Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

Samenvatting

We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.

Samenvatting

De normale ontwikkeling van de borstklier kan worden veranderd door blootstelling aan milieuspecifieke stoffen en farmaceutische producten, overmatige blootstelling aan hormonen en genetische veranderingen. Mammary gland complete mounts zijn een goedkope methode om de voortgang van morfologische veranderingen vast te stellen die na blootstelling kunnen ontstaan. Echter, in het latere leven, wanneer abnormaliteiten meer geneigd zijn om te ontwikkelen, kan alleen vertrouwen op deze methode niet altijd voldoende informatie verschaffen om een ​​goede diagnose van de abnormaliteit te maken. Historisch, in chemische test richtlijnen studies, wordt een enkele mammierklier bij necropsy verwijderd en bereid als een hematoxyline en eosine (H & E) -verfde sectie. De incorporation van contralaterale mammary full-mount collectie en analyse vermindert de kans op een valse negatieve beoordeling. Evaluatie van de gehele berg wordt beperkt door de aanwezigheid van één of twee hele borstklippen op een dia, en in sommige gevallen zijn de abnormaliteiten waargenomen in de gehele berg, geenT uniform vertegenwoordigd in de H & E sectie. Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een protocol voor het omzetten van de gehele membraan in de mantel naar H & E-gekleurde secties, zodat letsels die anders gemist of moeilijk te diagnosticeren kunnen worden geïdentificeerd. Hier worden we een methode beschreven om een ​​hoogwaardige, paraffine-ingebedde H & E-sectie van een membraan te produceren die oorspronkelijk als een hele berg werd voorbereid. In vergelijking met een weefsel dat opzettelijk was voorbereid voor H & E sectie, vereist de hele berg extra voorbereiding op het verwijderen en verwerken van weefsels. Deze methode wordt echter beschouwd als goedkoop, aangezien het gebruikelijke laboratoriumreagentia en kleine extra tijd nodig heeft. Als resultaat kan deze methode onschatbare informatie verstrekken over hoe chemische en milieublootstelling de normale ontwikkeling van de borst verandert, evenals veranderingen die optreden als gevolg van genetische wijzigingen weergeven.

Inleiding

De mammary whole mountis is een nuttige en goedkope methode geïmplementeerd in veel ratten- en muisstudies om zowel normale als chemisch geïnduceerde, abnormale ontwikkeling te begrijpen. In het algemeen zal een membraan die op verschillende stadia wordt verzameld tijdens het ontwikkelen van knaagdieren (dat wil zeggen adolescentie, puberteit, midden- tot late-zwangerschap en invasiefase) morfologische veranderingen in weefsel- en cellulaire architectuur beïnvloeden, beïnvloed door paracrine, endocriene en autocrine factoren ¹ . In de verouderende rat worden de epitheliale en stromale delen van de klier steeds dichter, waardoor de morfologische parameters van meetinstrumenten moeilijk in een gehele berging moeilijk zijn. Zo is het gebruikelijk om een ​​klier te verzamelen voor histologische evaluatie om veranderingen op microscopisch niveau te identificeren. Beide processen zijn vooral nuttig in studies waarbij chemische blootstelling (dat wil zeggen milieu- of farmaceutisch) of de morfologische veranderingen die vergezeld gaan van genetische alterna- tuuraties.

Technieken en mogelijkheden voor het gebruik van de borstklier bij risico-evaluatie blijven evolueren. Terwijl de volledige montage voorbereiding routine en gestandaardiseerd is, blijven wijzigingen in sectie ^{2 , 3} . Vele onderzoeksgroepen met verschillende achtergronden (dwz, universiteiten, overheid en bedrijfsleven) hebben coronale / langsdoorsneden van borstweefsel als voorkeursmethode ingericht, terwijl sommige laboratoria nog kopse gedeeltes heeft door de huid ^4. De laatste methode resulteert in een buitensporige weergave van de epidermis (huid), in plaats van het weefsel van belang: het membraanepitheel ² . Coronale of longitudinale secties zijn nuttiger om het normale weefsel ⁵ te karakteriseren en de detectie van abnormaliteiten en letsels sterk te verbeteren door het verhoogde oppervlak en het aantal aanwezige structuren. Over het algemeen maakt dit de hele maGeen geschikte methode voor de vergelijkende histopathologische beoordeling van de borstklier ^{1 , 2} . Of het nu gaat met behulp van een muis of een rat, retrieval, en het behoud van de 4 ^e en 5 ^e liesklieren wordt ten zeerste aanbevolen voor de vergelijking van het geheel te monteren op een contralaterale H & E sectie.

Bij gebruik in combinatie, geven de H & E sectie en de volledige mount een nauwkeurig overzicht van de cellulaire en morfologische veranderingen die door blootstelling aan het milieu worden veroorzaakt. Dit is vooral waar bij bepaalde knaagdierstammen waarin het model een lage vatbaarheid heeft voor tumorvorming of een tumor niet grof zichtbaar is. In sommige gevallen kan het verkrijgen van het benodigde weefsel niet altijd mogelijk zijn met beide technieken ( dwz onvoldoende weefselhoeveelheid, middelen of onverwachte experimentele resultaten). In ons geval werden abnormaliteiten waargenomen in de volledige berghok, terwijl histopathoLogische bevindingen in de contralaterale H & E klier waren meestal normaal. De overweldigende discrepantie tussen de contralaterale klieren leidde ons tot een economische en efficiënte procedure om de abnormaliteiten in de gehele mounts te identificeren. Met behulp van een gewijzigde verwerkings- en embedingsprocedure werden hoogwaardige H & E-gekleurde secties bereid uit paraffine-ingebedde gehele montages. We beschouwen dit protocol als een krachtig detectiemiddel voor chemische blootstellingseffecten, waardoor inter-lab vergelijkingen worden verbeterd.

Protocol

Alle dierengebruik en procedures voor deze studie werden goedgekeurd door het NIEHS Laboratory Animal

Zorg- en Gebruikskomitee en in een Vereniging voor Beoordeling en Akkreditering van

Laboratorium dierenzorg geaccrediteerde faciliteit.

1. Mammary Whole Mount Preparation ^{2 , 3 , 6 , 7}

1. Verwijder de ingewanden van de ingewanden van de ene kant van een niet-zwangere CD-1 vrouwelijke muis, zoals beschreven in referentie ³ , en plaats ze op een elektrostatisch geladen dia.
2. Bedek de klier met een non-stick papier of een film en plaats een andere glijbaan bovenop. Voeg druk ( dwz watergewichten) aan de glijbaan toe om de klier uit te spreiden zodat de klier aan de glijbaan vasthoudt voor fixatie.
3. Onderdompel de dia's in fixatief ( bijv. 100% ethanol, chloroform en ijsazijn in een verhouding van 6: 3: 1)Overnacht bij kamertemperatuur.
4. Verwijder de klieren uit de fixatie en wrijf 15-30 minuten in ethanol. Na de 30 minuten wassen, veranderen geleidelijk aan water door 1/3 van de ethanol uit te gieten en water toe te voegen. Laat de was elke keer ongeveer 5 minuten zitten en herhaal 3 keer met water.
5. Stain ( bijv. Carmine alum oplossing) gedurende 12-24 uur.
   OPMERKING: Dikkere weefsels hebben langere vlektijden nodig. Zie referentie ³ voor kleuring details.
6. Giet de vlek na de toegestane tijd af en doe de dia's 30 minuten in water af. De weefsels uitdrogen door de glijbanen in 70% ethanol gedurende 15 minuten te wassen, gevolgd door een 15 minuten wassen in 95% ethanol en een laatste was in 100% ethanol gedurende 20 minuten.
7. Verwijder het vet uit de weefsels door ze gedurende minstens 24 uur in xyleen te plaatsen, of langer als het weefsel dik is, zodat eventuele ondoorzichtige of witte gebieden verwijderd worden.
8. Verwijder het weefsel uit het xyleen en voeg snel m toeOnstuimig medium naar de glijbaan om uitdroging van het weefsel te vermijden; Plaats een deklap bovenaan. Laat de glijbaan minstens 48 uur drogen.
9. Evalueer het gehele weefsel voor abnormaliteiten, zoals beschreven in ² .
   OPMERKING: Wanneer er sprake is van laesies in gehele mounts en er is een sectie nodig om hun identiteit vast te stellen, dienen de volgende stappen te worden gevolgd.

2. Verwijdering van de hele mammop van een mammoet uit een glazen glijbaan

1. Verwijder de deksel en het montagemedium door de volledige diafragma van de membraan in een glazen vlekpotje te vullen die met xyleen overnacht wordt gevuld.
   OPMERKING: Dikkere weefsels en glijbanen met overmatige montageoplossing kunnen extra tijd nodig hebben voor het verwijderen van de deklaag.
2. Na de eerste nacht overnacht, plaats de glijbanen in verse xyleen en week gedurende 6 uur. Voer een laatste blik in verse xyleen overnacht.
   OPMERKING: De deklip zal na de laatste week gemakkelijk uit de glijbaan vallen.
3. Met agGeliefde hand, houd de glijbaan en verwijder de deksel met een paar tangjes zorgvuldig om ervoor te zorgen dat het in een stuk verwijderd wordt.
   OPMERKING: Als het dekglas nog steeds aan de glazen glijbaan is bevestigd, moet u doordrenken totdat het met weinig moeite verwijderd kan worden.
4. Zodra de deklaag is verwijderd, houd de dia loodrecht op een glazen Petri-schotel die xyleen bevat, neem een ​​scherp, wegwerp scheermesje voorzichtig en schuif het mes in een enkele beweging in de glijbaan.
5. Zodra het weefsel verwijderd is, onderdompel u het mammary pad snel in een xyleen-gevulde Petri-schotel om ervoor te zorgen dat het weefsel niet droogt.
   OPMERKING: Wees voorzichtig met deze stap. De gehele berg is dun (≤ 1 mm), en breekbaar van xyleenverwerking. Elke indrukken of tranen kunnen de morfologie van het weefsel veranderen en latere evaluaties compliceren.

3. Weefselverwerking

1. Zodra het weefsel in de Petri-schotel zit, zorg het voorzichtigNaar een gelabelde histologiecassette. Pak de rand van het vetpaneel met stompe, gekartelde tangjes om de weefselschade te minimaliseren.
   1. Met behulp van een scheermes, snijd grotere weefsels (vooral voor ratten) in de helft en plaats ze in twee losse gelabelde cassettes die de weefselgrootte opvangen. Plaats het weefsel rechtsom (gebruik het lymfeknoop als referentie). Zorg ervoor dat het weefsel zonder lymfeklieren in dezelfde, rechtopstaande positie wordt gehouden als het overgebracht wordt naar de cassette.
2. Plaats de cassette in een container xylene gedurende maximaal 2 uur voordat u deze in de weefselprocessor plaatst.
   OPMERKING: Het is aan te raden om de monsters te verwerken op dezelfde dag dat ze in de cassette worden geplaatst. Uitgebreide inslag in xyleen is niet getest.
3. Laad het maximale aantal cassettes met de hand in de weefselprocessor.
4. Voorafgaand aan het begin, programma alle reagentia die voor dit proces worden gebruikt in de reagentielijst van de processor. Om de beweging te automatiserenVan een station naar de volgende, gebruik de menuopties en maak een nieuw programma. Als alle stappen zijn voltooid, selecteert u 'OK' om door te gaan.
   OPMERKING: De processor zorgt ervoor dat alle stationsgegevens worden herzien voordat u begint.
   1. Automatiseer de processor om de cassettes in xyleen gedurende 30 minuten bij 37 ° C te slikken, gevolgd door een tweede week in verse xyleen onder dezelfde omstandigheden. Automatiseer de processor om de cassettes van de xyleenoplossing te verwijderen en de weefsels naar het volgende station over te brengen met een 1: 1 xyleen: gesmolten paraffine mengsel, ingesteld op 60 ° C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De processor zal dan de cassettes overbrengen naar een nieuwe kamer die gesmolten paraffine gedurende 1 uur bevat. Na 1 uur worden de monsters automatisch overgebracht naar een nieuwe kamer van vers gesmolten paraffine en worden deze nog 2 uur verwerkt. Beide stappen worden uitgevoerd bij 60 ° C.
   2. De processor overbrengt dan de cassettes naar het station met gesmolten paraFf gedurende 1 uur. Vervolgens worden de monsters automatisch overgebracht naar het eindstation van vers gesmolten paraffine en nog 2 uur bewerkt. Beide stappen worden uitgevoerd bij 60 ° C.

4. Inbedding van de Verwerkte Mammary Tissue

1. Plaats de cassettes in de 58 ° C paraffine houder van het embedding station tot u klaar bent om het weefsel in de vorm te plaatsen.
2. Verwijder de cassettehoes om de beste vormgrootte voor het weefsel te bepalen. Zorg ervoor dat de vorm groot genoeg is om het weefsel op te vangen, en laat genoeg ruimte om een ​​weefselvrije grens van paraffine rond de omtrek te hebben.
3. Voeg 3-4 mm gesmolten paraffine toe aan de matrijs en geef het gehele oppervlakteschuim van de mammier aan, die naast de bodem van de glazen glijbaan en de bodem van de cassette naar boven in de vorm stond.
4. Breng de vorm over op een koelplaat en pas het weefsel zo snel mogelijk aan, zodat het evenwijdig aan de vorm b isottom.
   OPMERKING: Zodra de paraffine verhardt, zal het weefsel op zijn plaats worden beveiligd.
5. Plaats de gelabelde, onderste helft van de cassette bovenop de vorm met behulp van warme tang. Druk stevig met behulp van de tang.
6. Voeg extra gesmolten paraffine in de vorm in een continue beweging om de hele cassette te bedekken. Verplaats de mal van de warme plaat naar een koude plaat om het blok te verharden.
7. Verwijder het blok uit de vorm wanneer de paraffine helemaal stollt om scheuren of luchtbellen te vermijden.
   OPMERKING: Bewaar de paraffine-ingebedde weefsels bij kamertemperatuur tot aan de afwerking.

5. Sectie van de paraffine-embedded Mammary Tissue op de Microtome

1. Voorafsnijden van de paraffineblokken bij -20 ° C gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Er zal een restmonteringsmedium in het blok zijn van het originele deklaagde full-mount weefsel. Het blokkeren van het blok verbetert de doorsnede en het linten van het blok.
2. Bereid de microfoon voorRotome door het waterbad aan te zetten, met vers gedestilleerd water en de temperatuur aan te passen op 42-45 ° C. Leg een fris, laag profielblad op de microtome en zet het op 4 μm.
   OPMERKING: Sectiekwaliteit wordt verminderd met secties die dikker zijn dan 4 μm door aanwezigheid van restmonteringsmedium in het weefsel.
3. Steek het blok in de microtome met de wax naar het mes en in lijn met het verticale vlak. Vocht dan een gedeelte van de gaasblok in koud water en leg hem enkele minuten op het blok.
4. Deel het blok door het grote wiel in de klok mee te draaien, in combinatie met het grove geavanceerde wiel, tot een volledig gezicht of representatief blokblok is verkregen.
   OPMERKING: Het weefsel is dun door het verwijderen van xyleen tijdens het gehele proces. Breng het blok goed uit met het mes om het aantal snijpunten te minimaliseren bij het verkrijgen van een representatieve sectie.
5. Kies het lintSnij het handje voorzichtig in het warme (45 ° C) waterbad (vooraf voorbereid), laat het weefsel rimpels doordringen en zorgvuldig een gedeelte op een schone glijbaan glijden.
6. Plaats de glijbanen rechtop op een droogrek om overtollig water te verwijderen. Incubeer de glijbanen in een licht geopende glijbaan bij nacht bij 37 ° C.

6. Geautomatiseerde en handmatige H & E-kleuring van gesneden weefsels

1. Vóór het vullen worden de slides bij kamertemperatuur opgeslagen.
2. Voor geautomatiseerde kleuring selecteert u H & E uit de vlekopties in het hoofdmenu. Deparaffinisatie, vlekken en uitdroging worden allemaal voltooid op de geautomatiseerde vlekplaat. Gebruik montagemedium en een deklaag om de secties op te bergen.
3. Als u de dia's handmatig kent, verdeelt u de secties door de dia's in xyleen gedurende 5 minuten te dompelen. Vervoer naar frisse xyleen en herhaal gedurende 5 minuten.
4. Rehydrateer de glijbanen door het dompelen van thTwee keer in 100% ethanol gedurende 3 minuten elk, gevolgd door twee herhalingen in verse 95% ethanol en twee aparte wasjes in 1X wasbuffer bij 5 minuten elk.
5. Spoel de glijbanen af ​​in gedistilleerd water.
6. Voeg de dia's toe aan de hematoxyline gedurende 1-2 minuten. Verwijder de glijbanen en spoel ze 5 minuten met rioolwater.
   OPMERKING: Filter hematoxyline voorafgaand aan elk gebruik.
7. Plaats de glijbanen in 1% ijsazijn gedurende 30 s om de kleurdifferentiatie te bevorderen, en spoel daarna met leidingwater 1 minuut.
8. Voeg dia's toe aan 1X PBS gedurende 30 s tot 1 min. Om de weefselsecties te blauwen, gevolgd door een 5 min spoeling in kraanwater en vervolgens in 95% alcohol gedurende 15 - 20 s.
9. Counterstain met eosinoplossing gedurende 30 s tot 1 min. Vervolgens de slides uitdrogen tweemaal in verse 95% ethanol, gevolgd door twee verse herhalingen in 100% ethanol. Doe elke was gedurende 5 minuten.
10. Verwijder de glijbanen in xyleen, met twee veranderingen in xyleen gedurende 5 minuten elk.
11. CoverslipDe weefsel sectie met montage medium en droog platte overnacht bij kamertemperatuur.

Resultaten

Deze methode is effectief om te helpen bij diagnoses die anders zouden zijn gemist als de originele contralaterale H & E sectie van het mammary pad geen histologische veranderingen vertoonde. Het resultaat is echter alleen nuttig als u tijdens de eerste voorbereiding van de volledige berging zorgvuldig gebruikt, evenals tijdens de bereiding van het weefsel voor de histologische evaluatie. Paraffine inbedding zorgt voor bescherming en zal helpen om het weefsel te behouden voor toekoms...

Discussie

De volledige membraan van de borstklier is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de normale ontwikkeling van de borstvoeding en morfologische veranderingen te illustreren die kunnen optreden en voortzetten na blootstelling aan chemicaliën, waaronder endocriene verstoringen. Wanneer een hele berg- en H & E-sectie van hetzelfde dier samen worden beoordeeld, kunnen ze een nauwkeurige visuele snapshot van vroege veranderingen verschaffen, die in een ziekere toestand kunnen komen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Xyleen	Sigma-Aldrich	214736
Permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-100	montage media voor coverslips van gehele preparaten en H&E secties
Leica geautomatiseerde processor	Leica Biosystems	Model # ST5020
HM 355S automatisch microtoom	Thermo Fisher Scientific	905200
Paraffine	Leica Biosystems	EM-400
Superfrost plus microscoopglaasjes	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	elektrostatisch geladen
Fisher Finest 24x60x1	Thermo Fisher Scientific	12-548-5P	coverslips
Varistain Gemini ES automatische glasjeskleuring	Thermo Fisher Scientific	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	vloeibaar kleefmiddel; gebruikt in waterbad bij het doorsnijden
Gemodificeerd Harris Hematoxyline 72711	Richard-Allan Scientific (onderdeel van Thermo Scientific)	72711
Eosine	Leica Biosystems	3801600
Lithiumcarbonaat	SkyTech Laboratories	LCQ500
IJsazijn	Thermo Fisher Scientific	A38-500	nodig voor Carnoy's fixeermiddel
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4440-04	nodig voor Carnoy's fixeermiddel
100% Ethanol	The Warner Graham Company	6505001050000	nodig voor Carnoy's fixeermiddel en het wassen van glasjes
95% Ethanol	The Warner Graham Company	6505011137320190
Carmine Alum	Sigma-Aldrich	C1022-25G
Aluminiumkaliumsulfaat dodecahydraat, Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
Automatiseringswasbuffer, 20X	Biocare Medical	TWB945