Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Endotheelcellen (EC's) zijn de fundamentele bouwstenen van de vasculaire architectuur en bemiddelen van vasculaire groei en remodeling om de juiste ontwikkeling van het vaartuig en homeostase te waarborgen. Echter, studies over de endotheliale afstammingshiërarchie blijven onduidelijk wegens het gebrek aan hulpmiddelen om toegang te krijgen en hun gedrag in vivo direct te evalueren. Om deze tekortkoming aan te pakken, is een nieuw weefselmodel ontwikkeld om angiogenese te bestuderen met behulp van het vetpadschuim. De borstklier ontwikkelt zich meestal in de postnatale stadia, waaronder puberteit en zwangerschap, gedurende welke robuuste epithelium proliferatie gepaard gaat met uitgebreide vasculaire remodeling. Mammary fat pads bieden ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli uit het groeiende mammary epithelium. Bovendien bevinden zich dikke vetpadsjes buiten de peritoneale holte, waardoor ze een gemakkelijk toegankelijke inplantingsplaats zijn voor het beoordelen van het angiogene potentieel van exogene cellen. Dit werk beschrijft ook een efficiëntieNt tracing benadering met behulp van fluorescerende reporter muizen om specifiek de doelgroep van vasculaire endotheliale stamcellen (VESCs) in vivo te meten. Deze afstammingsmethode, gekoppeld aan de daaropvolgende microscopie van het weefsel, maakt de directe visualisatie van gerichte cellen en hun nakomelingen mogelijk, waardoor de proliferatiecapaciteit kan worden gekwantificeerd en de differentiatieverbintenis kan worden vastgelegd. Met behulp van deze methoden is onlangs een populatie van bipotente proteïne C-receptor (Procr) die VESC's uitdrukt, geïdentificeerd in meerdere vasculaire systemen. Procr + VESCs, die aanleiding geven tot zowel nieuwe EC's als pericytes, actief bijdragen tot angiogenese tijdens de ontwikkeling, homeostase en herstel van letsels. In het algemeen beschrijft dit manuscript een nieuwe transplantatie van de dikke dikke padtransplantatie en in vivo lineage tracing technieken die kunnen worden gebruikt om de stamcel eigenschappen van VESCs te evalueren.
Inleiding
Tijdens ontwikkeling en homeostase vinden vasculaire groei en remodeling trouwen plaats in overeenstemming met orgaantengroei en reparatie. Angiogenese beschrijft de opkomst van nieuwe vaten van bestaande bloedvaten en wordt beschouwd als een belangrijke kracht die deze dynamische vasculaire veranderingen bemiddelt. Elk bloedvat is binnenkant met een laag endotheliale cellen (EC's), en ze lijken de basis te zijn van de vaartuigarchitectuur. Het mechanisme waardoor de EC-pool tijdens de homeostase is aangevuld, bleef lang en onduidelijk, en er werden argumenten aangevoerd over de vraag of vasculaire omzet het gevolg is van volwassen EC proliferatie of is de bijdra....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academie van Wetenschappen onder het goedgekeurde protocol SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolatie van VESC's uit de Mammary Mammary Gland
- Mammary gland oogst en weefsel spijsvertering.
- Gebruik 8 week oude Actin-GFP rijpe maagdelijke muizen, met gewichten tussen 20 en 25 g, als weefseldonoren.
Opmerking: Cellen die afkomstig zijn van de donor kunnen gemakkelijk worden gevolgd door GFP expressie. - Bereid weefsel-verteringsbasi....
- Gebruik 8 week oude Actin-GFP rijpe maagdelijke muizen, met gewichten tussen 20 en 25 g, als weefseldonoren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Mammary VESCs Isolatie:
Om de endotheelpopulatie te isoleren voor de daaropvolgende transplantatietest, volwassen (8 weken oud), werden maagklippen voor maagmuizen geoogst als donormateriaal. Endothelcellen werden geïsoleerd met behulp van een antilichaam gebaseerde cel sorteringstechniek. Representatieve grafieken van de FACS-analyse van de VESC bevolking in 8 weken oude C57BL / 6 borstklier EC worden getoond in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Angiogenese analyses vormen een goede experimentele benadering om vasculaire dynamiek te bestuderen. Muis-retinale vasculatuur, die postnataal ontwikkelt, blijkt een aantrekkelijk model te zijn om angiogenese 12 te bestuderen. Ondanks het feit dat het relatief toegankelijk is, is de feitelijke manipulatie binnen het retina-vaatstelsel nogal moeilijk. Tot nu toe is de best omschreven in vivo transplantatie de proefanalyse uitgevoerd, die cellen in een matrix van de basismembraan en chirur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (31530045 en 31371500 naar YAZ, 31401245 naar QCY), het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2014CB964800), de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB19000000 tot YAZ) en de Chinese Samenleving van Celbiologie (Early Career Fellowship to QCY).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
Referenties
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
