Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Summary

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Abstract

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is gekoppeld aan beide materialen op waterbasis en door voedsel overgedragen ziekten, en blijft een bedreiging ondanks de voedsel - en water-screeningmethoden die momenteel gebruikt. Terwijl conventionele bacteriële detectiemethoden, zoals polymerase-kettingreactie (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) specifiek pathogene contaminanten, kunnen detecteren vereisen ze uitgebreide monstervoorbereiding en lange wachttijden. Bovendien, deze praktijken eisen van geavanceerde laboratoriuminstrumenten en instellingen, en moeten worden uitgevoerd door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren. Hierin wordt een protocol voor een eenvoudiger diagnostische techniek die beschikt over de unieke combinatie van magnetische en fluorescerende parameters in een nanoparticle gebaseerde platform voorgesteld. De voorgestelde multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) kan detecteren E. coli O157:H7 besmetting met zo weinig als 1 kolonie-vormende eenheid aanwezig in oplossing binnen minder dan 1 uur. Bovendien, het vermogen van MFnS om te blijven hoogfunktionele in complexe media zoals melk en meerwater is geverifieerd. Extra specificiteit assays werden ook gebruikt om aan te tonen van het vermogen van MFnS om alleen de specifieke doelgroep bacteriën, zelfs in aanwezigheid van soortgelijke bacteriesoorten te detecteren. De koppeling van magnetische en fluorescerende modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van pathogen besmetting in een breed scala van concentraties, exposeren zijn hoge prestaties in beide vroege - en late-stadium besmetting detectie. De doelmatigheid, de betaalbaarheid en de overdraagbaarheid van de MFnS laten een ideale kandidaat voor point-of-care screening voor bacteriële contaminanten in een breed scala van instellingen, van aquatische reservoirs aan commercieel verpakte levensmiddelen.

Introduction

Het permanente exemplaar van bacteriële besmetting in zowel commercieel geproduceerd voedsel en waterbronnen heeft behoefte aan een steeds snelle en specifieke diagnostische platformen gemaakt. ^{1 , 2} zijn enkele van de meest voorkomende bacteriële verontreinigingen die verantwoordelijk zijn voor de verontreiniging van voedsel en water uit de Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus en Escherichia geslachten. ^{3 , 4} bacteriële besmetting door deze ziekteverwekkers vaak leidt tot symptomen zoals koorts, cholera, gastro-enteritis en diarree. ⁴ besmetting van waterbronnen vaak drastische en nadelige gevolgen heeft voor de Gemeenschappen zonder toegang tot voldoende gefilterd water en verontreiniging van levensmiddelen heeft geleid tot een groot aantal ziekten en product recall inspanningen. ^{5 , 6}

Teneinde het ontstaan van ziekten veroorzaakt door bacteriële besmetting, zijn er een aantal inspanningen voor de ontwikkeling van methoden waarmee water en voedsel kunnen worden efficiënt gescand vóór de verkoop of het verbruik. ³ technieken zoals de PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,12 ()-lus-gemedieerde isotherme amplificatie LAMP),^13,14 o.a.^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} onlangs zijn gebruikt voor de detectie van verschillende ziekteverwekkers. Vergeleken met traditionele bacteriële culturing methoden, zijn deze technieken veel efficiënter met betrekking tot de specificiteit en de tijd. Echter, deze technieken nog steeds worstelen met valse positieven en negatieven, ingewikkelde procedures en kosten. ^{1 , 3 , 25} het is om deze reden dat multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) worden voorgesteld als een alternatieve methode voor de detectie van bacteriële.

Deze nanosensors koppel uniek samen magnetische ontspanning en fluorescerende modaliteiten, waardoor voor een dual-detectie-platform dat is zowel snel als nauwkeurig. Met behulp van E. coli O157:H7 als een monster verontreinigingen, wordt het vermogen van MFnS om op te sporen zo weinig als 1 CFU binnen enkele minuten aangetoond. Pathogeen-specifieke antilichamen worden gebruikt om de specificiteit, en de combinatie van zowel magnetische als tl modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van bacteriële contaminanten in zowel laag - en hoog-besmetting bereiken. ¹⁶ in het geval van bacteriële besmetting, zal de nanosensors rond de bacteriën als gevolg van de targeting mogelijkheden van de pathogeen-specifieke antilichamen zwerm. De binding tussen de magnetische nanosensors en bacteriën beperkt de interactie tussen de magnetische ijzeren kern en het omringende water protonen. Dit veroorzaakt een toename in de T2 ontspanning tijden, zoals geregistreerd door een magnetische relaxometer. Als de concentratie van bacteriën in oplossing stijgt, wordt de nanosensors met het toegenomen aantal bacteriën, wat resulteert in lagere T2 waarden verspreiden. Omgekeerd, fluorescentie emissie zal toenemen in verhouding met de concentratie van bacteriën, als gevolg van het toegenomen aantal nanosensors direct gebonden aan pathogenen. Centrifugeren van de monsters, en isolatie van de bacteriële pellet, zal alleen de nanodeeltjes die rechtstreeks zijn verbonden met de bacteriën, een vrij zwevende nanosensors verwijderen en direct correleren de fluorescentie-uitstoot met het aantal besparen bacteriën aanwezig in oplossing. Een schematische weergave van dit mechanisme wordt afgebeeld in Figuur 1.

Dit MFnS-platform is ontworpen met point-of-care screening in het achterhoofd, wat resulteert in lage kosten en draagbare kenmerken. MFnS zijn stabiel bij kamertemperatuur, en alleen in zeer lage concentraties voor nauwkeurige detectie van bacteriële verontreinigende stoffen zijn verplicht. Bovendien, na synthese, gebruik van de MFnS is eenvoudig en vereist niet het gebruik van opgeleide professionals in het veld. Tot slot, dit diagnostische platform voorziet hoogst klantgerichte richt, zodat zij over een middel door welke dit één platform kan worden gebruikt voor het detecteren van ziekteverwekkers van alle soorten, in vele verschillende settings.

Protocol

1. synthese en Functionalization van multi parametrische Magneto-belichting fluorescerende Nanosensors (MFnS).

1. Synthese van superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (IONPs)
   1. voor te bereiden voor IONP synthese, voorbereiding van de volgende 3 oplossingen: oplossing 1: FeCl ₃ (0.70 g) en FeCl ₂ in H ₂ O (2 mL), oplossing 2: NH ₄ OH (2,0 mL, 13.4 M) in H ₂ O (15 mL) en oplossing 3: polyacryl zuur (0.855 g) in H ₂ O (5 mL).
   2. 90 µL van 2 M zoutzuur (HCl) aan oplossing 1 toevoegen en onmiddellijk meng met oplossing 2 terwijl vortexing op 875 rpm. Voeg vervolgens oplossing 3. Blijven vortexing voor 60 min.
   3. Centrifugeer gedurende 20 min op 1,620 x g. Centrifugeer de bovendrijvende vloeistof gedurende 20 minuten op 2,880 x g.
   4. Zuiveren het definitieve supernatant via dialyse. Het supernatant toevoegen aan een zak dialyse (MWCO 6 − 8 K) en plaats deze in een bekerglas van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.4) en spin bar. Laat het weken voor 12u, vervangen door verse buffer elke 2-3-h.
2. Vervoeging van doelgroepen gerichte antilichamen tegen oppervlak van IONPs
   1. voorbereiden van de volgende vier oplossingen: oplossing A: 5 mg 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in 250 µL MES [2-(N- Morfolino) ethanesulfonic zuur] buffer (0,1 M, pH 6.8 =), oplossing B: 3 mg van N-Hydroxysuccinimide (NHS) in 250 µL van MES buffer (0,1 M, pH 6.8 =), oplossing C: 5 µg van IgG1, de E. coli mAb, in 225 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4) , en oplossing D: 4 mL IONP (5.0 mmol) in 1 mL PBS (pH 7.4).
   2. Toevoegen 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer oplossing A, vervolgens onmiddellijk toevoegen oplossing A tot en met D van de oplossing in kleine stappen binnen 15 s, het omkeren van de oplossing na elke toevoeging voor het mengen van.
   3. Onmiddellijk beginnen met het toevoegen van oplossing B tot en met D van de oplossing in kleine stappen over een periode van drie minuten durende. Meng door het omkeren van de oplossing na elke toevoeging.
   4. De oplossing na elke toevoeging voor het mengen van oplossing C toevoegen aan oplossing in stappen van 5 µL, omkeren.
   5. Reactie op blijven gedurende 3 uur bij kamertemperatuur en vervolgens de incubatie op 4 ° C's nachts toestaan.
   6. Zuiveren de resulterende Ab-geconjugeerde IONPs via magnetische kolom met PBS (pH = 7.4, finale [Fe] = 3,5 mmol) te verwijderen van elk unconjugated antilichamen.
      1. De magnetische kolom wassen met PBS (1 mL). De kolom koppelen aan de magnetische plaat en IONP oplossing toevoegt.
      2. Was de magnetische kolom met PBS (1 mL) weer. Verwijder de magnetische kolom uit magnetische plaat. PBS toevoegen aan de kolom en verzamel de oplossing. Bewaren bij 4 ° C
3. inkapseling van fluorescerende 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleurstof in de coating van polyacryl zuur (PAA) van de antilichaam-geconjugeerde IONPs met behulp van een oplosmiddel diffusie methode.
   1. Aan de IONPs 4 mL, voeg toe dropwise 2.0 µL van DiI kleurstof (2 mmol) in 100 µL van DMSO met Continu mengen op 1100 rpm.
   2. Dialyze van de resulterende oplossing (MWCO 6-8 KDa, 12 h) tegen PBS, het creëren van een eindoplossing van de MFnS met een definitieve ijzer-concentratie [FE] = 2 mmol.
4. Karakterisering van MFnS
   1. voor spectrofotometrische analyse, een afleesapparaat te gebruiken voor het detecteren van ingekapselde DiI kleurstof met fluorescentie emissie bij 595 nM.
   2. Dynamisch licht verstrooiing
      1. plaats een steekproef van de MFnS-oplossing in een zetasizer om te bepalen van de gemiddelde grootte en oppervlakte last van de MFnS.
         Opmerking: Hier, de gemiddelde grootte en oppervlakte last van functionele MFnS bleken 77.09 nm en-22.3 mV, respectievelijk.

2. Bacteriële Culturing en Stock oplossing voorbereiding

1. bacteriële Culturing
   1. hydrateren een gevriesdroogd pellet (E. coli O157:H7) in 1 mL nutriënten Bouillon en voeg vervolgens een extra 5 mL Bouillon.
   2. Toepassing 100 µL van deze oplossing tot een agarplaat en streep met behulp van een steriele inoculatie lus, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 24 h.
   3. Na 24 h, selecteer een geïsoleerde kolonie in de agarplaat en toe te voegen aan een 15 mL Bouillon van de cultuur. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4-6 uur, terwijl het toezicht op de waarde van de optische dichtheid (absorptie bij 600 nm).
   4. Zodra de waarde van een optische dichtheid van 0,1 is verkregen, stoppen kweken, en uitvoeren van seriële verdunningen.
2. Seriële verdunningen
   1. toevoegen 900 µL van nutriënten Bouillon acht buizen van de steriele microcentrifuge.
   2. Voeg 100 µL van de bacteriële suspensie aan de eerste buis (verdunning 10 ^-1).
   3. Nemen 100 µL van de eerste buis en voeg deze toe aan de tweede, het verkrijgen van een verdunning van 10 ^-2. Blijven dit patroon voor de overige buizen, eindigend met een uiteindelijke verdunning van 10 ^-8.
   4. Breng 100 µL van elke buis te scheiden van de agar platen, en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
   5. De volgende dag, tellen de kolonievormende eenheden (CFUs) op elke plaat. Selecteer de plaat met ~ 100 CFUs. Gebruik van de overeenkomstige verdunningen voor verdere experimenten (100 µL = ~ 100 CFUs).
      Opmerking: Het was hier de 10 ^-6-verdunning die in ~ 100 CFUs resulteerde.

3. Snelle detectie van E. coli O157:H7 met MFnS

1. Spike verschillende PBS oplossingen (1 X, pH 7.4, 300 µL) met steeds grotere hoeveelheden de bacteriële voorraad van 10 ^-6, wat resulteert in CFU varieert van 1-100. Voeg een consistent hoeveelheid MFnS (100 µL) naar deze oplossingen.
2. Maken van een basislijn-oplossing die alleen PBS (1 X, pH 7.4, 300 µL bevat) en MFnS (100 µL).
3. Broeden oplossingen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en vervolgens laten afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Overdracht individuele oplossingen voor de magnetische relaxometer (0.47 Tesla) en de recordwijzigingen in ontspanning tijden (T2) ten opzichte van de CFUs in elke oplossing.
   1. Wijzigingen vastleggen in T2 waarden te beginnen door het meten van de waarde van de T2 van de basislijn-oplossing die alleen PBS en MFnS bevat.
      1. Plaats de oplossing in de magnetische relaxometer. De respectieve software openen, selecteert u de " T2 ontspanning " instelling en druk op " maatregel. "
   2. de T2-waarden van de extra oplossingen die zijn verrijkt met verschillende na de collectie van de basislijn T2, meten concentraties van bacteriën.
      Opmerking: De verandering in T2 is gelijk aan de basislijn T2 afgetrokken van de puntige T2.
5. Verwijderen van monsters van de magnetische relaxometer samen en centrifugeer de buizen bij 2880 x g gedurende 10 minuten
6. Giet het supernatant en resuspendeer bacteriële pellets in 100 µL van PBS (1 X, pH 7.4).
7. Toevoegen 80 µL van elke resuspensie een 96-wells-plaat en record fluorescentie intensiteiten op 595 nM.
   Opmerking: Testen kan worden herhaald met gebruikmaking van verschillende oplosmiddelen, met inbegrip van meerwater, melk en anderen, zoals beschreven in het gedeelte ' resultaten '

Results

Het werkingsmechanisme MFnS wordt afgebeeld in Figuur 1. De clusters van MFnS rond het oppervlak van bacteriële contaminanten interfereert met de interacties tussen de magnetic cores van de MFnS en de omliggende waterstofkernen. Als gevolg van deze clustering, magnetische ontspanning verhogen waarden. Als de concentratie van bacteriële contaminanten toeneemt, clustering vermindert, en de verandering in T2 waarden vermindert. De toevoeging van een fluorescerende modaliteit is daarom van cruci...

Discussion

Dit protocol is ontworpen voor de productie van volledig functionele MFnS zo eenvoudig mogelijk. Echter, er zijn veel belangrijke punten waartegen de wijziging van het protocol nuttig zijn, afhankelijk van het einddoel van de gebruiker kunnen. Bijvoorbeeld, zou het gebruik van verschillende antilichamen voor het targeten van vele andere ziekteverwekkers. Bovendien, is dit protocol niet beperkt tot het gebruik van antilichamen als targeting moleculen. Een molecuul dat specifieke bindende a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferrous Chloride Tetrahydrate	Fisher Scientific	I90-500
Ferric Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	I88-500
Ammonium Hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144S-500
Polyacryllic Acid	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anti-E. coli O111 antibody	sera care	5310-0352
Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI Stain	Fisher Scientific	D282
Nutrient Broth	Difco	233000
Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet	ATCC	700728
Magnetic Relaxometer	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Plate Reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Magnetic Column	QuadroMACS	130-090-976
Centrifuge	Eppendorf	5804 Series
Centrifuge (accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Floor Model Shaking Incubator	SHEL LAB	SSI5
Analytical Balance	Metler Toledo	ME104E
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
Open-Air Rocking Shaker	Fisher Scientific	02-217-765