Drosophila Courtship Conditioning als een maat van leren en geheugen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een Drosophila- leer- en geheugenassessie, genaamd courtship conditioning. Deze klassieke test is gebaseerd op een vermindering van mannelijk hofgedrag na seksuele afwijzing door een non-receptive premated female. Deze natuurlijke vorm van gedragsplasticiteit kan worden gebruikt om leer, kortlopend geheugen en langdurig geheugen te testen.

Samenvatting

Veel inzichten in de moleculaire mechanismen die aan het leren en het geheugen liggen, zijn opgemerkt door gebruik te maken van eenvoudige gedragsassays in modelorganismen, zoals de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster . Drosophila is nuttig voor het begrijpen van de fundamentele neurobiologie onderliggende cognitieve tekorten die voortvloeien uit mutaties in genen die verband houden met menselijke cognitieve stoornissen, zoals intellectuele handicap (ID) en autisme. Dit werk beschrijft een methodologie voor het testen van leren en geheugen door gebruik te maken van een klassiek paradigma in Drosophila, bekend als courtship conditioning. Mannetje vliegt hofvrouwen aan met behulp van een duidelijk patroon van gemakkelijk herkenbaar gedrag. Voorlopige vrouwen zijn niet ontvankelijk voor paring en zullen de mannelijke copulatiepogingen verwerpen. Als reactie op deze afwijzing verminderen mannelijke vliegen hun hofgedrag. Deze geleerde vermindering van het hofgedrag wordt in de loop van de tijd gemeten, als indicator voor leren en geheugen. De basis numéRical output van deze test is de courtship index (CI), die wordt gedefinieerd als het percentage tijd dat een man in een 10 minuten interval hoft. De leerindex (LI) is de relatieve reductie van CI in vliegen die zijn blootgesteld aan een premated vrouw in vergelijking met naïeve vliegen zonder voorafgaande sociale ontmoetingen. Voor de statistische vergelijking van LI's tussen genotypes wordt een randomisatietest met bootstrapping gebruikt. Om te illustreren hoe de test kan worden gebruikt om de rol van een gen aan te pakken die betrekking heeft op leer en geheugen, werd de pan-neuronale afbraak van Dihydroxyacetonfosfaat-acyltransferase ( Dhap-at ) hier gekarakteriseerd. De menselijke ortholoog van Dhap-at , glyceronfosfaat O-acyltransferase ( GNPT ), is betrokken bij rhizomelische chondrodysplasia punctata type 2, een autosomaal-recessief syndroom dat wordt gekenmerkt door ernstige ID. Door gebruik te maken van de courtship conditioning assay werd vastgesteld dat Dhap-at nodig is voor langdurig geheugen, maar niet voorKortlopend geheugen. Dit resultaat dient als basis voor verder onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen.

Inleiding

De moleculaire mechanismen die aan het leren en het geheugen liggen, worden door heel veel soorten behouden. De baanbrekende werk screening Drosophila melanogaster mutant lijnen voor gebreken in olfactorisch leren en geheugen heeft belangrijke moleculaire inzichten gegeven in de processen die leren en geheugen ¹ onderbouwen. In deze studies werden enkele van de eerste genen die betrokken zijn bij leren en geheugen geïdentificeerd, zoals rutabaga ² , amnesiac ³ en dunce ⁴ , die een kritische rol voor het signaleren van cyclische adenosine monofosfaat ⁵ onthullen.

Vroege genetische schermen voor geheugenmutanten werden voornamelijk uitgevoerd met behulp van olfactieve conditionering. Er zijn echter verschillende methoden om andere vormen van leren en geheugen te meten, na verloop van tijd opgetreden. Een van de meest gebruikte leer- en geheugenparadigma's, en de hier beschreven beschrijving, staan ​​bekend als cOnzetship conditioning, die voor het eerst werd beschreven door Siegel en Hall ⁶ en later werd verfijnd door een aantal andere onderzoeksgroepen ^{7 , 8 , 9} . Courtship conditionering is afhankelijk van de aanwezigheid van een specifiek feromon, cis- va-acetaat (cVA), op de vrouwelijke buik, die tijdens de copulatie door de man wordt gedeponeerd. Sensatie cVA op de vrouwelijke buik vermindert natuurlijk het hofgedrag, en in combinatie met de daad van afwijzing door het vrouwelijk, is het effect van cVA op mannelijke hofverlaging dramatisch verbeterd. Het antwoord van mannelijke vliegen in deze analyse kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door hun onderscheidend hofgedrag te waarnemen, die wordt gekenmerkt door het oriënteren naar het vrouwelijke en het volgen van het vleugel, tikken, verlengen en vibrerende vleugel, likken en proberen copulatie ¹⁰ ( Figuur 1A ). Mannelijke vliegen leren distinguis H tussen receptieve maagd- en niet-ontvankelijke vrouwtjes ¹¹ , en na seksuele afwijzing, laten ze tot 9 dagen een verminderd hofgedrag ten opzichte van non-receptieve vrouwen zien. Dit natuurlijke gedrag kan worden gebruikt om de mechanismen die aan het leren liggen, het korte termijngeheugen (STM) en het langetermijngeheugen (LTM) ^{8 , 9 , 12} te verklaren. Leren wordt gedefinieerd als de onmiddellijke vermindering van het hofgedrag dat zich voordoet tijdens de trainingsperiode en wordt vaak aangeduid als een onmiddellijk herroepengeheugen, gemeten 0 - 30 minuten na blootstelling aan een gepaard gaande vrouw ^{6 , 8} . STM wordt gemeten tussen 30 minuten en 1 uur na training, terwijl LTM meestal 24 uur na training ⁸ gemeten wordt ( Figuur 1B ). STM kan geïnduceerd worden met een 1-u-trainingstijd, maar duurt slechts 2-3 uurS = "xref"> 6 ^{, 8} . In de meeste leerparadigma's kan LTM alleen worden geïnduceerd door middel van sprake van opvallende training. Mcbride et al . (1999) ⁸ liet zien dat drie afstandsbediening, 1-h trainingssessies voldoende waren om het schipgeheugen voor maximaal 9 dagen in te schakelen, in tegenstelling tot de 2-3 uur geïnduceerd door een enkele 1-h trainingssessie. McBride et al . ⁸ ook aangetoond dat een enkele 5-h trainingssessie voor een periode van maximaal 9 dagen een vergelijkbaar LTM-respons produceerde. Vliegen hoeven niet voortdurend gerecht te worden tijdens deze 5-uursperiode, waardoor ze hun eigen gespannen training op zichzelf ontwikkelen om LTM in een enkele training te onderdrukken. Dit is van een praktisch oogpunt erg belangrijk, waardoor het gemak waarmee de test kan worden gebruikt, aanzienlijk worden verhoogd. Huidige protocollen gebruiken overwegend een enkele trainingssessie van 7-h voor LTM ^{11 , 12} . Verschillende studies hebben verschillende onderzochtMutante condities die specifieke gebreken hebben in verschillende aspecten van het leren van het hof. Bijvoorbeeld, mushroom body ablation beïnvloedt STM en LTM, maar niet leren ⁸ . Mutaties in het amnesiac gen, dat voor het eerst gedefinieerd werd als een specifieke geheugensgeheugen met behulp van olfactorische conditionering ³ , beïnvloedt STM maar niet leert ⁶ . Ontwrichting van de vertaalregelaar orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-subfamilie) en ecdyson-signalering hebben uitsluitend LTM ^{9 , 13} effect. Zo is het aanpak van een hofdienst een nuttig paradigma om de mechanismen die onderling liggen in de verschillende stadia van leren en geheugen, te ontleden.

Dit werk demonstreert een geoptimaliseerde experimentele setup die het mogelijk maakt om de relatief hoge doorvoerproeven van courtship conditioning te laten uitvoeren. Verder beschrijft het een statistisch analyse script en bespreekt kritische factoren van de analyse. Het is shBezit hier dat het Drosophila- gen Dihydroxyacetonfosfaat-acyltransferase ( Dhap-at ) Is vereist in neuronen voor LTM, maar niet voor STM. De menselijke ortholoog van dit gen, glyceronfosfaat O-acyltransferase ( GNPAT ), is gemuteerd in rhizomelische chondrodysplasia punctata type 2 ¹⁴ , een autosomale recessieve aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele beperking, aanvallen en diverse andere klinische kenmerken ¹⁵ . In deze context kan courtship conditionering gebruikt worden om de rol van menselijke ziektegenen in leer en geheugen functioneel te valideren, die een basis vormen voor mechanistische studies.

Protocol

OPMERKING: In het hieronder beschreven protocol is een replicatie van verzameling, training en test beschreven. Om de reproduceerbaarheid van de resultaten te testen, dienen deze stappen parallel, op meerdere dagen en met afzonderlijke groepen vliegen ( tabel 1) te worden herhaald. Het protocol is gebaseerd op een levenscyclus van 10 dagen, van ei tot volwassene, die normaal is bij het opvullen van vliegen onder constante omstandigheden van 25 ° C, 70% vochtigheid en een 12 uur licht / donkere cyclus. Alle aspecten van dit protocol veronderstellen dat de condities constant gehouden worden gedurende de gehele test. De tijden worden aangegeven als uren voordat de lichten aanzetten (BLO) of na het aansteken van lichten (ALO) in de incubator, aangezien dit gemakkelijk kan worden ingesteld afhankelijk van de voorkeurstijd van de onderzoeker. Gebruik alleen CO ₂ -gas voor de initiële verzameling van naïeve mannelijke vliegen en voor het verzamelen van premate-vrouwtjes. Dit protocol voor courtageconditionering bestaat uit de volgende stappen:

1. EVestiging van premisse vrouwelijke collectie culturen
2. Oprichting van culturen voor de verzameling van mannelijke proefpersonen
3. Voorbereiding van woonblokken
4. Oprichting van paring flesjes voor de productie van gestandaardiseerde premated vrouwtjes
5. Inzameling van mannelijke proefpersonen
6. Opleiding
7. testen
8. Video data analyse en statistieken

1. Oprichting van Premated Female Collection Cultures

1. Bereid powerfood uit ¹⁶ . Kook 0,8% (w / v) agar, 8% (w / v) gist, 2% (w / v) gist extract, 2% (w / v) peptonon, 3% (w / v) sucrose, 6% W / v) glucose, 0,05% (w / v) MgS04 en 0,05% (w / v) CaCl2 in water gedurende 15 minuten. Laat de oplossing afkoelen tot 70 ° C alvorens 0,05% (w / v) methylparabeen (VOORZICHTIG: giftig) en 0,5% (v / v) propionzuur (VOORZICHTIG: giftig) toe te voegen. Meng goed door roeren terwijl u verder koelt tot 50 ° C om een ​​homogene oplossing te verkrijgen.
2. Voor het eten dusDeksel bij kamertemperatuur, voeg ~ 50 ml powerfood toe aan elke 175 ml plastic injectieflacon. Laat het eten verder afkoelen. Sluit de injectieflacon met een stekker.
   OPMERKING: Powerfood is een gespecialiseerd voedselmengsel dat speciaal is ontworpen voor de productie van grote aantallen vliegen, vermoedelijk door het inbrengen van eieren. Powerfood wordt niet gebruikt om mannelijke vliegen te produceren die gebruikt worden voor gedragsanalyse (stap 2) omdat het atypische dieet en potentiële drukwerk de ontwikkeling kunnen beïnvloeden.
3. Op dag -11 ( Tabel 1 ) start 5-20 wildtypeculturen met ongeveer 60-100 vliegen (een mix van mannen en vrouwen) in voedingsflacons; Deze zullen in stap 4 gebruikt worden om gestandaardiseerde premated vrouwen ^{17 te} produceren. Voeg een filterpapier toe aan elke injectieflacon om het gebied te vergroten waarop de larven kunnen poppen; Dit verhoogt het aantal vliegen dat kan sluiten.
4. Herhaal stap 1.1-1.3 regelmatig gedurende het experiment om voldoende nieuwe eclosing vliegen te verkrijgen als input voor de"Oprichting van paring flesjes voor de productie van gestandaardiseerde premated vrouwen" (stap 4).

2. Oprichting van culturen voor het verzamelen van mannelijke testonderwerpen

1. Bereid normaal voedsel ^{16 op} , gemaakt met 0,5% (w / v) agar, 2,75% (w / v) gist, 5,2% (w / v) maïsmeel, 11% (w / v) suiker, 0,05% ) Methylparabeen en 0,5% (v / v) propionzuur in water, zoals beschreven in stappen 1.1 en 1.2. Sluit de 175 ml plastic flesjes met een flesje flesje.
2. Op dag -10 ( Tabel 1 ) plaats ongeveer 10-20 mannen met ongeveer 30-75 maagden vrouwelijke ( Materialen / Apparatuur Tabel ) in elke 175 ml injectieflacon met normaal voedsel. Voeg een filterpapier toe om het oppervlak te verhogen voor het pupillen en om de productiviteit te maximaliseren.
3. Bepaal drie tot zes 175 ml flesjes per genotype om het benodigde aantal proefpersonen te verkrijgen.
   OPMERKING: Meer injectieflacons kunnen nodig zijn, afhankelijk van de productiviteit van het gewenste genotype.

3. Bereiding van huisvestingsblokken ( figuur 2A )

1. Smelt ongeveer 50 ml energievoeding per huisblok in een magnetron of maak het fris.
2. Voeg 500 μL powerfood toe aan elke put in een 96-puts, vlakke bodem met behulp van een multidispenser pipette.
3. Laat het voedsel op kamertemperatuur stollen.
4. Bedek de blokken met PCR lijmfolie en gebruik een naald om minstens 4 gaten per put te maken om de vliegen verse lucht te geven.
5. Om elke put te kunnen openen, gebruik een scheermesje om de lijmfilm langs de lengterichting tussen elke rij te snijden. Laat de film in één kant van het blok los.
6. De blokken kunnen maximaal 2 dagen bij 4 ° C worden opgeslagen.
   OPMERKING: Laat de blokken voor het gebruik opnieuw in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.

4. Oprichting van parende flesjes voor de productie van gestandaardiseerde premiertjes

1. Op dag -1, verwijder enVerwijder alle volwassen wildtype vliegen van premisse vrouwelijke collectie culturen op 2-5 uur BLO.
2. Verzamel vliegen met behulp van de aspirator ( Figuur 2B ) uit deze injectieflacons in intervallen van 2 tot 3 uur ( bijv. Bij 30 minuten, 2,5 uur en 5 uur ALO) en plaats ze in een nieuw injectieflacon met voedingsmiddelen aangevuld met een kleine hoeveelheid gist Plak en filter papier.
3. Om overbelasting te voorkomen en een optimale paringsfeer te bevorderen, mag u niet meer dan 150-200 vliegen overbrengen naar elke nieuwe injectieflacon. Zorg ervoor dat alle vrouwtjes met elkaar worden gemonteerd door ten minste 25% mannen te voorzien. Zorg ervoor dat er voldoende vrouwtjes aanwezig zijn in de paringsflessen om de grootte van het experiment op te nemen.
   OPMERKING: Aangezien dit een cruciale stap in het protocol is, moet u ervoor zorgen dat alleen verse vlokken en geen oude vliegen, larven of poppen worden overgebracht naar de nieuwe paringsfles.
4. Incubeer deze "paring flesjes" gedurende vier dagen om voldoende tijd te geven voor alle vrouwtjes om te hebben gepaard.

5. ColLectie van mannelijke testonderwerpen

1. Op dag 1 ( tabel 1 ) om 2-3 uur BLO, gebruik CO ₂ om alle volwassen vliegen uit de mannelijke collectie flesjes te verwijderen (stap 2), Maar laat meer vliegen in de komende paar uur sluiten.
2. In de komende 5-6 u verwijdert u de nieuwste gesloten vliegen elke 20-30 minuten met CO ₂ en zet elke man in een afzonderlijke put van het huisblok (stap 3) met behulp van de aspirator ( figuur 2B ).
3. Zet de put opnieuw af met de lijm PCR film.
   OPMERKING: Dit is een cruciale stap in het protocol. De mannen moeten regelmatig worden verzameld. Verzamelde mannen moeten in het huisvesting dicht bij de tijd van de eclosie worden geïsoleerd, wanneer zij bleek pigmentatie en de aanwezigheid van het meconium in de doorzichtige buik aantonen.
   OPMERKING: Zacht gebruik van de aspirator zorgt voor de overdracht van vliegen; Onjuist gebruik zal de vliegen echter aanzetten, waardoor variatie in de analyse wordt veroorzaakt (zie de discussie).
4. Doel op coLegeren tot 48 mannen per genotype. Dit zorgt voor een kleine overmaat aan het maximale aantal mannen dat nodig is voor de analyse van zowel naïeve als opgeleide condities, waardoor er enige verlies kan worden veroorzaakt tijdens latere overdrachtsstappen.

6. Training

1. Verwijder de vliegen uit de paringsfles (stap 4.2) met behulp van CO ₂ en scheid de premated vrouwtjes van de mannen.
2. Met behulp van de aspirator, voeg een enkel verdoofde, premated vrouw in elke put in één rij van een nieuw huisblok.
3. Met behulp van de aspirator en zonder verdoving, overstappen van een individueel naïef mannetje van het huisvestingsblok dat in stap 5.2 is ingesteld in de put die een voorgebonden vrouw bevat. Nadat het mannetje in de put is geplaatst, moet u onmiddellijk opnieuw afdichten met de lijmfolie; Laat het man niet toe om te ontsnappen.
   OPMERKING: Breng mannelijke vliegen van de aspirator naar het huisblok door gebruik te maken van hun natuurlijke 'negatieve geotaxis'-gedrag (zie de discussie).
4. Herhaal stappen6.2-6.3 tot er genoeg mannelijke vrouwelijke paren zijn gevestigd. Stel ideaal 24 paren, twee volledige rijen van een huisblok, per genotype vast. Laat de overige naïeve mannen achter in het originele behuizingsblok, dat is ingesteld in stap 5.2.
5. Laat de mannelijke vrouwelijke paren ongestoord tijdens de trainingsperiode ( tabel 2 , figuur 1B ).
   OPMERKING: In deze tijd zal de man gerecht worden en wordt afgewezen door de premisse vrouw. Voor het leren en STM is de trainingsperiode 1 uur en voor LTM is de trainingsperiode 7-9 uur.
6. Beëindig de training ( Tabel 2 , Figuur 1B ) door gebruik te maken van een aspirator om het mannetje voorzichtig van het voorgebonden vrouw te scheiden; Gebruik geen verdoving. Plaats het gescheiden man in een nieuw huis.
7. Gebruik de aspirator om alle naïeve mannen zacht en zonder verdoving over te brengen van het huisvestingsblok dat in stap 5.2 is ingesteld op een nieuw huisblok.
   OPMERKING: Deze stap is optioneel voor STM en LEARning, maar het is zeer belangrijk voor LTM omdat de vliegen nog 24 uur gehuisvest worden om LTM te testen.
8. Voor STM en LTM, laat de mannen 1h en ~ 24 uur rusten ( Tabel 2 , Figuur 1B ) voordat ze worden getest (stap 7).
9. Voor het leren testen de getrainde en naïeve mannen onmiddellijk (stap 7).

7. Testing

1. Verzamel vliegen uit paring flesjes (stap 4.2) met behulp van CO ₂ en scheid de premated vrouwtjes van de mannetjes.
2. Laat de vrouwtjes gedurende tenminste 1 uur terugvinden van de verdoving in een injectieflacon met normaal voedsel.
3. Monteer de videorecorders op voorhand ( Figuur 2C ) om alle apparatuur klaar te hebben voordat het testen start.
4. Begin het testen volgens de verschillende tijdlijnen voor leren, STM en LTM ( Tabel 2 , Figuur 1B ). Test onmiddellijk na de trainingVoor het leren, 1 uur na training voor STM en 24 uur na training voor LTM.
5. Met behulp van de aspirator moet u een individueel mannetje uit het rustblokhuis of vanuit het trainingshuis blokzetten als het leren wordt getest (stap 6.7, getraind, stap 6.8, naïef) naar de helft van een arena met de divider gesloten ( figuur 2D ; Zie File S1 voor een bouwplan).
   OPMERKING: Het gebruik van het natuurlijke "negatieve geotaxis" -gedrag moet voldoende zijn om de mannelijke vliegen van de aspirator naar de arena te verplaatsen (discussie).
6. Verplaats het toegangsgat snel naar de volgende arena en herhaal stap 7.5 totdat alle 18 arena's een mannetje bevatten.
7. Met behulp van de aspirator en zonder CO ₂ , voeg een voorgebonden vrouw (verzameld in stap 7.2) toe aan de andere helft van alle 18 arena's.
8. Plaats de tribune onder de camera voorzichtig, met de opening van de bronnen naar beneden gericht ( Figuur 2C ).
9. Verwijder de verdeler van de arena's om directe interactie tussen de mannen en de voormalige vrouwen mogelijk te maken.
10. Begin meteen het gedrag gedurende minstens 10 minuten op te nemen.
    OPMERKING: Bij het gebruik van een camera met twee camera's kan de parallelle opname van twee schuifplaten worden uitgevoerd in overlappende tijdstippen om de efficiëntie te maximaliseren.
11. Gebruik de handdoekreiniger om de gerechtsgebieden leeg te maken en laat de kamer van de hofdienst ventileren voordat het opnieuw wordt gebruikt.
12. Herhaal stap 7.4-7.11 tot het testen van alle genotypes en condities (naïef en getraind) is voltooid.

8. Video Data Analysis en Statistics

1. Bereken de courtship index (CI), gedefinieerd als het percentage van de tijd die de mannelijke rechtbanken tijdens de eerste 10 minuten van de testperiode, voor elke individuele mannelijke vlieg.
   OPMERKING: dit kan handmatig worden gedaan door stereotypisch hofgedrag ( figuur 1A ) of door u te observerenZing computer software voor geautomatiseerde kwantificering van het hofgedrag (discussie).
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om in de loop van drie dagen 40-60 mannen per conditie te analyseren om voldoende statistische kracht te behalen en de consistentie van de CI-gegevens te beoordelen.
2. Bereken de leerindex (LI), gedefinieerd als de procentuele reductie in de gemiddelde CI van getrainde mannen in vergelijking met naïeve mannen (LI = (CI _naïef - CI _getraind ) / CI _naïef ). Evalueer de LI voor elke testdag en vergelijk het met de cumulatieve LI berekend van alle gecombineerde testdagen.
3. Maak een afzonderlijk tabblad met twee kolommen tabblad met "Genotype" en "CI" als de koptekst.
   OPMERKING: deze rubrieken zijn hoofdlettergevoelig. De naam van het genotype voor elke CI moet bestaan ​​uit een beschrijving van het genotype gevolgd door een onderstreping en de opleidingsconditie ( bv genotype_N en genotype_LTM, enz., Waar N = naïef en LTM = lange termijngeheugen; Zie aanvullend bestand S2 voor een voorbeeld). Deze annotatie is essentieel, aangezien de functie analearn getrainde en naïeve vliegen zal identificeren op basis van de karakters die na de eerste onderstreping in de kolom "Genotype" aanwezig zijn.
4. Gebruik het analearn R-script (Aanvullend Bestand S3) om een ​​randomisatietest uit te voeren om de statistische betekenis van verschillen tussen de LI-waarden van verschillende genotypes te beoordelen.
   1. Breng het script (Aanvullend Bestand S3) in R ¹⁸ , die een functie genaamd "analearn" definieert.
      OPMERKING: De functie definitie is: analearn <- functie (nboot = 10.000, naivevel = 'N', refmutation = NA, datnaam = NA, header = TRUE, zaad = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Begin met de functie "analearn ()" in de opdrachtregel R en selecteer het data-bestand dat geanalyseerd moet worden (geproduceerd in stap 8.3) via het pop-upvenster.
   3. Kies de referentie mutatie, welkeIs het controle genotype, door het corresponderende nummer in te voeren en op Enter te drukken.
      OPMERKING: Na het selecteren van het referentie genotype, duurt het script enkele seconden om 10.000 bootstrap replicaten uit te voeren.
   4. Let op de uitvoertabel (tabel 3), die het genotype, leeromstandigheden bevat ( dwz leer, STM of LTM), gemiddelde CI naïeve, gemiddelde CI getraind, LI, het verschil tussen de LI van de controle in vergelijking met de experimentele conditie (LI dif), de onderste limiet (LL) en de bovenste limiet (UL) van het 95% betrouwbaarheidsinterval van de LI dif en de p- waarde die de waarschijnlijkheid laat zien dat er geen significant verschil is.
      OPMERKING: analearn zal een uitvoertekstbestand opslaan in de directory waar het gegevensbestand zich bevindt. De outputtabel verschijnt echter ook in de R-Studio-console. De standaardnaam is geconstrueerd op basis van de naam van het verstrekte gegevensbestand.
   5. Er zijn verschillende argumenten in de analearn functie die gebruikt kan worden om de de te wijzigenFout instellingen van de functie om de parameters van de bootstrapping aan te passen.
      OPMERKING: "nboot" definieert het aantal opstartreplicaties en is standaard ingesteld op 10.000. Deze waarde kan worden omgezet in een geheel getal groter dan nul. Tabel 5 bevat verschillende argumenten die kunnen worden gebruikt om de standaardinstellingen van de functie te wijzigen. Het is echter niet raadzaam om gegevens te gebruiken die worden geproduceerd met een laag aantal opstartreplicaties.

Resultaten

De test voor de conditiebeheersing kan gebruikt worden voor het meten van leren en geheugen in Drosophila . Om dit te demonstreren analyseren de hier weergegeven resultaten STM en LTM in controlevliegen in vergelijking met vliegen met de neuron-specifieke knockdown van Dhap-at. Controle mannetjes drukken een RNA-interferentie haarspeldsequentie uit die gericht is op een Caenorhabditis elegans-specifiek gen, vermoedelijk zinkvinger eiwit C02F5.12 ¹⁹ . Deze controlespanning zorgt voor een gelijke hoeveelheid opwaartse activerende sequentie (UAS) elementen tussen de knockdown en control in dezelfde genetische achtergrond, en de RNAi-haarspeld controle regelt eventuele niet-specifieke effecten van het RNAi-systeem. Controle mannetjes (genotype: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) tonen een significante vermindering van CI in getrainde versus naïeve voor beide STM ( Figuur 3A , p = 1,2 x 10 ^{- 4} , Mann-WhitneY-U-test) en LTM ( Figuur 3B , p = 1,2 x ^10-4 , Mann-Whitney U-test). Dit resultaat weerspiegelt de normale capaciteit voor leren en geheugen in deze vliegen. Dhap-at knockdown vliegen (genotype: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) tonen ook een significante vermindering van CI in getrainde versus naïeve vliegen voor STM ( Figuur 3A , p = 1,2 x ^10-4 , Mann-Whitney U-test). Echter, ze tonen niet een significante vermindering van CI na LTM training ( Figuur 3B , p = 0,33, Mann-Whitney U-test). De Mann-Whitney U-test werd gebruikt om de gemiddelde CI van naïeve en getrainde vliegen te vergelijken door de niet-parametrische verdeling van de CI-gegevens voor sommige omstandigheden ( Figuur 3A en 3B ). De verschillen waargenomen door de analyse van CI's worden weerspiegeld door de LI voor elk genotype, dat de percentages reducti meetIn CI in naïeve versus getrainde vliegen ( Figuur 3C ). Er is geen significant verschil in LI tussen controles en Dhap-at-knockdown vliegen voor STM ( p = 0.115, 10.000 bootstrap replicaten, Figuur 3C , Tabel 3 ), terwijl de LI voor LTM significant lager is in Dhap-at knockdown vliegen ( p = 0.0034, 10.000 bootstrap replicaten, Figuur 3C , Tabel 3 ). Voor de vergelijking van LI tussen genotypen wordt een randomisatie test ²⁰ aangepast uit een methode die eerst aanbevolen werd door Kamyshev et al. ⁷ werd gebruikt. Aangezien de LI een enkele waarde is die afgeleid is van populatiegegevens ( dwz gemiddelde CI-naïeve en gemiddelde CI-getrainde), zijn standaard statistische methoden die gebaseerd zijn op experimentele afgeleide verdelingen niet van toepassing. De randomisatie test is distributievrij en gebruikt bootstrapping ( dwz random sampleNg met vervanging) om hypothetische datasets te genereren die afgeleid zijn van de werkelijke gegevens. Het analearn script (File S3) genereert een set hypothetische LI's voor elk genotype en berekent het verschil tussen de controle en het testgenotype (LIdiff). Dit proces wordt 10.000 keer herhaald en de resulterende waarden worden gebruikt om het 95% betrouwbaarheidsinterval van LIdiff te bepalen ( tabel 3 ). Deze gegevens worden gebruikt om een p- waarde te genereren die de waarschijnlijkheid laat zien dat de LI van de twee genotypes anders is. De hier weergegeven resultaten tonen aan dat Dhap-at nodig is in neuronen voor LTM, maar niet voor STM.

Om te kunnen controleren op de dagelijkse variabiliteit worden CI's en LI's vergeleken tussen de replicerende dagen ( tabel 4 ). Hoewel sommige fluctuaties in LI van dag tot dag worden waargenomen, zijn de resultaten over het algemeen reproduceerbaar. Het is belangrijk om op te merken dat de CI-gegevens sterk kunnen variëren afhankelijk van de controle strGebruikt en de milieuomstandigheden van het testen. De hier weergegeven CI-gegevens zijn typisch voor dit controle genotype, maar andere genotypen kunnen een hogere of lagere gemiddelde CI en verdeling hebben.

Figuur 1: Bepaling van het hofregister en het experimentele overzicht. ( A ) Beelden die stereotypisch mannelijk hofgedrag tonen naar een vrouwelijke vlieg. Verschillende stadia van het hofgedrag worden getoond: oriëntatie (I), (II), vleugelvibratie (verlenging) en tikken (III), likken (IV) en poging tot copulatie (V). ( B ) Schematisch overzicht van trainings- en testtijden ten opzichte van de incubatorlichtcyclus, gemarkeerd in uren. Trainingstijden worden aangegeven met staafjes, rusttijden voor STM en LTM worden aangeduid met een streeplijn en het startpunt van het test wordt aangegeven als een pijl. Merk op dat deDe testtijd voor LTM is de dag na het trainen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Apparatuur gebruikt voor de Drosophila Courtship Conditioning Assay. ( A ) Het behuizingsblok is een vlakke bodemblok met 500 μL energievoeding per putje. Het is verzegeld met een qPCR kleeffolie met minstens 4 gaten per putje die zijn gemaakt met behulp van een spuitnaald met een diameter van 0,8 mm. Individuele rijen worden langwerpig in strips gesneden met een scheermesje om opening en sluiting mogelijk te maken. ( B ) De aspirator is nodig voor de zachte overdracht van mannelijke en vrouwelijke vliegen zonder gebruik van verdoving. De inzet toont het uiteinde van de aspirator, afgesloten met een stuk katoenEp de vliegen binnen de punt. ( C ) Opstelling van een tweecamera systeem voor het gelijktijdig opnemen van twee vensterschappen. ( D ) Een hofzaal met 18 arena's. Schuifgaten worden gebruikt om de vliegen in de arena's te plaatsen. De witte verdelers kunnen gelijktijdig geopend worden om de wisselwerking tussen mannen en vrouwen te starten. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Analyse van STM en LTM in Control en Dhap-at Knockdown Flies. ( AB ) Boxplots die de verdeling van CI-waarden voor naïeve (N) en getrainde (T) vliegen van de controle (grijze) en Dhap-at- knockdown (witte) genotypen tonen die voor STM (A) en LTM (B) zijn getest. ( C ) CorrespoNding LI waarden voor controle en Dhap-at knockdown vliegen getest voor STM en LTM. Verschillen in LI tussen controle en knockdown genotypes werden vergeleken met een randomisatie test (10.000 bootstrap replicaten). Foutstaven geven de standaardfout aan van het gemiddelde afgeleid van de LI-waarden die op verschillende testdagen worden berekend. De genotypen zijn: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; En elav-Gal4 / + (Control) En w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; En elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Algemeen	Verzamelen	Trein	Test
Dag -11	Begin vooropgestelde vrouwelijke collectie culturen (stap 1.3)
Dag -10	Begin culturen voor de verzameling van mannelijke proefpersonen (stap 2.2)
dag 1		rep. 1
dag 2		rep. 2
dag 3		rep. 3
Dag 4		rep. 4	rep. 1
Dag 5			rep. 2	rep. 1
Dag 6			rep. 3	rep. 2
Dag 7			rep. 4	rep. 3
Dag 8				rep. 4
Dag 9	Video data analyse en statistieken (stap 8)
Rep = herhalen

Tabel 1 : Voorbeeld Tijdlijn voor het testen van LTM over drie replicaten op individuele dagen.

	Aan het leren	STM	LTM
Trainingstijd	1 uur	1 uur	8 uur.
Rusttijd	0 uur.	1 uur	~ 24 uur.
Start training	0h. ALO	0 uur. ALO	4 uur BLO
Stop met training	1 uur ALO	1 uur ALO	4 uur ALO
Start test	1 uur ALO	2 uur ALO	0 uur. ALO (volgende dag)
ALO = na lichten aan, BLO = voordat lichten aanzetten, STM = kort termijngeheugen, LTM = langdurig geheugen

Tabel 2 : Trainingstijd, Trainingstijden, en Testtijden voor leren, STM en LTM.

Genotype	Aan het leren staat	CI naief	CI getraind	LI	LI verschil	Onderste limiet (95% conficence interval)	Bovengrens (95% conficence interval)	p-value
Controle	STM	0,467	0,116	0,752	NA	NA	NA	NA
DHAP-at-RNAi	STM	0,699	0,257	0,633	0,119	-0,030	0,265	0,116
Controle	LTM	0.590	0,384	0,348	NA	NA	NA	NA
DHAP-at-RNAi	LTM	0,697	0.650	0,068	0,280	0,103	0.446	0,003

Tabel 3: Statistische gegevens geproduceerd uit het Analearn Script.
Statistische gegevens uit het analearn script. Het uitvoerbestand van het bootstrapping R-script dat het genotype, leerconditie bevat ( dwz leer, STM of LTM), betekent CI naïeve, gemiddeld CI-getraind, LI, verschil tussen LI van de controle in vergelijking met de experimentele conditie (LI dif) , De onderste limiet (LL) en de bovengrens (UL) van het 95% betrouwbaarheidsinterval van LI dif en de p- waarde die de waarschijnlijkheid laat zien dat er geen significant verschil is.

		Controle			DHAP-at-RNAi
		Gemiddeld CI naïef	Gemiddelde CI opgeleid	LI	Gemiddeld CI naïef	Gemiddelde CI opgeleid	LI
STM	Dag 1	0.300	0,125	0,584	0,679	0,239	0,648
	Dag 2	0,634	0,107	0,831	0.720	0,276	0,617
	Alle dagen	0,467	0,116	0,752	0,699	0,257	0,633
LTM	Dag 1	0.590	0,441	0.252	0.630	0,646	-0,027
	Dag 2	0,640	0,363	0,432	0,709	0,710	-0.002
	Dag 3	0,547	0,349	0,363	0,738	0,598	0.190
	Alle dagen	0.590	0,384	0,348	0,697	0.650	0,068

Tabel 4 : CI- en LI-waarden verkregen op afzonderlijke testdagen.

"Naivelevel" bepaalt de tekst die naïeve waarden voor elk genotype zal identificeren. De standaardwaarde is 'N', maar dit kan worden omgezet in een andere alfanumerieke tekst.

"Refmutation" is standaard ingesteld op "NA" (niet van toepassing), maar kan worden veranderd in de naam van de controle of het genotype om statistische vergelijkingen uit te voeren. Dit zorgt ervoor dat de sCript om automatisch het controle genotype te selecteren.

"Datname" verwijst naar de naam van het gegevensbestand en kan in dit argument worden opgegeven in plaats van de standaardbestandselectie.

"Header" kan worden gebruikt om aan te geven of het gegevensbestand kolomkoppen bevat of niet. De standaardwaarde is "TRUE", maar een bestand zonder kopteksten kan worden gebruikt wanneer dit argument is veranderd in "FALSE."

"Zaad" initialiseert de willekeurige getallengenerator. Dit is standaard ingesteld op "NA" en zorgt voor een willekeurig aantal telkens wanneer het script wordt gebruikt. Door het ontwerp zal een bootstrap-analyse elke keer dat het wordt uitgevoerd, iets anders verschillen, zelfs wanneer u hetzelfde gegevensbestand gebruikt. Wanneer het zaad is opgegeven met een geheel getal groter dan nul, wordt dezelfde reeks willekeurige opstartmonsters verkregen.

"writeout Put "kan ingesteld worden op" TRUE "of" FALSE "om te bepalen of een output bestand gegenereerd wordt. De standaardwaarde is 'TRUE.'

Tabel 5: Argumenten die worden gebruikt in de Analearn-functie die de standaardinstellingen van de functie kunnen wijzigen om de parameters van de opstartstrapping aan te passen

Aanvullend Bestand S1: Bouwplan van een hofzaal. Het bestand kan worden geopend met elke applicatie die .stp extensions (CAD-files) mogelijk maakt . Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand S2 : Voorbeeld van een invoerbestand voor het Analearn Script .S2.zip "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand S3 : Analyse.R Acript. Het bestand kan met R-studio ¹⁸ geopend worden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De courtage conditie test is een klassiek paradigma voor de analyse van leer en geheugen in Drosophila . Het hier gepresenteerde protocol volgt de algemene methodologie die eerder is beschreven ^{6 , 7 , 8 , 9} maar bevat unieke aspecten zoals praktische richtlijnen, gespecialiseerde apparatuur en een data analyse script ^{9 , 12} voor randomisatie tests. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om tegelijkertijd grote aantallen vliegen te analyseren met behulp van 96-brede platbodemblokken ( figuur 2A ) om mannen te verzamelen en trainen. De blokken zijn afgesloten met PCR kleefstof, waardoor de vliegen gemakkelijk toegankelijk zijn wanneer nodig. Daarnaast maken de hier beschreven uniek hofkamers mogelijk voor het gelijktijdig koppelen van 18 mannelijke-vrouwelijke paren in een bijna tweedimensionale ruimte die ikS optimaal voor video analyse. De op maat gemaakte hofkamers zijn eenvoudig te gebruiken, en een bouwplan is beschikbaar ( File S1 , Figuur 2D ). Dit protocol, van de oprichting van de culturen die testvakken verzamelen bij de aanschaf van videodata, duurt ongeveer 20 dagen ( tabel 1 ). Extra tijd is nodig voor de analyse van videodata. In onze ervaring is de STM-test extreem robuust. De LTM-analyse is ook vrij robuust, maar het is gevoeliger voor het verwarmen van omgevingsvariabelen en kan daarom moeilijker zijn om te beheersen.

Dierlijk gedrag kan vrij variabel zijn. Daarom moeten kritische stappen in het protocol met zorg worden uitgevoerd om deze variantie te verminderen. Ten eerste zal het zacht gebruik van de aspirator ( figuur 2B ) de stress verminderen die door ruwe hantering kan worden opgelegd of door te sterk uit te blazen. Een voorgestelde methode om het individu over te dragenVliegen uit de aspirator is door gebruik te maken van negatieve geotaxis. Aangezien vliegen de neiging hebben om op te lopen, kan men gewoon de punt van de aspirator opwijzen; Net voordat de vlieg de punt bereikt, is een zachte klap voldoende om de vlieg uit te laten. Bovendien, om de mannen in de kamer te laten vallen alvorens te testen, is een blaas vaak niet nodig.

Een andere belangrijke stap is het verzamelen en genereren van mannelijke proefpersonen. Alle mannen moeten worden verzameld als ze heel jong en sociaal naïef zijn. Dit kan bereikt worden door frequente inzameling tijdens de piekperiodes van eclosie (stap 5.2). Als mannen niet in dit strakke tijdvak worden verzameld, kunnen ze vroege sociale interacties hebben, wat kan leiden tot slecht leren of hoge variabiliteit in CI. Een andere factor mannelijke proefpersonen die moeten worden beoordeeld is de genetische achtergrond. Verschillende genetische achtergronden zullen verschillende niveaus van naïeve verweerders tonen en kunnen ook verschillen in algemene activiteit of locomotorische vaardigheden. Bij compaRing meerdere genotypen, moet er rekening worden gehouden met genetische achtergrond om deze confounding factoren te vermijden die LI scores kunnen beïnvloeden. Daarnaast moet de verdeling van de CI-gegevens zorgvuldig worden beoordeeld. CI-gegevens kunnen zowel parametrisch als niet-parametrisch zijn, afhankelijk van het genotype of andere omgevingsfactoren. In sommige gevallen, als de verdeling van CI drastisch verschuift van een normale verdeling, kan het beter zijn om de mediaan-CI te gebruiken dan de gemiddelde voor de berekening van LI's. In onze ervaring maakt het gebruik van median of gemiddelde CI echter geen verschil in de statistische interpretatie van de gegevens, en het gebruik van de gemiddelde CI is de algemene praktijk in de literatuur.

Voor een succesvolle opscheidingsconditionering is de actieve afwijzing van mannelijke proefschieten door premisse vrouwen in de training periode van cruciaal belang. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de voorgebonden vrouwtjes die in deze test zijn gebruikt, efficiënt georganiseerd zijn en zijnWaardoor geen copulatie mogelijk is. Deze voorspelling is gevestigd in de paringsflacons bereid in stap 4, waar mannelijke en vrouwelijke vliegen gedurende 4 dagen samen worden gehouden ( tabel 1 ). Vervolgens kan paring worden gecontroleerd door regelmatig onderzoek van testvideo's en tijdens het trainen van mannelijke vrouwelijke paren. Als er paring plaatsvindt, zijn er verschillende maatregelen die kunnen worden genomen tijdens de voorbereiding van premated vrouwen. Ten eerste moeten premie-vrouwtjes worden geoogst onder optimale fokomstandigheden. Flesjes kunnen aangevuld worden met gistpasta en een gevouwen filterpapier om potentiële parkeervlakken te vergroten. De incubatie van vliegen onder de hier beschreven omstandigheden heeft in het verleden robuuste premate vrouwtjes geproduceerd, maar dit kan variëren in verschillende laboratoria en met behulp van verschillende genetische stammen. Daarom kan het nodig zijn om de generatie van voorgebonden vrouwen te optimaliseren door de incubatietijd en de omstandigheden te variëren.

Kwantificering van het gedrag van het hof isNog een kritische stap in dit protocol. Dit kan handmatig of automatisch gebeuren met behulp van gespecialiseerde softwareprogramma's ⁹ . Geautomatiseerde kwantificering is snel en in principe onbevooroordeeld. Verschillende programma's zijn gepubliceerd ^{21 , 22 , 23} ; Ze zijn echter niet eenvoudig te gebruiken, waarbij vaak gespecialiseerde videoformaten en geavanceerde computervaardigheden nodig zijn. Handmatige kwantificering is eenvoudig en accuraat, maar het is zeer arbeidsintensief en onderhevig aan individuele variabiliteit en vooroordeel. Het is belangrijk om te benadrukken dat dit protocol niet voldoet aan de vereisten voor video-opmaak die mogelijk nodig zijn voor de geautomatiseerde kwantificering van CI's. Voor handmatige kwantificering, gebruik een simpel video-opnameapparaat dat de mogelijkheid heeft om een ​​video van voldoende kwaliteit te produceren om het gedrag van de rechter te waarnemen. Voor geautomatiseerde kwantificering zal er waarschijnlijk anders zijnEisen afhankelijk van de gebruikte software, en gebruikers moeten dit grondig onderzoeken als geautomatiseerde kwantificering gewenst is.

In combinatie met de uitgebreide gereedschappen die beschikbaar zijn voor de genetische manipulatie van vliegen, biedt de courtage conditional assay een robuuste uitlezing die kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen en neuronale netwerken die betrokken zijn bij leren en geheugen te ontleden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
voer
Agar	Sigma	A7002
Gist	Bruggeman	-
Gistextrakt	MP biomedicals	0210330391
Pepton	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabeen (VOORZICHTIG)	Sigma	H5501
Propionzuur (VOORZICHTIG)	Sigma	P1386
Demineraliseerd water	-
Gistpasta	-		mengsel van gistkorrels en water in een verhouding van 1:1
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
normaal voer
Agar	MP biomedicals	215017890
Gist	bruggeman	-
Maïsmeel	de Molen	-
Suiker	de Molen	-
Methylparabeen (VOORZICHTIG)	Sigma	H5501
Propionzuur (VOORZICHTIG)	Sigma	P1386
Demineraliseerd water	-