Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft noninvasive bemonstering van ongestoord bovenste luchtwegen mucosal voering vloeistof. Het geeft ook de extractie procedure gebruikt voorafgaand aan de analyse van immuun bemiddelaars in vloeibare eluaten voor de studie van de actuele immuun handtekening airway, zonder de behoefte aan stimulatie-procedures (vaak gebruikt door andere technieken). De mucosal voering vloeistof wordt bemonsterd op een strook van filtreerpapier geplaatst op het voorste deel van het inferieur turbinate en links voor 2 min van absorptie. Analyten worden geëlueerd van de papieren filters, en de uitgepakte eiwit gebaseerde eluaten worden geanalyseerd door een electrochemiluminescence gebaseerde immunoassay, waardoor voor de kwantificering van de hoge gevoeligheid van laag - en hoog - niveau analyten in hetzelfde monster. Wij de niveaus in vivo 20 voorgeselecteerde immuun bemiddelaars aan specifieke immuun signalering trajecten in de mucosa van de bovenste luchtwegen gerelateerde gemeten, maar de techniek is niet beperkt tot die specifieke deelvenster of bemonstering site. De techniek werd voor het eerst geïmplementeerd in de 7-jarige kinderen van de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) cohort met allergische rhinitis. Daarna werd het gebruikt in de lengterichting COPSAC₂₀₁₀ geboortecohort, bemonsterd op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Wij met succes verkregen en monsters van 620 (89%) van 700 kinderen van 1-maand-oude geanalyseerd; een paar monsters waren onder de detectiegrens van de assay (gerapporteerd als de mediaan (inter kwartiel bereik (IQR)). Het aantal monsters onder de detectiegrens (d.w.z. van 0 tot het punt van de reeks voor de ondergrens voor detectie) voor elke bemiddelaar was 29 (7.25-119,5). Deze techniek mogelijk maakt van de kwantificering van de in vivo airway mucosal immune profiel vanaf de geboorte, overlangs kan worden toegepast, en kan worden toegepast op studies over het effect van genetica en milieu posities van jeugd, pathofysiologie, endotyping, en monitoring van aandoeningen van de luchtwegen, en ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapieën.

Inleiding

De vloeistof van de mucosal voering van de neus maakt het vloeibare deel van het systeem van de bovenste luchtwegen. Het bestaat uit een complexe matrix van bemiddelaars/mediators afgeleid van het samenspel tussen het epithelium en de immuuncellen die deel van de eerste lijn van verdediging uitmaken tegen invasie van micro-organismen. De nasale mucosa is gemakkelijk bereikbaar en er is een sterke functionele en immunologische relatie tussen de neus en de bronchiën¹. Dit compartiment is van bijzonder belang met betrekking tot ziekten van de luchtwegen die in de kindertijd, zoals astma en allergische rhinitis, maar ook aan een aantal andere respiratoire aandoeningen vaker later in het leven gelden.

Hier beschrijven we de uitvoering van een methode om te monster ongestoord mucosal voering van de vloeistof uit de neusholte met behulp van een techniek filter papier gebaseerde, noninvasive, alsmede een daaropvolgende extractiemethode, gewend Elueer analyten uit het filtreerpapier voorafgaand aan hun kwantificering op basis van eiwitten. Deze techniek kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te verkrijgen in vivo immuun handtekeningen van zowel gezonde personen en personen met verschillende aandoeningen van de luchtwegen. Bovendien is het mogelijk om posities van belang is voor een specifieke immuun handtekening onderzoeken en te beoordelen of het is een voorspeller of bemiddelaar van latere ontwikkeling van de ziekte.

Mucosal voering vloeistof is eerder verkregen door nasale lavage², die wordt vaak voorafgegaan door een test op neus uitdaging, waar een allergeen is geïntroduceerd in hoge mate ter stimulering van een ontstekingsreactie^3,4. Echter, de techniek van de nasale lavage is niet haalbaar bij jonge kinderen en introduceert een onbekende verdunningsfactor, die de resultaten, als de verdunde bemiddelaar niveaus onder de detectiegrens van de bepaling^{5 vallen kunnen}kunstdiscours. Bovendien, als gevolg van de onbekende verdunningsfactor, de gemeten analyt reacties van de nasale uitdaging-tests zijn niet vergelijkbaar tussen individuen, waardoor het beperken van het nut van de techniek van de nasale lavage in een cohort instellen. Tenslotte allergeen uitdaging is alleen van toepassing bij gesensibiliseerde personen, en andere uitdagingen, zoals de histamine-uitdaging, zijn niet fysiologisch relevant, mogelijk veroorzaakt een plafond effect op vrijlating van de bemiddelaar. Deze problemen worden omzeild in de gepresenteerde filtreerpapier gebaseerde techniek voor mucosal voering vloeistof collectie, waar de individuele secretie van vloeistoffen en niveaus van het analyt zijn de enige factoren die van invloed zijn Inter-individuele variatie.

Tijdens de extractie procedure, worden analyten geëlueerd uit het filtreerpapier na toevoeging van identieke volumes van buffer aan alle samples. Dit gunsten soortgelijke ex vivo verdunning van alle monsters. De buffer van een extractie van albumine gebaseerde isotone zoutoplossing wordt gebruikt voor de extractie stap; het maakt de winning van bemiddelaars op basis van eiwitten en eiwitten om te beperken denaturatie tijdens de daaropvolgende bevriezing van geëlueerd eiwitten vóór kwantificering stabiliseert. Om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit tijdens de winning fase, wordt een cocktail van proteaseinhibitors toegevoegd aan de extractie-buffer.

De toepassing van technieken die het mogelijk voor de kwantificering van ongestoord, in vivo maken-gegenereerde immuun bemiddelaars op mucosal sites is van het allergrootste belang. Ten eerste, de mucosal site maakt het grootste immunologisch orgaan in het lichaam. Ten tweede, de nasale locatie is van de primaire site van airborne blootstelling en is nauw verbonden met de respiratoire immunologische compartiment van de longen¹. Ten derde, de mogelijkheid van de landmeetkunde dit belangrijke orgaan met een noninvasive techniek opent de mogelijkheid om een overvloed aan informatie op de as van de belangrijke microbe-immuun interactie met betrekking tot gezondheid en ziekte in de luchtwegen. Ten vierde, er zijn vele andere mogelijke toepassingen van deze techniek, zoals het bestuderen van lokale immunologische veranderingen in gerandomiseerde, gecontroleerde proeven van drugs en micronutriënten.

Aanvankelijk wij de techniek in de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) cohort, waar wij het immuun Profiel van de mucosal voering vloeistof in de 7-jarige kinderen met allergische rhinitis versus gezonde controles^{13 vastbesloten}. Vervolgens, we met succes toegepast deze techniek op de longitudinale COPSAC₂₀₁₀ cohort en beoordeelde airway immuun profielen op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Resultaten van het 1-maand-oude pasgeborenen hebben aangetoond dat belangrijke associaties tussen de immuun handtekening en de milieublootstelling jeugd^{7,8,9,10,11,12}.

Protocol

De studies werden uitgevoerd overeenkomstig de leidende beginselen van de verklaring van Helsinki. Goedkeuringen van de ethische commissie voor Kopenhagen (KF 01-289/96 COPSAC₂₀₀₀ ) en H-B-2008-093 voor COPSAC₂₀₁₀en het Deense Agentschap voor de bescherming van de gegevens werden verkregen en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van beide ouders van elk onderwerp vóór inschrijving.

1. experimentele opstelling

1. Gebruik van vellen filtreerpapier (vezelig gehydroxyleerde-polyester vellen, zie de Tabel van materialen)^6,7.
   1. Knip stroken 3 x 15 mm in grootte voor een kind 1-maand-oude en in een L-vorm voor oudere kinderen en volwassenen (5 x 20 x 10 mm (korte arm van de L)).
2. Plaats een stuk filtreerpapier in elk neusgat van een zuigeling met pincet. Breng het filter op het voorste deel van de turbinate inferior (ongeveer 1 cm in het neusgat voor pasgeborenen en 1,5 cm voor alle andere leeftijden).
   1. Pasgeborenen plaats op een bed en geef ze suiker water voor comfort.
      Opmerking: Voor kinderen van alle andere leeftijden, de bemonstering wordt uitgevoerd gemakkelijkst met het onderwerp gezeten op een stoel.
   2. Voor oudere kinderen, plaatst u de lange arm van de L-vormige filtreerpapier in elk neusgat.
3. Toepassing van een clip van de neus om de neusgaten ongemak te minimaliseren en te voorkomen dat het verlies van het koffiefilter.
4. Verwijder de papieren filters na 2 min van absorptie.
5. Plaats het filtreerpapier in gelabelde buizen en bevriezen ze onmiddellijk bij-80 ° C.
6. Maak een notitie van geen symptomen van infectie van de luchtwegen komt te staan door het kind op de dag van de bemonstering.
7. Eventuele opnemen niezen, persistente huilen, of bloedneus dat tijdens de 2 min van de bemonstering optreedt.

2. kwantificering van Airway immuun-bemiddelaars

1. Maximaal 10 willekeurige monsters nemen uit de diepvries. Record de identificatienummers. Houd de monsters op ijs tijdens het hele werkproces.
2. Na het ontdooien op ijs, dompel het filtreerpapier (per onderwerp) van beide neusgaten in 300 µL van vers bereide buffer (Zie de Tabel van materialen) met een volledige protease inhibitor tablet (Zie de Tabel van materialen) per 25 mL buffer.
   1. Regel het volume van de buffer volgens de grootte van het koffiefilter.
      1. Gebruik 300 µL van buffer voorpapieren filters 3 x 15 mm groot.
      2. Als slechts één filtreerpapier beschikbaar is, gebruik de helft de buffervolume (150 µL).
3. Overbrengen van de monsters naar een plaat shaker (400 rpm) voor 5 min. gebruik een timer.
4. Overdracht van de vochtige filtreerpapier en assay buffer in de Beker van een celluloseacetaat buis filter (0,22 µm poriegrootte) geplaatst binnen een microcentrifuge buis (Zie de Tabel van de materialen).
5. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 min. in een gekoelde centrifuge (bij 4 ° C) te verkrijgen van de gefiltreerde nasale extract in de buis.
6. Verwijder de cup en houd de buizen op ijs terwijl aliquoting de nasale extract in de putten van binding aan laag-eiwitten opslag platen (Zie de Tabel van de materialen).
7. Bewaren bij-80 ° C tot analyse.
8. Bepalen van de concentraties van cytokines en chemokines in de nasale extracten met een hoge gevoeligheid, electrochemiluminesce gebaseerde multiplexed matrix-systeem (Zie de Tabel van de materialen).
   Opmerking: Een menselijke 10-plex T_H1/T_H2 cytokine assay, 9-plex chemokine assay, single-plex IL-17A, TGF-β1 en TSLP werden uitgevoerd hier.
   1. Voor het testen, Incubeer de nasale extracten 's nachts bij 4 ° C. Het gedrag van de meetwaarden verhoudingsgewijs per defabrikant standaard protocol (Zie de Tabel van de materialen).
      Opmerking: De immunoassay (Zie de Tabel van materialen) hebben meestal een hoog dynamisch bereik voor meting variërend tussen 1 & 10.000 pg/mL, maar voor sommige testen, het kan 100.000 pg/mL. Dit betekent dat alle monsters kunnen worden uitgevoerd bij de dezelfde verdunning, dus het beperken van de invloed van ongelijke verdunningen in gezonde en zieke onderwerpen, zoals het geval is in andere soortgelijke immunoassay. De ondergrens voor detectie voor alle cytokines was 1 pg/mL of minder, en chemokines, het varieerde van 1 & 50 pg/mL. TSLP was niet aantoonbaar in 98% van de monsters bij 1 maand oud.

3. statistieken

1. Log-transformatie de gegevens vóór de analyse te verkrijgen normaal verdeelde storingswaarden van de cytokine en chemokinereceptoren niveaus.
2. Als de monsters worden geanalyseerd in meer dan één partij, de cytokine en chemokinereceptoren gegevens voor het batchgewijs centreren op de log-getransformeerd gegevens corrigeert.
   1. Het opnemen van het algemene gemiddelde en de transformatie van de anti-logboek om gegevens in de oorspronkelijke maateenheden te verkrijgen.
      Opmerking: Voor elke verzameling van analyses gedaan, kunt u overwegen variabelen die invloed hebben op het niveau van cytokines en chemokines aan te passen. Dit zou moeders invloeden (bijvoorbeeld, de consumptie van alcohol en roken tijdens de zwangerschap), borstvoeding, ongewenste voorvallen tijdens bemonstering, broers en zussen, huisdieren in het huis, enz

Resultaten

Basiskenmerken van de immuunprofielen van de luchtwegen:
Complete gegevens over niveaus van immuunbemiddelaars in het mucosale slijmvlies van de bovenste luchtwegen op 1 maand leeftijd werden verkregen bij 620 (89%) van de 700 kinderen die waren ingeschreven in de COPSAC₂₀₁₀ cohort. Tien pasgeborenen werden ingeschreven voordat de techniek was vastgesteld, en 19 kwamen niet opdagen voor het bezoek van 1 maand. Bovendien werden 47 monsters uitgesloten omdat ...

Discussie

Met de techniek die hier gepresenteerd, konden we om te bepalen van het in vivo Opper-airway mucosal immune profiel bij kinderen vanaf zo spoedig 1 maand oud, die niet eerder is gebeurd. We hebben vastgesteld dat aanwezigheid van specifieke airway bacteriën en picornaviruses^7,11, evenals andere pre en perinatale posities, werden weerspiegeld in de luchtweg immuun Profiel van de pasgeborenen. Bovendien, we deze airway immuun profielgegevens gebruikt bij h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fibrous hydroxylatedpolyester sheets	Accuwik Ultra	SPR0730	Filterpapier
Milliplex Assay Buffer	Millipore	L-AB	Buffer
Low-protein binding storage plates	Thermo Scientific	CLS8161	Platen
Protease Inhibitor	Roche	11873580001	Complete EDTA-vrije protease-remmercocktail
Reader of multi-spot plates	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
Assays	Mesoscale		Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay en 9-plex chemokine assay, en singleplex IL-17A, TGF-β1en TSLP. Een beschrijving is online te vinden op www.mesoscale.com