kristal. In het bijzonder, lage dosis en fijn snijden worden aanbevolen voor pixel röntgendetectoren.
    Opmerking: als u de cellulosestrategie gebruikt , zullen de cellen die met trypanblauw zijn gekleurd, verschijnen als blauwe punten tegen de ondersteuningsachtergrond, waardoor ze gemakkelijker kunnen worden afgestemd op de balk. Als de gecollimiseerde microbeam ongeveer dezelfde grootte heeft als de cellen (~ 10 μm), zullen alle kristallen in een cel gelijktijdig verlicht worden. Voor cellen die meerdere microkristallen bevatten, leidt dit tot de waarneming van meerdere diffractiepatronen, die moeilijk te verwerken zijn. Echter, diFractie van een van de kristallen heeft vaak de diffractiepatroon domineren en wordt bij voorkeur geïndexeerd tijdens de dataverwerking. Voor straallijnen met een röntgenstraal, die aanzienlijk kleiner is dan de cel, rasteren bij zeer lage röntgenfluxen (> 95% demping), dienen te worden gebruikt om op een enkel kristal te centreren voordat de data wordt verzameld.
  5. Ga door naar het volgende kristal in de baan.
  6. Zodra alle kristallen van de baan zijn getest, ga dan verder naar de volgende baan en herhaal de uitlijningsprocedure. Ga door totdat er voldoende gegevens zijn verzameld of alle kristallen zijn getest.
    1. Zorg ervoor dat de verrichte rijstroken duidelijk zijn geïdentificeerd, zodat kristallen niet gemist of tweemaal worden geschoten (indien nodig, teken een schets). Typisch wordt trypan blauw geel nadat de cel is bestraald, die als marker kan worden gebruikt.

figure-protocol-3
Figuur 5 : Data Collection Strategy van Monsters op Micromesh Support. (A) strategie van het verzamelen van gegevens per rijstrook; Uitlijning gebeurt aan het begin van elke rijbaan (punten) en gegevens worden verzameld langs de baan. ( B ) Close-up van een trypanblauwkleurige kristalhoudende cel op een maas, zoals gezien op het microkristallografiebundelbeeldscherm. ( C ) Close-up van een gezuiverde polyhedra op een gaas, zoals gezien op het microkristallografie bundellijn scherm. De mazenvelden zijn 25 μm x 25 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Data Processing

OPMERKING: Hier worden slechts de stappen beschreven van gegevensverwerking die specifiek zijn voor seriële microkristallografie, waar gegevens uit meerdere kristallen samengevoegd worden. Veel uitstekende artikelen zijnBeschikbare beschrijvende gegevensverwerking in de diepte 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 en de bepaling van de structuur is buiten het bereik van dit protocol.

  1. Selecteer het kristal met de beste diffractie resolutie en kwaliteit als referentie.
  2. Individueel verwerken van elk kristal met behulp van standaard kristallografiepakketten zoals HKL-2000 31 , Mosflm 32 of XDS 33 . Om ervoor te zorgen dat stralingsschade de kwaliteit van de dataset niet verslechtert, selecteert u de laatste afbeelding voorzichtig met aanvaardbare stralingsschade. Knippencriteria die overdreven stralingsschade aanduiden, zijn specifiek van elk kristal type, verwerkingspraktijk en het doel van het experiment. Voor het faseren van de BmCPV1 polyhedrin kristallen werden de data weggegooid zodra het signaal-naar-n wasOise / <σ (I)> per afbeelding daalde onder 2 of de R sym overschreed 50% zoals gerapporteerd door HKL-2000 31 .
  3. Bepaal voor elk kristal de resolutie limiet en het aantal frames en herwerk met de juiste parameters om te voorkomen dat gegevens met weinig of geen signaal worden geïntegreerd.
  4. Schalen en samenvoegen van de beste kristallen naar het referentiekristal (en) met behulp van standaardpakketten zoals Scalepack in HKL-2000 31 , SCALA in CCP4 34 , 35 of XSCALE in XDS 33 . Voeg de data van de verschillende kristallen geleidelijk toe terwijl de globale kwaliteit van de dataset wordt gevolgd, ideaal totdat de dataset een aanvaardbare volledigheid bereikt (> 95%). Verwerp kristallen die een slecht isomorfisme met het beste / referentiekristal aantonen, zoals gedetecteerd door verschillen in eenheidscelparameters en slechte R merge / chi-square per afbeelding. Als te veel goede kwaliteit datasetsSchaal niet met het referentiekristal (en), gebruik een programma zoals BLEND 36 die hiërarchische clustering draagt ​​om de beste combinatie van datasets te definiëren om samen te voegen.
    Opmerking: in sommige ruimtegroepen moeten alternatieve indexeringsopties worden getest om het referentiekristal te laten overeenkomen.
  5. Ga door naar experimentele fase, moleculaire vervanging of verfijning met behulp van standaard kristallografiepakketten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een overzicht van beide alternatieve methoden voor structuurbepaling met behulp van in vivo microkristallen wordt gepresenteerd ( Figuur 1 ). Polyhedra kan gemakkelijk worden gezuiverd door sonicatie en centrifugatie. Door hun dichtheid vormen ze een laag aan de onderzijde van de buis onder een laag afval die door pipettering kan worden verwijderd ( Figuur 3a en 3b ). Het monster wordt dan onderworpen a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol bevat twee benaderingen om microkristallen te analyseren met als doel het analyseren van zeer kleine kristallen die in het verleden zouden zijn over het hoofd gezien.

Kritieke stappen voor microkristalzuivering
Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd met behulp van Bombyx mori CPV1 polyhedrine uitgedrukt in Sf9-cellen als model systeem. In vivo microkristallen tonen echter een grote variabiliteit in mechanische weerstand. Bijvoorb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Chan-Sien Lay erkennen voor het leveren van foto's van gezuiverde microkristallen, Daniel Eriksson en Tom Caradoc-Davies voor ondersteuning bij de MX2-straal van de Australische Synchrotron, en Kathryn Flanagan en Andrew Fryga van de FlowCore-faciliteit van Monash University voor hun Onschatbare hulp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sf9 cellenLife Technologies
SF900-SFM insectenmediumLife Technologies
1 L celcultuurkolfThermofisher Scientific
Schudende incubator voor insectencelcultuurEppendorf
50 mL conische buisjesFalcon
Centrifuge met slingeremmers voor 50 mL buisjesEppendorf
Sonicator uitgerust met een 19 mm sondeMSE Soniprep 150 
Glazend glasHampton Research
HemacytometerSigma-Aldrich
PropidiumjodideThermofisher Scientific
BD Influx celsorteerder BD Biosciences
Hampton Heavy atom schermenHampton Research
MicrocentrifugeEppendorf
MicromeshMitigen700/25 mazen bieden een groter oppervlak. Geïndiceerde mazen kunnen worden gekocht voor systematische studies.
Papieren wiekMitigenDe grootte van de papierwiek kan worden gevarieerd voor optimale stroming. Dit zal grotendeels afhangen van de aard van de kristallen en het gebruikte cryoprotectant.
EthyleenglycolSigma-Aldrich
TrypanblauwLife Technologies
MX2 microfocus bundellijnAustralian SynchrotronEen lijst van beschikbare microfocus bundellijnen is te vinden in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

Referenties

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345(2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451(2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463(2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

R ntgenkristallografieflowcytometriekristalisolatiemicrofocus beamlineseri le diffractiezware atoom incubatiemontage op micromesh

Gerelateerde artikelen