Het doel van dit protocol is om een eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI's) is een onontbeerlijke aanpak geworden voor het bestuderen van biologische processen en mechanismen, zoals celsignaalvorming, ontwikkeling van organismen en ziekte. Het is vaak gewenst om PPI-informatie te verkrijgen door gebruik te maken van in vivo materiaal, om de meest natuurlijke en onpartijdige weergave van de interactie netwerken te verkrijgen. De vruchtvlieg Drosophila melanogaster is een uitstekend platform om PPI's in vivo te bestuderen en leent zich op eenvoudige aanpakken voor isolatiemateriaal voor biochemische experimenten. In het bijzonder vormen vruchtvliegenembryo's een geschikt type weefsel om PPI's te bestuderen door het gemakkelijk verzamelen van dieren in dit ontwikkelingsfase en het feit dat de meeste eiwitten uitgedrukt worden in embryogenese, waardoor een relevante omgeving wordt verschaft om de meeste PPI's te onthullen. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g), wat een ideale hoeveelheid is voor een breed scala aanProteomische toepassingen, inclusief analyse van PPI's door affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS). We beschrijven onze ontwerpen voor 1 liter en 5 liter kooien voor embryo collecties die gemakkelijk en goedkoop in elk laboratorium kunnen worden opgezet. Wij bieden ook een algemeen protocol voor embryo-collectie en eiwit extractie om lysaten te genereren die direct kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals AP-MS. Ons doel is om alle onderzoekers een toegankelijke manier te bieden om de analyses van PPI's in vivo uit te voeren .
Inleiding
Genetische schermen en recentere genomische benaderingen hebben de studie van biologische functies ge revolutioneerd. Echter, belangrijke cellulaire informatie is gecodeerd in eiwitten en hun ensemble van interactieve partners. Terwijl traditionele genetische modificatieschermen de snelheidsbeperkende componenten kunnen identificeren en indirecte interacties herstellen, ligt de sterkte van de proteomische benaderingen in hun vermogen om directe interactie-netwerken van eiwitten van belang te identificeren. Proteomics is dus een waardevolle orthogonale methode om biologische systemen te bestuderen, en complementeert genomics, transcriptomics en traditionele genetische....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van 5 L Vliegkooien (om 15 cm Platen aan te passen)
- Verkrijg de benodigde materialen: 5-kwart (4,7-L) houder met deksel (afbeelding 1A ), nylon gaas en een scheermesje.
- Merk een cirkel met een diameter van 12 cm en snijd een gat in de bodem van de container met behulp van het scheermesje ( figuur 1B ). Knip een gat van 15 cm in het deksel ( figuur 1C ).
- Snijd nylon mesh in 25 x 25 cm vierkantjes.
- Plaats het gaas over de bovenrand van de houder en druk met de deksel af ( Figuur 1C ). Zorg ervo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het gebruik van dit protocol in een proteïnecomplex zuiveringsexperiment te illustreren, genereren we een homozygote levensvatbare vlieglijn, arm-EGFP-ERK , die EGFP- gemarkeerde Drosophila extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK, gecodeerd door het gerold gen) onder de controle uitdrukken Van een alomtegenwoordig uitgesproken armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . De arm.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en algemene procedure voor het opbouwen van Drosophila populatiekooien op middelgrote schaal en het maken van eiwitten van hele cellen uit embryo's. De resulterende extracten kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen, zoals zuivering van eiwitcomplexen op affiniteitsharsen. Het is van cruciaal belang om de extractiestadies op ijs uit te voeren en sterke protease remming te gebruiken, om eiwitafbraak te minimalis.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken leden van het laboratorium Veraksa voor nuttige opmerkingen over het manuscript en suggesties voor protokolverbeteringen. AV werd ondersteund door de NIH-subsidies GM105813 en NS096402. LY werd ondersteund door de universiteit van Massachusetts Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | Voor het maken van 5-L kooien. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Deksel (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8,37 inch. Deksels voor 5-L kooien. |
| Fisherbrand Petri schotels met doorzichtig deksel, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Materiaal: Polystyreen. Te gebruiken met 1-L kooien. |
| Fisherbrand Petri schotels met doorzichtig deksel, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Materiaal: Polystyreen. Te gebruiken met 5-L kooien. |
| Fisherbrand Petri schotels met doorzichtig deksel, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Materiaal: Polystyreen. Gebruikt tijdens embryo dechorionatie. |
| Sefar NITEX nylon gaas | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open gebied, gebruikt voor vliegenkooien. |
| Milwaukee 3 inch Hole Dozer Hole Saw met Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch snijgereedschap voor het maken van 1-L kooien. |
| Nalgene breed-mondige rechte PMP potten met witte polypropyleen schroefdop | Fisher Scientific | 11-823-33 | Voor het maken van 1-L kooien. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternatieve 1-L containers kunnen worden gebruikt. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pond zak | Red Star | kan worden gekocht bij Amazon.com of andere leveranciers. | |
| Bevroren 100% Appelsap Concentraat | kan worden gekocht bij een supermarkt. Het moet zeggen "100% appelsap" op het blik. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoaat | Acros Organics | AC126965000 | ook bekend als methylparabeen of Tegosept. Gebruikt als conserveermiddel in AJ-platen. |
| IGEPAL CA-630 voor moleculaire biologie, 100 ml | Sigma | I8896 | gebruikt voor het bereiden van lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow steriele wegwerpfiltereenheden met CN-membraan | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0,2 µm poriëngrootte. Gebruikt voor het filteren van 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Flesje met 20 tabletten. Gebruikt voor proteaseremming in lysis buffer. |
| Corning SFCA spuitfilters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membraan, diameter 26 mm, poriëngrootte 0,45 µm. Gebruikt voor het filteren van eindextractmonsters. |
| BD Luer-Lok wegwerpspuiten zonder naalden | Fisher Scientific | 14-823-2A | voor het filteren van eindextractmonsters. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | gebruikt voor embryo dechorionatie bij 50% (vol/vol) in water, kan worden gekocht bij elke supermarkt. Het is belangrijk om het Clorox merk te gebruiken, omdat andere merken onvolledige dechorionatie kunnen veroorzaken of giftig kunnen zijn voor embryo's. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers voor embryo verzamelingen. 74 µm mesh grootte, 6-wel. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capaciteit 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenisator voor embryo's, met losse en strakke stampers. Wheaton cat # 357544. |
Referenties
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
