Dit artikel beschrijft twee nieuwe ImageJ-plugins voor 'Clock Scan' beeldanalyse. Deze plugins vergroten de functionaliteit van het oorspronkelijke Visual Basic 6-programma en, belangrijker, maakt het programma beschikbaar voor een grote onderzoeksgemeenschap door het te bundelen met het ImageJ gratis beeldanalysesoftwarepakket.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Clock Scan Protocol voor Image Analysis: ImageJ Plugins
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het klokscanprotocol voor beeldanalyse is een efficiënt instrument om de gemiddelde pixelintensiteit binnen, aan de grens en buiten (achtergrond) een gesloten of gesegmenteerd convexvormig gebied van belang te kwantificeren, wat leidt tot het genereren van een gemiddelde integrale radiale pixel- Intensiteitsprofiel. Dit protocol werd oorspronkelijk in 2006 ontwikkeld, als een visuele basis 6 script, maar als zodanig heeft het een beperkte distributie gehad. Om dit probleem aan te pakken en om andere recente inspanningen van anderen aan te sluiten, hebben we de oorspronkelijke klok-scanprotocolcode omgezet in twee op Java gebaseerde plugins die compatibel zijn met NIH-gesponsorde en vrij beschikbare beeldanalyseprogramma's zoals ImageJ of Fiji ImageJ. Bovendien hebben deze plugins verschillende nieuwe functies, waardoor het bereik van mogelijkheden van het oorspronkelijke protocol verder wordt uitgebreid, zoals analyse van meerdere regio's van interesse en beeldstapels. Het laatste kenmerk van het programma is vooral handig in toepassingen waarin het belangrijk is om de verwante veranderingen te bepalenNaar tijd en locatie. Zo kan de klokscananalyse van stapels biologische afbeeldingen mogelijk worden toegepast op het verspreiden van Na + of Ca ++ binnen een enkele cel, evenals de analyse van spreidende activiteit ( bijv . Ca ++ golven) in synaptische populaties -verbonden of kloofverbinding-gekoppelde cellen. Hier beschrijven we deze nieuwe klok scan plugins en tonen enkele voorbeelden van hun applicaties in beeldanalyse.
Inleiding
Het doel van dit werk is het presenteren van een Clock Scan-protocol dat platformvrij en vrij beschikbaar is voor elke onderzoeker die geïnteresseerd is in dit type beeldanalyse. Het protocol voor Clock Scan is oorspronkelijk ontwikkeld in 2006 1 , met als doel het verbeteren van bestaande methoden van pixelintensiteitskwantificering binnen convexvormige belangengebieden (ROI), een methode die een betere integratieve capaciteit en verbeterde ruimtelijke resolutie heeft. Tijdens de overname verzamelt het protocol opeenvolgende meerdere radiale pixelintensiteitsprofielen, gescand van het ROI-centrum naar de grens of op een vooraf bepaalde afstand buiten de ROI om de pixelintensiteit van de achtergrond te meten. Het protocol schaal deze profielen volgens de celradius, gemeten in de richting van de scan. Zo is de afstand van het centrum tot de ROI grens van elke individuele radiale scan altijd 100% van de X-schaal. Tenslotte is het programma gemiddeld deze persoonAl profielen in één integraal radiaal pixel-intensiteit profiel. Door middel van schalen hangt het gemiddelde pixelintensiteitsprofiel, dat is geproduceerd door het "Clock Scan" protocol, niet op de ROI-grootte, noch binnen redelijke grenzen, op de ROI-vorm. Met deze methode kan directe vergelijking of, indien nodig, de gemiddelde of aftrekking van profielen van verschillende ROI's worden vergeleken. Het protocol maakt het ook mogelijk om de integrale pixelintensiteitsprofielen van elk object voor achtergrondgeluid te corrigeren door een eenvoudige aftrekking van de gemiddelde intensiteit van de pixels buiten het object te plaatsen. Hoewel het alleen in biologische monsters is getest, biedt ons protocol een waardevolle aanvulling op andere bestaande beeldanalyse-instrumenten die worden toegepast in studies van beelden van fysieke of chemische processen die rondom een punt van herkomst worden geregeld (zoals diffusie van stoffen uit een puntbron ) 1 .
De belangrijkste beperking van de oorspronkelijke beeldanalysemethode was echter dat het protocol was gewijdUitgebracht als Visual Basic 6 (VB6) (code en daarom was het platformafhankelijk en moeilijk te distribueren (VB6 vereist). Om dit probleem aan te pakken en om aan te sluiten bij soortgelijke recente inspanningen van andere onderzoekers 2 , hebben we de VB6 Clock Scan omgezet Programmacode in twee op Java gebaseerde plugins, compatibel met de NIH-gesponsorde en vrij toegankelijke open-source en platform onafhankelijke beeldanalyseprogramma's, ImageJ 3 en Fiji ImageJ 4. Bovendien hebben deze plugins nu verschillende nieuwe functies die de mogelijkheden uitbreiden Van het oorspronkelijke protocol om meerdere ROI's en beeldstapels te verwerken. Veel beeldanalyseprogramma's zijn niet gebruiksvriendelijk, wat betreft het uitvoeren van statistische analyse van meerdere objecten, en dus worden vaak alleen representatieve gegevens weergegeven. Met de multi Clock Scan ImageJ-plugin, Het is mogelijk om tegelijkertijd de analyse van meerdere objecten te vergemakkelijken. Een robuuste statistische evaluatie van microscopiedata,Met betrekking tot de signaalintensiteit verdeling in enkele cellen / objecten, is nu mogelijk met deze plugin extensie. Hier beschrijven we de Clock Scan plugins en tonen voorbeelden van hun applicaties in beeldanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Software installatie
- Installeer de nieuwste versies van gebundelde Java en ImageJ of Fiji ImageJ zoals aanbevolen op de betreffende websites (zie materiaaltabel voor links naar de betreffende websites). In de onderstaande tekst worden beide programma's aangeduid als "ImageJ".
- Kopieer "Clock_Scan-1.0.1. Jar" en "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" pluginbestanden met behulp van de link die in de materialetabel is geplaatst en plak ze in de ImageJ-plugin directory. Als alternatief gebruik je de optie 'Plugins | Installeer plugin' om deze bestanden te installeren nadat ze op de harde schijf van de computer zijn opgeslagen.
2. Clock Scan analyse
- Standaard klok scan plugin ( afbeelding 1 ):
- Gebruik de menuoptie ImageJ "File | Open" om een interessant beeld te openen.
- Klik op het 'polygoon' gereedschap, of 'gesegmenteerde lijn selectie'Tool, en trek vervolgens de afbeelding aan om de gehele ROI of een segment van deze regio te schetsen. Zie figuur 1 A voor een voorbeeld van veelhoekselectie (binnenste streeplijn).
OPMERKING: Andere selectiegereedschappen, die beschikbaar zijn in de software (rechthoekige, ovale en vrije handlijn selectie), kunnen ook worden gebruikt. - Selecteer "Plugins | Clock Scan" in het menu om het standaard pop-up-venster voor het openen van de klok te openen. Merk op dat dit commando ook het ROI Manager-venster zal openen met de omtrek die er automatisch bij wordt toegevoegd.
- Gebruik het invoegtoepassingsvenster om het volgende te doen.
- Controleer en verander de X- en Y-coördinaten van het ROI-centrum (automatisch berekend als coördinaten van het fysieke massacenter) door middel van scrollbalkjes of de waarden in de bijbehorende invoerdozen te wijzigen. Zie figuur 1 B.
- Afhankelijk van hoeveel van de achtergrond regio buiten het object shoAls u wilt scannen, moet u de scanlimieten aanpassen door gebruik te maken van de scrollbar. Zie figuur 1 A.
OPMERKING: Scanlimiet is het fractionele getal dat aangeeft hoe ver de scan in een bepaalde richting verder gaat dan de rand van de objecten; De standaardwaarde is 1,20, wat aangeeft dat de scanlengte 20% langer zal zijn dan de objectradius in de richting van de scan; Zie figuur 1 A , buitenste streeplijn). - Wijzig de uitvoer van de plugin met behulp van "echte straal", "aftrek achtergrond", "polaire transformatie" en / of de "plot met standaard afwijking" checkboxen.
- Klik op "OK" om de plugin uit te voeren. Zie figuur 1 C-H .
OPMERKING: Voorbeelden van de uitvoer van het protocol met "plot met standaardafwijking" en "polaire transformatie" of "echte straal" en "polaire transfectOrm "-opties worden weergegeven in respectievelijk Figuur 1 C en 1D en Figuur 1 E en 1F . Merk op dat de berekende standaardafwijkingen (SD) -waarden de variatie tussen afzonderlijke radiale pixelintensiteitscanningen van het object vertegenwoordigen. Let ook op de" ROI-selectie Lengte "in het invoegvenster, waarin de informatie wordt weergegeven op de lengte van de ROI-omtrek, gemeten in pixels.
- Gebruik in het gegenereerde "Platenprofiel Plot" de opdracht "Lijst" om waarden te plotten die worden weergegeven in twee, X- en Y-kolommen van gegevens voor grijsschaalafbeeldingen en in X- en vier Y-kolommen gegevens voor RGB-afbeeldingen, waarvan Y0, Y1, Y2 en Y3 kolommen worden gevuld met integrale en individuele (rode, groene en blauwe) kleurkanaal pixel intensiteit waarden.
- Meerdere ROI Clock Scan plugin - werken met meerdere ROI ( Afbeelding 2 ):
- Open een afbeelding met meerdere ROI.
- Open de ROI Manager door op 'Analyseer | Tools | ROI Manager' te klikken.
- Sequentially overzicht (zie stap 2.1.2) en voeg elke ROI toe aan de ROI Manager door op "Add" in het ROI Manager venster te klikken; Doe dit voor alle ROI's binnen de afbeelding. Gebruik de opdracht 'Analyse | Maatregel' als ROI-statistieken van belang zijn.
- Zie Figuur 2 A voor een voorbeeld van meerdere segmentenlijn selecties en Figuur 2 E voor een voorbeeld van meerdere polygoon selecties.
- Selecteer "Multi Clock Scan" in het menu "Plugins" om het pop-upvenster voor protocolopties te openen.
- Gebruik het protocolvenster om het volgende te doen.
- Herstel indien nodig de scanlimiet zoals in stap 2.1.4.2; Standaardwaarde is 1,20.
- Selecteer indien nodig de optIon om het gemiddelde klokscanprofiel met SD-balkjes te plotten door het vak "Plot with standard deviation" te openen. Zie figuur 2 C en D.
OPMERKING: De berekende SD-waarden vertegenwoordigen variatie tussen integrale klokscanprofielen van verschillende objecten. Let ook op de regel in het pluginvenster met informatie over het aantal geselecteerde ROI's. - Klik op "OK" om het protocol uit te voeren.
- Gebruik in het gegenereerde "Plotprofiel van de klok" de opdracht "Lijst" om de waarden te plotten die in het venster "Plotwaarden" worden weergegeven. Zie de "Multi Clock Scan Profile Plot" -vensterlegenda voor kolomaanwijzing per kleurkanaal.
- Merk op dat de ROI's genummerd zijn en hun klokscanprofielen voor een bepaald kleurkanaal worden getekend in dezelfde volgorde waarin de ROI's zijn geschetst en toegevoegd aan de "ROI Manager".
- MulTiple ROI Clock Scan plugin - werken met een beeldstapel ( afbeelding 3 ):
- Open een beeldstapel van interesse.
- Open de ROI Manager door op 'Analyseer | Tools | ROI Manager' te klikken.
- Schets de ROI van de afbeeldingen binnen de stapel en voeg deze toe aan ROI manager zoals beschreven in stappen 2.1.2 en 2.2.3. Gebruik de opdracht 'Analyse | Maatregel' als de ROI-statistieken van belang zijn.
- Selecteer "Multi Clock Scan" in het menu "Plugins" om het pop-upvenster voor protocolopties te openen.
- Gebruik het protocolvenster om het volgende te doen.
- Reset de scanlimiet zoals beschreven in stap 2.1.4.2; Standaardwaarde is 1,20.
- Selecteer de optie om het gemiddelde klokscanprofiel met SD-balkjes te plotten door het vak 'Plot with standard deviation' te selecteren.
OPMERKING: De berekende SD-waarden vertegenwoordigen variatie tussen verschillende voorbeelden van het object dat is geselecteerd in de afbeelding stack. Let ook op de regel in het invoegvenster dat informatie toont over het aantal beelden in de stapel. - Klik op "OK" om het protocol uit te voeren.
- Klik in het venster 'Clock Scan Profile Plot' op 'List' om de waarden te plotten die in het venster 'Plot Values' worden weergegeven, waar het Y-kolomnummer de beeldpositie in de stapel vertegenwoordigt - 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De afbeeldingen die hier gebruikt worden voor illustratieve doeleinden, worden genomen uit databases die zijn gecreëerd tijdens onze vorige cel- en weefselbiologische studies 5 , 6 , 7 en van de Allen Mouse Brain Atlas 8 . Beide plugins werden succesvol getest met behulp van ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 en Fiji ImageJ 2.0.0-rc54...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Clock Scan Protocol: Het Clock Scan Protocol is een snel en simpel tool voor beeldanalyse. De voordelen van dit protocol, in vergelijking met bestaande gemeenschappelijke benaderingen van beeldanalyse (zoals lineaire pixelintensiteitscanningen of berekening van gemiddelde pixelintensiteit van de ROI) zijn beschreven in de voorgaande publicaties 1 , 9 . Kortom, dit protocol maakt het mogelijk om integrale radiale pixelintensiteitsprofielen te gen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Wij bedanken dr. Tanja Maritzen en dr. Fabian Feutlinske (Leibniz Instituut voor Moleculaire Farmacologie, Berlijn, Duitsland) voor het delen met ons van hun versie van de Fuji ImageJ Clock Scan plugin en inspireren ons om deze versie van het programma te ontwikkelen. Wij zijn ook dankbaar voor Dr. Fritz Melchers (afdeling Lymfocytontwikkeling, Max Planck Instituut voor Infectiebiologie) voor zijn vriendelijke toestemming om de beelden uit de database van zijn afdeling te gebruiken om de plugin te testen en te verbeteren. Ondersteuning: Centrum voor Translationele Neurowetenschappen; NIH-subsidie: P30-GM110702-03.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Computer | Elk | compatibel met software vermeld hieronder | |
| ImageJ of Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ of https://fiji.sc/ | gebundeld met Java 1.8 of hoger |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar en Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, VS | Dit programma werd gebruikt om enkele grafieken van de originele Clock Scan-gegevens te genereren. Elke andere grafische software kan worden gebruikt om deze functie uit te voeren |
Referenties
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
