Methodenartikel

Het bepalen van de optimale frequentie voor remmende kankercellen gebruiken Tumor Behandeling Fields (TTFields)

DOI:

10.3791/55820

⸱

4 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Preclinical Research Department, Novocure Ltd., Haifa, Israel, 2Novocure Ltd., Haifa, Israel, 3Novocure GmbH, Lucerne, Switzerland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumorbehandelingsvelden (TTFields) zijn een effectieve anti-tumorbehandelingsmodaliteit die wordt geleverd via de continue, niet-invasieve toepassing van lage intensiteit, intermediaire frequentie, afwisselende elektrische velden. TTFields applicatie op cellijnen door gebruik te maken van een TTFields in vitro applicatiesysteem maakt het mogelijk de optimale frequentie te bepalen die leidt tot de hoogste reductie in celtellingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumor Treating Fields (TTFields) zijn een effectieve behandelingsmodaliteit die wordt geleverd via de continue, niet-invasieve toepassing van lage intensiteit (1-3 V / cm), alternerende elektrische velden in het frequentiebereik van enkele honderden kHz. De studie van TTFields in weefselkweek wordt uitgevoerd met behulp van het in vitro applicatiesysteem TTFields, waarmee de toepassing van elektrische velden van verschillende frequenties en intensiteiten wordt toegepast op keramische Petri-schotels met een hoge diëlektrische constante (Ɛ> 5000). Kankerachtige cellijnen die op de dekglazen op de bodem van de keramische Petri-schotels zijn geplateerd, worden onderworpen aan TTFields die in twee orthogonale richtingen worden afgeleverd bij verschillende frequenties om de uitkomsttesten van de behandeling te vergemakkelijken, zoals celtellingen en clonogene analyses. De resultaten die in dit rapport worden gepresenteerd, tonen aan dat de optimale frequentie van de TTFields met betrekking tot zowel celtellingen als clonogene tests 200 kHz is voor zowel eierstokken als gliomacellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumor Behandeling Fields (TTFields) zijn anti-mitotische modaliteit voor de behandeling van glioblastoma multiforme en mogelijk andere kankersoorten. De velden worden geleverd via de voortdurende toepassing van lage intensiteit (1-3 V / cm), middenfrequent (100-500 kHz), wisselende elektrische velden om het gedeelte van de tumor 1, 2. TTFields toepassing in vitro en in vivo werd aangetoond dat zowel de kankerachtige groei van verschillende cellijnen en de progressie van de tumoren in verschillende dierlijke tumormodellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 remmen. Pilot klinische proeven en grotere gerandomiseerde studies bij patiënten met solide tumoren, met inbegrip van glioblastoma en niet-kleincellige longkanker, hebben demonstbeoordeelden de veiligheid en werkzaamheid van continue TTFields aanvraag 8, 9, 10. De werkzaamheid van de TTFields bleek te zijn: (1) frequentieafhankelijke, specifieke optimale frequenties die tot de grootste vermindering van de celtellingen van cellijnen van verschillende oorsprong 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrische veldsterkte-afhankelijk, met een minimale drempel voor activiteit bij ongeveer 1 V / cm en krachtiger hogere intensiteiten 1, 2, 7, 11; (3) versterkt wanneer de behandelingsduur langer was 5; en (4) hoger wanneer 2 richtbare TTFields zijn loodrecht aangebracht op elke other, in vergelijking met elektrische velden aangebracht vanuit een enkele richting 1. Op basis van bovenstaande bevindingen kan TTFields worden toegepast bij patiënten voor langere duur gebruik van 2 sets van omzettergroeperingen gelokaliseerd op de huid van de patiënt op de elektrische veldsterkte in de tumor bed 12, 13 te maximaliseren.

Het bestuderen van de effecten van TTFields voor kankercellen in vitro verschaft momenteel de enige manier om de optimale frequentie voor een specifiek tumortype vast. Testen op de optimale frequentie is een apparaat dat voorziet in de toepassing van verschillende frequenties in het bereik van 100-500 kHz en intensiteit tot 3 V / cm kwadratisch gemiddelde (RMS) aan de celkweek. Zoals TTFields applicatiewarmtewisselaar produceert het toepassingssysteem vereist het vermogen om overmatige warmte af te voeren terwijl strikte beheersing van de temperatuur.

Verschillende apparaten werE ontwikkeld door de jaren om TTFields aan te geven op celculturen 1 , 2 , 5 , 14 , 15 , 16 . In al deze inrichtingen werden de gebruikte elektroden geïsoleerd om de caveats die betrokken zijn bij het gebruik van geleidende elektroden, zoals elektronenuitwisseling bij het elektrodeoppervlak en de afgifte van giftige metaalionen in het medium 1 te vermijden. Het belangrijkste verschil tussen de verschillende geteste TTFields applicatiesystemen is het type elektrode-isolatie dat wordt gebruikt, met ofwel elektroden gemaakt van metalen draden die zijn geïsoleerde met een dunne film van isolator 2 , 14 , 15 , 16 of met een hoog diëlektrische constante materiaal ( bijv. Lood magnesium niobaat-lood titanaate (PMN-PT)) 6. Terwijl de geïsoleerde draadelektroden bieden een relatief eenvoudige en rendabele oplossing voor TTFields toepassing worden vaak beperkt door de hoge spanning hiervoor noodzakelijke effectieve elektrische veldsterkten boven 1 V / cm drempel en door de voor cellen platerenoppervlakte, wanneer de afstand tussen de elektroden is relatief klein. Op basis van elektroden geïsoleerd met een hoge diëlektrische constante materiaal vereisen speciale ontwerp en fabricage vermogens, maar ze vereisen geen hoge spanning en kan een groter gebied voor celgroei tussen de elektroden bieden.

De TTFields in vitro toepassingssysteem gebruikt in dit werk behoort tot deze klasse van systemen, waarbij de kerneenheid als een petrischaal (TTFields schotel, zie figuur 1) samengesteld uit hoge diëlektrische constante keramiek (bijv PMN-PT). Twee paren elektroden loodrecht gedrukt op de buitenste walLs van een TTFields schotel om de toepassing van elektrische velden vanaf 2 richtingen mogelijk te maken. De elektroden zijn verbonden met een sinusvormige golfvormgenerator en een versterker, die de toepassing van TTFields in het frequentiebereik van 50-500 kHz mogelijk maakt. Om de overmatige warmte te ontlopen, worden de TTFields-schotels in een gekoelde incubator gehouden, waarbij de gemiddelde temperatuurregeling wordt uitgevoerd met behulp van constante bewaking van de schoteltemperatuur en aanpassingen aan de door het systeem toegepaste spanning. In de praktijk zou de incubator naar een lagere temperatuur leiden tot hogere elektrische veldintensiteiten, aangezien het systeem de spanning verhoogt tot de doeltemperatuur binnen de schotel is bereikt. Het verschil tussen de temperatuur binnen de schotel en de incubatortemperatuur kan leiden tot enige verdamping, afhankelijk van de temperatuurgradiënten; Daarom moet het kweekmedium elke 24 uur vervangen worden om voldoende groeivoorwaarden te handhaven.

Het onderstaande protocolbeschrijft de experimentele procedure voor de toepassing van TTFields frequenties kankercellen te optimaliseren, zodat een maximale vermindering celtelling en een vermindering van het vermogen van de overlevende cellen onder vorming van kolonies worden bereikt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. TTFields In Vitro Application System - Base Plate en Dish Maintenance

  1. Spoel gerechten en schotel covers onder stromend water. Dan afspoelen met gedemineraliseerd water en lucht-droog gezicht naar beneden.
  2. Wanneer een chemotherapeutisch middel / geneesmiddel gerechten toegevoegd in een voorafgaande proef, vul elke schaal met een 5% lichte detergensoplossing en een nacht laten staan.
    1. Spoel de vaat grondig onder stromend water om eventuele resten van afwasmiddel in de schaal te voorkomen. Spoel de gerechten en schaal bedekt met gedeïoniseerd water en luchtdroog naar beneden.
  3. Steek de schone en droge gerechten met hun covers in sterilisatie zakken. Seal en plaats de zakken in een autoclaaf, met de gerechten naar beneden. Autoclaaf gedurende 30 minuten bij niet hoger dan 121 ° C.
  4. Stel de autoclaaf op een droogprogramma, gedeeltelijk opent autoclaafdeur en droog de schalen 30 min.
  5. Veeg de basisplaat met een doek die licht bevochtigd met 70% ethanol.

    6. 2. Experiment Setup

    OPMERKING: Alle apparatuur en materialen die in dit protocol worden gebruikt worden beschreven in de Materials List. Alle stappen hieronder moeten uitgevoerd worden in een laminaire vloerkast terwijl steriele omstandigheden worden gehandhaafd.

    1. Maak schoon en steriele TTFields schotels en deksels zoals beschreven in sectie 1. Veeg de basisplaat met een doek die licht bevochtigd is met 70% ethanol.
    2. Installeer de TTFields-schotels met de deksels op de basisplaat door voorzichtig op de schotel te drukken en ongeveer 5 mm met de klok in te draaien totdat de rand van de schotel op de drie pennen op de basisplaat staat. Plaats een steriele 22 mm deklaag (behandeld plastic of glas) op de bodem van elke schotel.
    3. Bereid de cel suspensie in volledig groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium voor U-87 MG en F98; RPMI voor A2780 en OVCAR-3; aangevuld zoals beschreven in Materialenlijst).
      OPMERKING: de ceII concentraties zijn afhankelijk van de cel typen en de duur van het experiment, 80% -90% confluente celgroei mag niet overschreden worden tegen het einde van het experiment.
      VOORZICHTIG: Menselijke cellijnen kunnen een biologisch gevaar vertegenwoordigen en moeten met de juiste veiligheidsmaatregelen worden behandeld.
    4. Plaats 200 μL cel suspensie (meestal 5.000-20.000 cellen in 200 μL voor een 72-uurs experiment, afhankelijk van de verdubbelingstijd) als een druppel in het midden van elke deklaag en bedek met de afscheidingsdeksels.
    5. Incubeer bij 37 ° C in een CO 2 incubator totdat de cellen hechten In dit stadium is een incubatie in de nacht mogelijk.
    6. Aspirateer de vloeistoffen uit de druppel met behulp van een 200- of 1000-μL pipet.
    7. Pepet 2 ml volledig groeimedium voor elke vulling. Gebruik een steriele punt om te pipetten en druk zachtjes op de dekglijbanen om de luchtbellen af ​​en toe te laten vallen onder de glijbaan.
    8. Bedek de afwas met hun deksels en plaats ze opide een CO2 incubator bij 37 ° C tot de start van de behandeling TTFields.

    3. Toepassing TTFields

    1. Breng de basisplaten met de bijgevoegde TTFields gerechten een gekoelde CO2 incubator.
      LET OP: In vitro TTFields toepassing zal warmte genereren; daarom wordt een gekoelde incubator vereist ter compensatie van de opwarming van de gerechten. TTFields hogere intensiteiten zullen warmte en lager incubator omgevingstemperatuur (zie tabel 1) nodig. Klinisch relevante TTFields intensiteiten worden verkregen wanneer de incubator gedurende TTFields toepassing in het gebied van 18-30 ° C.
    2. De platte kabel connector naar de basisplaat. Schakel de TTFields generator op.
    3. Start de TTFields in vitro toepassing systeemsoftware en selecteer het experiment instellingen.
      1. Definieer een nieuw experiment. Typ de naam van de experiment en het experiment eigenaar in de software gebruikersinterface op het computerscherm. Pas de frequentie en de doeltemperatuur voor elke schaal of basisplaat.
    4. Start de TTFields applicatie met behulp van de software.
    5. Controleer of alle gerechten goed zijn aangesloten en lijken lichtblauw op de monitor. Wanneer een schotel is omcirkeld met een rood frame (wat betekent dat het niet juist is aangesloten), druk deze zacht en draai langzaam heen en weer tot de contacten worden hersteld en de schaal wordt lichtblauw.
    6. Laat de TTFields in vitro aanvraagsysteem loopt tot 24 uur.
    7. Als het experiment zijn eindpunt bereikt, stoppen met het experiment door te klikken op de END EXPERIMENT knop in de software en ga verder met stap 5. Zo niet, klik dan op PAUZE experiment.
    8. Koppel de platte kabel los van de bodemplaat. Verwijder de basisplaat met de gerechten uit de incubator in een laminaire flowkast.
    9. Vervang het medium in alle schoteles elke 24 uur en terugkeer van de basisplaat aan de gekoelde incubator. Sluit de basisplaat met de generator via de platte kabel. Ga verder het experiment door te klikken op de knop Doorgaan.

    4. controlemonsters

    Opmerking: Groei controle cellen in dezelfde omstandigheden TTFields-behandelde cellen, met uitzondering van TTFields applicatie.

    1. Plaat controlemonsters met dezelfde vering en een soortgelijk oppervlak voor plateren TTFields-behandelde monsters.
    2. Plaats control schotels in een CO2 incubator bij 37 ° C.
    3. Vervang het medium in de gerechten elke 24 uur aan de TTFields behandelde schotel medium omstandigheden.

    5. Experiment End

    1. Na het klikken op END EXPERIMENT, wacht op de software om alle records uit het systeem te halen en om de records op de computer op te slaan.
    2. Gebruik de knop REPORTS om de temperatuur, stroom en weerstand log f beoordelenIles van elke basisplaat om te verifiëren dat alle gerechten werden behandeld volgens het experimentele plan.
      OPMERKING : Alle rapporten en logboeken worden na het einde van het experiment op de computer opgeslagen en kunnen te allen tijde worden herzien.
    3. Schakel de TTFields generator uit.
    4. Koppel de platte kabel los van de basisplaat en verwijder deze uit de incubator.
    5. Om een ​​keramische schotel te verwijderen, drukt u naar beneden en draait u de schijf tegen de klok in om het van de basisplaat te ontgrendelen.
    6. Breng de afwas in een laminaatvloeistofkast en verwijder de deklagen alseptisch. Breng ze over naar steriele Petri-schalen die vers medium of fosfaat-gebufferde zoutoplossing bevatten (PBS) voor verdere inspectie en evaluatie.

    6. Evaluatie van het effect van TTFields

    OPMERKING: De effecten van TTFields kunnen op verschillende manieren worden bepaald. Gebruik een of meer van de volgende methoden om behandelde cellen te vergelijken met onbehandelde controlecellen:

    1. Celtelling
      1. Verwijder het medium / PBS uit elke deklaag.
      2. Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine / EDTA aan elk gerecht toe en incubeer gedurende 10 minuten ( bijv. Tot de cellen losmaken van de deklaag) bij 37 ° C in een CO2-incubator.
      3. Voeg 0,5 ml van het volledige groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren en de cellen opnieuw op te schorten door zachtjes pipetteren omhoog en omlaag.
      4. Tel de cellen met behulp van een standaard celtellingtechniek die compatibel is met het berekenen van lage celconcentraties ( dwz ongeveer 20.000 cellen / ml).
    2. Clonogene test
      1. Platte een gelijk aantal cellen (100-500 cellen per schotel) van elke schotel op nieuwe, steriele Petri-schotels of 6-putjes platen met 2 ml fris compleet groeimedium.
      2. Incubeer gedurende 1 tot 3 weken in een CO 2 incubator bij 37 ° C (afhankelijk van de eigenschappen van elke cellijn) totdat colonies bestaan ​​uit ~ 50 cellen. Evalueer de celAantal per kolonie door lichtmicroscopie.
      3. Verwijder het medium en spoel met PBS.
      4. Verwijder de PBS en voeg ijskoude methanol (1 ml) toe. Incubeer bij -20 ° C gedurende 10 minuten of langer.
      5. Verwijder de methanol.
      6. Voeg kristal violet oplossing (0,1% w / v in 25% v / v methanol in water) en incubeer gedurende 20 min.
        VOORZICHTIG: Kristalviolet is een potentieel kankerverwekkend middel; Gebruik handschoenen tijdens het werken met kristalviolet.
      7. Verwijder het kristalviolet, was 3 keer met gedeïoniseerd water en luchtdroog.
      8. Tel de kolonies die in elke schotel zijn gevormd.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultaten na TTFields toepassing bij het aftasten van verschillende frequenties kan worden gekwantificeerd op basis van verschillende assays, zoals celtellingen, colorimetrische assays, klonogene assays en onderzoeken van de veranderingen in het aantal binnendringende cellen onder toepassing van een Boyden-kamer geplaatst in een speciale high-wall TTFields celkweek schotel. Zorgvuldige experimentele planning op basis van vooraf bepaalde cel verdubbelingstijden kan de cellen om het maximale aantal mitotische gebeurtenissen bereikt tijdens de behandelingsduur, waardoor het maximaliseren behandelingsresultaten.

Figuur 2 illustreert een typische frequentiescan resultaat een aantal gemiddelde celgrootte (dwz aantal cellen) en klonogene bepaling van A2780 (dwz humaan ovarium kankercellen Figuur 2A) 7 en F-98 (dat wil zeggen, rat glioma cellen;"> Figuur 2B) 1 behandeld met twee richting TTFields (frequentiebereik: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm en incubatortemperatuur: 18 ° C). De resultaten tonen een significante vermindering van de celtellingen bij alle toegepaste frequenties , Met de maximale reductie bij 200 kHz voor alle geteste cellijnen (one-way ANOVA met meerdere vergelijking). De optimale frequentie die leidde tot de hoogste reductie in het clonogene potentieel was hetzelfde voor zowel A2780 als F98 cellen ( Figuren 2B en C ) De Pearson correlatiecoëfficiënt tussen het celnummer en het clonogene effect bij elke frequentie was 0,967 (p = 0,002) en 0,755 (p = 0,083) voor respectievelijk A2780 en F98.

Figuur 3 toont een frequentie scan resultaat voor de gemiddelde celtelling voor OVCAR-3 ( dwz menselijke eierstokkankercellen, Figuur 3A ) en U-87 MG ( dat wil zeggen menselijke gliomacellen; Figuur 3B ) cellen behandeld met twee richtingen van TTFields bij verschillende intensiteiten (respectievelijk RMS: 1,7, 1,3 en 1,0 V / cm en incubatortemperatuur: 18 ° C, 24 ° C en 28 ° C respectievelijk). De resultaten tonen aan dat, hoewel er nog steeds een significante vermindering van de OVCAR-3 celtelling is na behandeling met 1,3-V / cm TTFields (incubatortemperatuur: 24 ° C), het effect relatief klein is in vergelijking met de resultaten die werden verkregen bij de behandeling van de cellen Met 1,7 V / cm (incubatortemperatuur: 18 ° C). U-87 MG cellen behandeld met 1,0-V / cm TTFields (incubatortemperatuur: 28 ° C) tonen ook een vergelijkbare trend in de vermindering van het cijfernummer als bij behandeling met 1,7 V / cm, maar het effect was niet significant bij lagere intensiteiten .

figure-results-1
FigurE 1 . TTFields schotels werden op een basisplaat eenheid geïnstalleerd en aangesloten op de platte TTFields besturingskabel. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2 . Frequentie scans voor de bepaling van de optimale TTFields remmende frequentie voor (A) A2780 en (B) F98 cellen. Cellen werden 72 uur behandeld met TTFields met verschillende frequenties (1,7 V / cm en 100-500 kHz). Het effect van TTFields behandeling werd geschat met behulp van celtelling en clonogene analyses. De pijl geeft de optimale frequentie aan. De resultaten vertegenwoordigen gemiddelden ± SD gebaseerd op ten minste 6 replicaten voor elke geteste frequentie. ( C ) Representatieve beelden van de clonogene s Urvival van A2780 cellen na TTFields behandeling bij verschillende frequenties. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3 . Frequentie scans voor de bepaling van de optimale TTFields remmende frequentie voor (A) OVCAR-3 en (B) U-87 MG cellen. Cellen werden 72 uur behandeld met TTFields met verschillende frequenties (100-500 kHz) en intensiteiten (OVCAR-3: 1,3 en 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 en 1,7 V / cm). Het effect van TTFields behandeling werd geschat met behulp van celtellingen. De pijl geeft de optimale frequentie aan. De resultaten vertegenwoordigen gemiddelden ± SD gebaseerd op ten minste 6 replicaten in elke geteste frequentie.Pg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Omgevingstemperatuur van de incubator Verwachte TTFields intensiteiten
(° C) (V / cm RMS)
18 1.62
19 1.55
20 1.48
21 1.41
22 1.33
23 1.26
24 1.19
25 1.12
26 1.04
27 0,97
28 0.9
29 0,83
30 0.76

Tabel 1. Omgevingstemperatuur van de incubator en de verwachte TTFields intensiteiten in de TTFields schotel.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TTFields zijn een opkomende anti-tumor modaliteit gebaseerd op de continue toepassing van goed afgestemde alternerende elektrische velden 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 . Het maximaliseren van anti-tumor werkzaamheid is een wenselijk resultaat voor alle behandelingsmodaliteiten. Zo kan "vechten" voor elk extra percentage van de remming van kankercelgroei een significant effect hebben op het langdurige klinische resultaat voor patiënten. Dit komt door de vereiste continue aard van TTFields applicatie en het daaruit voortvloeiende cumulatieve effect. Maximale TTFields applicatie kan op verschillende manieren worden bereikt: (1) het verhogen van de elektrische veldintensiteit 1 , 7 , (2) verlenging van de behandelingsduur 5 , (3) het vinden van de meest effectieve combinatiAan met andere behandelingsmodaliteiten 18 , 19 en (4) die de optimale frequentie 1 , 2 , 4 , 6 , 7 definiëren. Het maximaliseren van de elektrische veldintensiteit op de plaats van de tumor wordt bereikt door de locatie van de arrays op de patiënthuid te optimaliseren; Dit zorgt voor de levering van de maximale veldintensiteit aan de tumor op basis van de individuele anatomie van de patiënt 20 . Verlenging van de behandelingsduur hangt voornamelijk af van de naleving van de patiënt bij de behandeling (voor minstens 18 uur per dag) 17 . Het vinden van de juiste combinatie met andere therapieën en het bepalen van de optimale frequentie hangt sterk af van in vitro resultaten, aangezien er geen gevalideerde markers voor TTFields behandelingsresultaten momenteel beschikbaar zijn. In dit werk hebben we de experimentele pRocedures nodig om de optimale TTFields frequentie voor kankercellijnen te bepalen met behulp van het TTFields in vitro applicatiesysteem. De hier beschreven methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de combinatie van andere kankerbehandelingsmodaliteiten (bijvoorbeeld chemotherapiemiddelen of bestraling) met TTFields te screenen en om de optimale frequentie voor TTFields toediening voor elke specifieke gecombineerde behandeling te bepalen.

In overeenstemming met eerdere publicaties blijkt dat de resultaten die hier worden getoond, aantonen dat de optimale frequentie voor de behandeling van zowel gliomacellen als eierstokkankercellen 200 kHz 1 , 7 is . In dit werk hebben we voor het eerst aangetoond dat de optimale TTFields frequentie om het clonogene potentieel te verminderen in verband staat met de frequentie die leidt tot het maximale cytotoxische effect. De methoden die in dit werk worden gebruikt om de effecten van TTFields ( dwz cytotoxische en clonogene) te kwantificeren aRe slechts twee van de vele mogelijke standaard endpoint assays om de behandelingsresultaten te evalueren. Aanvullende behandelingen uitkomst tests omvatten: (1) vaststelling, kleuring en montage van de dekglazen waarop de cellen zijn geplateerd over een microscoop voor het visualiseren van intracellulaire structuren; (2) het uitvoeren van assays van eiwit- en RNA-extracten, van de TTFields zelf, of na het overbrengen van de deklaag naar een nieuwe wegwerpschotel; En (3) trypsiniserende cellen gekleurd voor flowcytometrie analyse.

Een zorgvuldige experimentele planning zal de behandelingsresultaten beïnvloeden na de levering van TTFields. De belangrijkste stappen zijn erop toe te zien dat de cel proliferatie door het experiment niet tot overgroei leidt en de juiste elektrische veldintensiteit gebruikt, aangezien intensiteiten die te hoog zijn wanneer ze op gevoelige cellijnen worden toegepast, resulteren in te weinig cellen voor de vereiste analyses om te bepalen De optimale frequentie. Omgekeerd werden TTFields toegepast bij zeer lage intensiteitenOp minder gevoelige cellijnen zal resulteren in kleine effecten die kunnen worden gemaskerd door inherente variatie. De behandelingslogboeken moeten worden onderzocht voor waardevolle informatie over temperatuurstabiliteit, elektrische stromingen en weerstand voor elk gerecht gedurende het experiment. Vervanging van defecte gerechten bij het starten van de behandeling en het uitsluiten van gegevens uit een schotel dat niet aan de gewenste behandelingsparameters voldoet, vermindert de variabiliteit tussen replicaten.

Samenvattend zijn TTFields een opkomende behandeling tegen kankerbehandeling die reeds werkzaamheid en veiligheid heeft getoond in klinische instellingen 8 , 9 , 10 . Het testen van TTFields in een in vitro- omgeving met behulp van de hier beschreven protocollen kan de optimalisatie van TTFields-behandelingsparameters in de klinische omgeving mogelijk maken en ons begrip van het onderliggende werkingsmechanisme kunnen verbreden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna en Kirson D. Eilon D worden betaald aan Novocure Ltd, Israël. Weinberg Uri is een betaalde werknemer van Novocure GmbH, Luzern. Yoram Palti is een aandeelhouder bij Novocure Ltd, NY.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen bevestigingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
inovitro system and softwareNovocureITG1000 and IBP1000Elke unit bevat 1 TTFields generator, 1 basisplaat, 8 TTFields schotels met deksels en 1 vlak kabel. 
Sterilization bagsWestfield medical24882
Plastic cover slidesThermo Scientific (NUNC)174977Voorbereid en gesteriliseerd
Glass cover slidesThermo Scientific (Menzel-Glä;ser)CB00220RA1Steriliseren indien nodig
Dulbecco’s modified Eagle’s mediumBiological Industries (Israel)01-055-1AOpwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
RPMI 1640Gibco21875-034Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries (Israel)04-007-1AOpwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-029
Pen/Strep (10.000 U/mL Penicilline, 10.000 µg/mL Streptomycine)Gibco15140-122
Sodium Pyruvate solution 100 mM Biological Industries (Israel)03-042-1B
Hepes buffer 1 MBiological Industries (Israel)03-025-1B
Insuline solution from bovine pancreasSigma-Aldrich10516-5ML
0.25% Trypsin/EDTABiological Industries (Israel)03-050-1BOpwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
MethanolMerck1.06009.2511Afkoelen tot -20 °C in de vriezer voor gebruik
Crystal violetSigma-Aldrich120M1445Schadelijk. Bereid 0,1% w/v crystal violet oplossing in 25% Methanol 75% water.
Light detergentAlcononx242985Bereid 5% oplossing in water, of volgens de instructies van de fabrikant.
PBSBiological Industries (Israel)02-023-1AZonder calcium en magnesium
A2780ECACC93112519Kweek in RPMI 1640 aangevuld met FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), natriumpyruvaat (1 mM) en Hepes buffer (12 mM).
F98ATCCCRL-2397Kweek in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium aangevuld met FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), natriumpyruvaat (1 mM) en glutamine (2 mM).
Ovcar-3ATCCHTB-161Kweek in RPMI 1640 aangevuld met FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), natriumpyruvaat (1 mM), Hepes buffer (12 mM) en insuline (10 µg/mL).
U-87 MGATCCHTB-14Kweek in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium aangevuld met FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), natriumpyruvaat (1 mM) en glutamine (2 mM).
refrigirated CO2 incubatorCARON7404-10-3
Laminar flow cabinetADS LaminairBio12 en VSM12

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
  2. Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
  3. Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
  4. Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
  5. Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046(2015).
  6. Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
  7. Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
  8. Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
  9. Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
  10. Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
  11. Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
  12. Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
  13. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
  14. Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
  15. Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
  16. Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584(2016).
  17. Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
  18. Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
  19. Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229(2010).
  20. Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TTFields in vitrooptimale frequentiekankercellijnentoepassing van elektrische veldenflowcytometrieclonogene assayskeramische petrischalenfrequentiescanbehandelingsresultaat

Gerelateerde artikelen