Methodenartikel

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en Xenopus Embryonale Ontwikkeling

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinase-activiteit is cruciaal voor een overvloed aan cellulaire functies, waaronder celproliferatie, differentiatie, migratie en apoptose. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de kinase-activiteit zeer dynamisch en wijdverspreid over het embryo. Farmacologische en genetische benaderingen worden vaak gebruikt om kinase-activiteiten te onderzoeken. Helaas is het uitdagend om superieure ruimtelijke en temporale resolutie te bereiken met behulp van deze strategieën. Bovendien is het niet haalbaar om de kinaseactiviteit op een omkeerbare manier te controleren in levende cellen en multicellulaire organismen. Een dergelijke beperking blijft een knelpunt voor het bereiken van een kwantitatief begrip van kinase-activiteit tijdens ontwikkeling en differentiatie. Dit werk presenteert een optogenetische strategie die profiteert van een bicistronisch systeem dat fotoactivatabele eiwitten bevat Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) en het N-terminale domein van Cryptochrome-interactie Basis-Helix-Lus-Helix (CIBN). ReversiBle activatie van de mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signalering route wordt bereikt door middel van licht gemedieerde eiwit translocatie in levende cellen. Deze aanpak kan toegepast worden op zoogdiercelculturen en levende embryo's van vertebraten. Dit bicistronische systeem kan worden genegaliseerd om de activiteit van andere kinasen te reguleren met soortgelijke activatiemechanismen en kan toegepast worden op andere modelsystemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Groeifactoren zijn betrokken bij een breed spectrum van celfuncties, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie en apoptose, en spelen in vele biologische gebeurtenissen een centrale rol, waaronder embryonale ontwikkeling, veroudering en regulering van de mentale status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Veel groeifactoren signaleren via complexe intracellulaire signalerende cascades. Deze signaleringsgebeurtenissen worden op een nauwkeurig gereguleerde wijze 6 , 7 vaak door reversibele eiwitfosforylering bediend. Zo is een begrip van de signaleringsuitkomsten van proteïnekinasen, die verantwoordelijk zijn voor eiwitfosforylering, fundamenteel belangrijk.

Verschillende groeifactoren fungeren door een vrij algemeen intracellulair signaleringsnetwerk, ook al stimuleren ze distInkt cellulaire responsen 8 , 9 . Algemene intracellulaire mediatoren van receptor tyrosine kinasen omvatten Ras, Raf, extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK), mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) / ERK kinase (MEK), fosfoinositide 3-kinase (PI3K), Akt en fosfolipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Het verzamelen van bewijs suggereert dat signalering diversiteit en specificiteit afhangen van de ruimtelijke en tijdelijke regulatie van signaleringsactiviteit 12 . Bijvoorbeeld, bij ratfheochromocytoomcellen (PC12) stimuleert epidermale groeifactor (EGF) -stimulatie, die resulteert in celproliferatie, de ERK-route 9 transient actief. Anderzijds stimuleert stimulatie met zenuwgroeifactor (NGF), die leidt tot celdifferentiatie, de ERK-weg op een volgehoue ​​wijze 9 , 13 . In gekweekte rBij hippocampale neuronen bevordert transiënte signalering door hersenafleidende neurotrofe factor (BDNF) de primaire neurietgroei, terwijl blijvende signalering leidt tot verhoogde neurietakking 14 . Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de gefosforyleerde ERK-activiteit tijdelijk dynamisch en verspreid over het embryo 6 . Een recent genetisch scherm tijdens de vroege Xenopus embryogenese toonde aan dat ERK en Akt signaling cascades, twee stroomafwaartse primaire groeifactorroutes, display-specifieke activatieprofielen 7 tonen . Zo begrijpt een begrip van kinase signalering uitkomsten hulpmiddelen die de ruimtelijke en temporale kenmerken van kinase-activiteit met voldoende resolutie kunnen proberen.

Conventionele experimentele benaderingen om de dynamische aard van de signaaltransductie tijdens de ontwikkeling te onderzoeken, missen de wenselijke ruimtelijke en temporale resolutie. Bijvoorbeeld, farmacologische benaderingen gebruiken kleine chemIcal of biologische moleculen om signaaltransductie in cellen en weefsels te stimuleren of te onderdrukken. De diffusieve aard van deze kleine moleculen maakt het uitdagend om hun actie te beperken tot een bepaald gebied van belang 15 . Genetische benaderingen ( bijv. Transgenese, het Cre-Lox-systeem of mutagenese) leiden vaak tot de onomkeerbare activering of repressie van de doelgen-expressie of eiwitactiviteit 16 , 17 , 18 . Het Tet-On / Tet-Off systeem 19 biedt verbeterde tijdelijke controle van gentranscriptie, maar heeft geen strikte ruimtelijke controle omdat het afhankelijk is van de diffusie van tetracycline. Recente ontwikkelingen in chemisch geïnduceerde eiwitdimerisatie 20 of foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 hebben een grote verbeteringDe tijdelijke controle van signaleringsnetwerken bewerkstelligd. De ruimtelijke controle blijft echter uitdagend door de diffusieve aard van de gecasteerde chemicaliën.

Recente opkomende optogenetische benaderingen, die de kracht van het licht aanwenden om eiwit-eiwitinteracties te beheersen, maken het mogelijk om de signaleringstrajecten te moduleren met hoge spatiotemporale precisie en omkeerbaarheid. Kort na zijn eerste succes bij het beheersen van neuronale ontsteking 25 , 26 , 27 is optogenetica uitgebreid om andere cellulaire processen te beheersen, zoals gentranscriptie, translatie, celmigratie, differentiatie en apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Een strategie met behulp van de pHotoactivatabele eiwitpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) eiwit en het N-terminale domein van cryptochrome-interactie-basisschroef-lus-helix (CIBN) werd recent ontwikkeld om Raf1 kinase-activiteit in zoogdiercellen en Xenopus embryo's 35 te controleren. CRY2 bindt aan CIBN bij blauwlichtstimulatie, en het CRY2 / CIBN eiwitcomplex splitst spontaan in het donker 34 . Blauw licht verwekt de CRY2 cofactor, flavin adenine dinucleotide (FAD), wat leidt tot een conformatieve verandering in CRY2 en de daaropvolgende binding aan CIBN. Constitutief actieve (W374A) en flavin-deficiënte (D387A) mutanten van CRY2 kunnen worden geproduceerd door mutaties in de FAD-bindende zak: de CRY2 W374A mutant bindt aan CIBN onafhankelijk van licht, terwijl de CRY2 D387A mutant niet bindt aan CIBN onder blauw -lichtstimulatie 36 , 37 . Het optogenetische systeem beschreven iN dit protocol gebruikt wildtype CRY2 en CIBN om eiwittranslokatiegemedieerde Raf1-activering in levende cellen te induceren. Het is bekend dat de membraanaanwerving van Raf1 zijn activiteit 38 verbetert. In dit systeem wordt een tandem CIBN-module verankerd aan het plasmamembraan en CRY2-mCherry is gefuseerd aan de N-terminale van Raf1 35 . Bij gebrek aan blauw licht blijft CRY2-mCherry-Raf1 in het cytoplasma, en Raf1 is inactief. Blue-light stimulatie induceert CRY2-CIBN binding en rekruteert Raf1 aan het plasmamembraan, waar Raf1 geactiveerd is. Raf activering stimuleert een Raf / MEK / ERK signalering cascade. Beide CRY2- en CIBN-fusie-eiwitten worden gecodeerd in een bicistronisch genetisch systeem. Deze strategie kan worden genegaliseerd om andere kinasen te controleren, zoals Akt, waarvan de activeringsstaat ook kan worden aangestuurd door eiwittransplicatie in cellen 39 . Dit werk bevat gedetailleerde protocollen voor de implementatie van deze optogenetische strategie bij zoogdiercelcultuRes en multicellulaire organismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieronderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van Illinois (IACUC) en het departement van dierlijke hulpbronnen van de Universiteit van Illinois (DAR).

1. Optogenetische Inductie van Proteïne Lokalisatie in BHK21 Mammalian Cell Culture

OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 geven een methode om een ​​celcultuurkamer te monteren voor beeldvorming met hoge vergrotingsdoelstellingen (bijvoorbeeld 63X of 100X), die typisch korte werkafstanden hebben. Deze doelstellingen vereisen een dunne glazen deklaag ( bijv. # 1,5, 170 μm dikte) als het beeldvormende substraat. Als alternatief kan een glasbodemcultuurcultuurschotel / -schuif gebruikt worden. In dat geval kunnen stappen 1.1-1.3 worden overgeslagen.

  1. Reinigen van glazen deklagen
    1. Plaats 30 glazen deklagen in een dekselhouder.
    2. Voeg in een 600 ml plastic beker 20 g detergens en 400 ml warm kraanwater toe. PlacE de beker op een magnetische roerder en roer tot alle detergent is opgelost. Verwijder het schuim met behulp van tissuepapier.
    3. Gebruik de bodem van een 100 mm x 15 mm Petri schotel als een spacer van de roerbalk en als oppervlak voor de deklaaghouder. Om voldoende stroom tijdens het schoonmaakproces te behouden, maak 3-4 afvoergaten in de Petri-schotel.
    4. Om de afvoergaten te maken, verwarm een ​​soldeerbout en breng door het plastic in een afgedekte afzuigkap.
      VOORZICHTIG: Raak het verwarmde soldeerbout niet aan met blote handen.
    5. Plaats de dekselhouder op de Petri-schotel in de beker. Roer gedurende 2 uur gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
    6. Was drie keer met 500 ml DI water in een 1.000 ml beker. De wasmiddeloplossing kan opnieuw worden gebruikt.
    7. Pak individuele deklips op met behulp van tang. Dompel de dekglazen in 190-proof (95%) ethanol gedurende 1 minuut.
    8. Droog de dekglazen in een steriele kap. Bewaar de dekglazen in een steriele plastic container tot het gebruik.
  2. Het maken van poly-L-lysine (PLL) -coated coverlips
    1. Maak 0,1 M boraatbuffer door 1,24 g boorzuur en 1,9 g dinatriumtetraboraat in 400 ml water op te lossen. Pas de pH op op 8,5 met 10 M NaOH.
    2. PLL losmaken in de boraatbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Aliquot de PLL oplossing in 50 ml steriele centrifuge buizen.
    3. Voeg 50 ml PLL coatingoplossing toe aan een 10 cm weefselkweekschotel. Leg de schotel in een 37 ° C incubator om de PLL-oplossing op te warmen.
    4. Open de deklaaghouder (stap 1.1.8) in een steriele kap.
    5. Dompel de gereinigde deklagen één voor één in de voorverwarmde PLL-oplossing in de weefselkweekschotel. Vermijd belvorming om alle oppervlakken te onderdompelen.
    6. Plaats de schotel met de deklaag in een 37 ° C CO 2 -cubator gedurende de nacht. Verwijder elke deklaag en plaats hem in een steriele deklaaghouder. Spoel drie keer uit met geautoclaveerd ultraviolet water (18,2 MΩ & #183; cm resistiviteit) in een 1.000 ml beker in een steriele kap.
    7. Droog de dekglazen in de dekselhouder in de steriele kap. Bewaar de dekglazen in een steriele plastic container tot het gebruik.
  3. Montering van polydimethylsiloxaan (PDMS) celkweekkamers
    1. Weeg in een plastic container 40 g PDMS base en voeg 4 g hardingsmiddel toe om een ​​10: 1 w / w verhouding PDMS en uithardingsmiddel te bereiken. Meng het PDMS / uithardingsmiddel door 2 minuten met een pipettip te roeren. Alternatief, gebruik een centrifugaalmenger.
    2. Gebruik een beker met een diameter van 4 inch als een sjabloon om een ​​houder te maken met een stuk aluminiumfolie. Plaats de aluminiumfoliehouder in een 15 cm Petri-schotel. Plaats een 4-inch siliconenwafel in deze aluminiumfoliehouder.
    3. Giet de gemengde PDMS-oplossing in de houder. Gebruik een dunne glasstang om de rand van de wafel voorzichtig aan te raken. Verwijder alle luchtbellen die onder de wafel vallen.
    4. Steek de 15 cm Petri-schotel in een vacuümkambeR om de PDMS-oplossing te ontgassen. Blijf doorgassen gedurende ongeveer 20 minuten, tot er geen bellen worden gegenereerd. Ondertussen verwarmt u een convectieoven tot 65 ° C.
    5. Plaats de 15 cm Petri-schaal voorzichtig in de oven. Incubeer gedurende 2 uur.
    6. Verwijder de plaat uit de oven. Gebruik een glazen staaf om de rand van de PDMS voorzichtig aan te raken en zorg ervoor dat de crosslinking compleet is. Indien niet, inkubeer langer, tot de PDMS stevig en niet-kleverig is.
    7. Verwijder de aluminiumfolie uit de plaat en haal het af van de siliconenwafel. Begin vanaf de rand, schuur de geharde PDMS zorgvuldig af van de siliconenwafel.
      VOORZICHTIG: Vermijd te veel kracht, aangezien het de wafel kan breken.
    8. Trim de PDMS in 20 mm x 30 mm rechthoekige stukken om de 24 mm x 40 mm deklaag met een scheermesje aan te passen.
    9. Gebruik een beitelvormige mes om een ​​rechthoekige opening van 10 mm x 20 mm van het midden van elk PDMS stuk te snijden.
    10. Maak de PDMS-kamers schoon met behulp van het in stap 1.1 beschreven wasmiddelprotocol.
    11. Droog de PDMS-kamers in een schone kap. Plaats de droge kamers in een autoclaverbare container bedekt met aluminiumfolie.
    12. Autoklaaf de container gedurende 30 minuten met behulp van zwaartekracht (121 ° C, 15 psi) en houd de houder bij kamertemperatuur op.
  4. BHK21 celculturen en transfectie
    1. Maak 500 ml medium voor BHK21 celcultuur door 445 ml DMEM te mengen met 50 ml FBS en 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamine (10.000 U / ml penicilline, 10 mg / ml streptomycine en 29,2 mg / ml L glutamine). Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van FBS 10% bedraagt.
    2. Aliquot 10 ml niet-HEPES CO 2 -afhankelijk medium voor live-cel imaging.
      OPMERKING: CO 2 -afhankelijk medium ondersteunt celgroei zonder een CO 2- incubator en is ideaal voor het imaging van cellen onder atmosferische omstandigheden. Raadpleeg de materiaallijst voor gedetailleerde informatie. Naast de BHK21 cellijn, moeten andere soorten zoogdiercellen ook gevenVergelijkbare resultaten.
    3. Monteer een celcultuurapparaat door een autoklaafde, steriele PDMS-kamer (stap 1.3) op een steriele PLL-beklede deklaag (stap 1.2) in een steriele kap te plaatsen.
    4. Plaats elk apparaat in een steriele 60 mm Petri schotel.
    5. Gebruik 0,5 ml 0,25% trypsine om de cellen los te maken van een putje van een 12-weefselkweekplaat. Tel de celdichtheid met een hemocytometer. Platte 20.000 BHK21 cellen in de kamer (ongeveer 10.000 cellen / cm2) met 200 μl celcultuurmedium.
    6. Bereid DNA-plasmide met een plasmidpreparatiekit (zie de Materials List).
      OPMERKING: Het ontwerp en de functionaliteit van de CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX zijn weergegeven in Figuur 1A - 1B .
    7. Vierentwintig (24) uur na celplating, transfecteer de cellen met 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmide volgens het protocol van de fabrikant.
    8. Drie (3) uur na transfectie, verander de mEdium tot 200 μl vers cultureel medium (stap 1.4.1) en laat de cellen overnacht herstellen door de cultuur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator te incuberen.
  5. Fluorescentie live-cel beeldvorming
    1. Zet een computer, lichtbron, microscoop en camera aan. Gebruik een confocal fluorescentiemicroscoop (uitgerust met een 100x olie-immersion-doelstelling) voor de rest van het protocol.
      OPMERKING: Een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop kan ook gebruikt worden.
    2. Vervang het celkweekmedium met 200 μl CO 2 -dependent medium.
    3. Stel het data-acquisition protocol in voordat u de cellen op de microscoop plaatst. Gebruik een 488 nm excitatie FITC kanaal voor optogenetische stimulatie. Gebruik een 561 nm excitatie TRITC kanaal om getransfecteerde cellen te lokaliseren en de cellulaire lokalisatie van mCherry gelabelde eiwitten te volgen.
    4. Stel de gain van FITC en TRITC-kanalen in respectievelijk 120 en 200. Gebruik een pixel-residentietijd van 2.21; s en grootte van 512 x 512 pixels.
    5. Meet de kracht van het 488 nm licht door een stroommeter dicht bij het objectief venster te plaatsen. Een totale vermogen van 2 μW (ongeveer 10.000 W / cm2 bij de focus) is voldoende om CIBN-CRY2PHR associatie te veroorzaken.
    6. Stel een timestampverwerving in met een 5 s interval en een totale aanschafstijd van 2 minuten.
    7. Breng passend index-bijpassend materiaal aan (dompel olie) op het objectief venster. Gebruik de fase-contrast modus om te concentreren op de cellen op de deklaag oppervlak.
    8. Zoek een getransfecteerde cel onder 561 nm licht door het microscoop stadium te verplaatsen.
      VOORZICHTIG: Vermijd het gebruik van blauw licht tijdens deze stap, aangezien het de associatie tussen foto-activeerbare eiwitten zal activeren.
    9. Zodra een getransfecteerde cel zich bevindt, start de data-acquisitie.
      OPMERKING: succesvol getransfecteerde cellen moeten fluorescentie tonen in zowel FITC (vanaf 2CIBN-GFP-CaaX) en TRITC (van CRY2-mCherry-Raf1) kanalen ( Figuur 1C-D ).
    10. Record een serie van de tijdstempelbeelden in zowel de FITC- als TRITC-kanalen ( Figuur 1D ).
    11. Om de spontane dissociatie van het CRY2-CIBN-eiwitcomplex te detecteren, moet u een andere tijdstempel met het Txred-kanaal alleen gedurende 20 minuten opnemen, met een interval van 30 s.
    12. Bewaar de gestempelde afbeelding voor data-analyse.
  6. Beeldanalyse
    1. Open de afbeeldingen met een beeldanalysesoftware die de intensiteit van een afbeelding 40 kunt uittrekken.
    2. Selecteer twee representatieve snapshots: één voor de blauwe belichting en de andere blootstelling na het blauwe licht.
    3. Trek een lijn over de cel die de achtergrond, het plasmamembraan en het cytoplasma overspant. Project de intensiteit langs deze lijn. Bewaar de waarden en plot ze uit om het verschil voor en na de lichtbelichting te vergelijken ( Figuur 1D ).
    4. Om de kinetiek van eiwitvereniging te analyseren, selecT een representatieve regio van belang (ROI) in het plasmamembraan, een ROI in het cytoplasma en een ROI op de achtergrond.
    5. Verkrijg de gemiddelde intensiteiten van het plasmamembraan (I PM ), het cytoplasma (I CYT ) en de achtergrond (I BKD ) voor de beeldstapel.
    6. Bereken de verhouding van membraan / cytosolische intensiteit voor elke afbeelding met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-1
    7. Bepaal de verhouding versus de tijd en bepaal de bindings- of dissociatiekinetiek van CRY2-CIBN ( Figuur 1E -F ).

2. Constructie van een LED-array voor langdurige lichtstimulatie in een CO 2- incubator

OPMERKING: Het algemene schema van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 2A .

  1. Maak de LED-array door 12 blauwe LED's in twee broodboarden in te voegenDs en verbindende stroombegrenzende weerstanden.
    OPMERKING: Met een 30 V stroomtoevoer kunnen vier LED's in serie worden aangesloten, en hun helderheid kan worden geregeld door een stroombegrenzende weerstand.
  2. Plaats de broodplaten in een aluminium doos.
    OPMERKING: De hoogte van de aluminium doos moet 2 inch zijn. Deze hoogte is optimaal voor het verlichten van een weefselkweekplaat met 12 putjes, omdat de afmeting van de uiteenlopende lichtvlek hetzelfde is als die van een enkele put.
  3. Gebruik twee metalen draden om verbinding te maken met de voeding. Zorg ervoor dat de lengte van de draad voldoende is wanneer de lichtbox in een CO 2- incubator zit.
  4. Gebruik een transparante lichtdiffuser als de omslag van de lichtbox ( figuur 2C ).
  5. Kalibreer de stroomuitgang van elke LED op een bereik van spanningsinvoer. Gebruik een kracht van 0,2 mW / cm 2 voor de 24 h PC12-celdifferentiatiebepaling. Gebruik een kracht van 5 mW / cm 2 voor levende Xenopus embryo's of -explosiesassays.

3. Optogenetische Inductie van PC12 Cell Differentiatie

  1. Celculturing en transfectie
    1. Maak 500 ml medium voor een celkweek van een rat feochromocytoom (PC12) door 407,5 ml F12K te mengen met 75 ml paardserum + 12,5 ml FBS + 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamine (eindconcentraties van paardserum en FBS : Respectievelijk 15% en 2,5%). Maak laag serummedium door 1 volume vol medium in 99 volumes F12K medium te mengen.
    2. Plate PC12 cellen in een 12-putjesplaat met een dichtheid van 300.000 cellen / putje of 75.000 cellen / cm2.
    3. Transfecteer de cellen met CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 uur na celplating (vergelijkbaar met stap 1.4.7). Gebruik 1,2 μg DNA voor elke bron. Laat de cellen overnacht in kweekmedium herstellen in een 37 ° C incubator aangevuld met 5% CO2. Controleer de transfectie-efficiëntie 16 uur na transfectie.
      OPMERKING: een 30-50% transfectie effIciency moet worden bereikt om een ​​voldoende celtelling te waarborgen.
    4. Vervang het medium tot het laag-serummedium 24 uur na transfectie. Gebruik 1 ml medium per putje van een 12-putjesplaat.
  2. Licht geïnduceerde PC12 cel differentiatie
    1. Plaats de LED-array in een CO 2- incubator. Sluit het aan op de voeding met behulp van een paar draden. Stel de stroom van de LED in op 0,2 mW / cm 2 . Plaats de 12-putjesplaat met getransfecteerde PC12-cellen (stap 3.1.3) in het raam van de LED-array. Breng continu lichtverlichting gedurende 24 uur in een 37 ° C-incubator aangevuld met 5% CO2.
  3. Fluorescentie levende celbeelden
    1. Volg stappen 1.5.1-1.5.4 voor microscoop en monsterbereiding.
    2. Stel single-moment data acquisition. Gebruik 200 ms voor zowel het GFP als het Txred-kanaal.
    3. Vang afbeeldingen van de getransfecteerde cellen in zowel de GFP als de Txred-kanalen. Record ongeveer 200 celVoor elke voorwaarde. Sla de bestanden op voor data analyse.
  4. Beeldanalyse
    1. Tel het percentage gedifferentieerde cellen over het totale aantal getransfecteerde cellen.
    2. Gebruik een celtellermodule in de beeldanalysesoftware om de cellen te tellen.
    3. Tellen de gedifferentieerde cellen handmatig.
      OPMERKING: Gedifferentieerde cellen zijn gedefinieerd als die waarin tenminste één neuriet onderscheidbaar langer is dan het cellichaam ( Figuur 3A -3B ).
    4. Herhaal stap 3.4.3 met ongedifferentieerde cellen.
    5. Bereken de differentiatieverhouding met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-2

4. Optogenetische controle van kinase-activiteit in Xenopus embryo's

  1. Bereiding van buffers
    1. Bereid 1 L van 1x Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 en 5 mM HEPES; PH 7,5.
  2. Bereiding van mRNA
    1. Digest het CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmide DNA (2 μg) met 1 μL ApaI (50 eenheid) bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    2. Neerlinieer gel lineariseerd DNA in 60 μl 100% ethanol. Spin bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het DNA te pelletiseren. Verwijder de supernatant zorgvuldig en doe de pellet opnieuw met 60 μl 70% ethanol. Spin bij 12.000 × g gedurende nog 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant zorgvuldig en verwijder de DNA-pellet in 6 μl RNase-vrije H20.
    3. Voer in vitro transcriptie uit door 1 μg gel lineariseerd DNA te incuberen met 2 μl toegevoerd SP6 RNA polymerase, een ribonucleotide mengsel (10 mM ATP, CTP en UTP; 2 mM GTP en 8 mM cap analoog) en 20 μL nuclease- Vrij water bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    4. Verwijder de DNA-sjabloon door DNase I-digestie gedurende tenminste 15 minuten bij 37 ° C en zuivert het gesynthetiseerde RNA met behulp van een silica-membraan spin kolom.
    5. Stop de reactie en precipiteer het RNA door 30 μL nuclease-vrij water en 30 μl LiCl-precipitatieoplossing toe te voegen. Meng grondig en chill 30 minuten bij -20 ° C.
    6. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten bij 12.000 × g om het RNA te pelletiseren.
    7. Verwijder de supernatant zorgvuldig. Was de RNA eenmaal met 1 ml 70% ethanol en resuspendeer in 40 μl nuclease-vrij water.
    8. Laad 40 μL RNA in een spin kolom. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 1 minuut bij 12.000 × g om de niet-geïncorporeerde nucleotiden en caps te verwijderen.
  3. Harvest Xenopus embryo's
    1. Volg het protocol beschreven door Sive et al. 41 om de Xenopus embryo's te verkrijgen .
  4. MRNA microinjectie
    1. FabricerenDe naalden voor microinjectie door glazen capillairen met een capillaire trekker te trekken. Stel het trekprogramma in op: warmte = 355, treksterkte = 80, snelheid = 50 en tijd = 100.
    2. Verwijder de jelly coat van de embryo's door ze te behandelen met 3% cysteïne (verdund in 0.2x MMR).
    3. Breng de embryo's over naar 3% polysucrose en 0,5x MMR oplossing voor microinjectie. Spuit 500 pg aan 1 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA in elk embryo.
      OPMERKING: Injectie van een dosis hoger dan 1 ng resulteert in blauwe lichtonafhankelijke activering van de MAPK-signalering.
  5. Optogenetische stimulatie van kinase activiteit
    1. Cultuur microinjectie embryo's in 3% polysucrose, 0,5x MMR oplossing bij kamertemperatuur tot ze het middel gastrula stadium bereiken (fase 12). Vervolgens kweek de embryo's in 0,2x MMR-oplossing.
    2. Breng de embryo's of explanteren naar een 12-putjesplaat. Plaats de 12-putjesplaat op de huisgebouwde LED-array (stap 2.5) voor blauwlichtT (475 nm) behandeling.
    3. Plaats een spiegel op de bovenkant van de 12-putjesplaat om volledige bloemblaadjes te verlichten van de embryo's of explanteren.
    4. Stel de kracht van het blauwe licht in op 5 mW / cm 2 .
      OPMERKING: Blauwlichtbehandeling kan op elk gewenst moment worden uitgevoerd, in 3% polysucrose, 0,5x MMR oplossing of 0,2x MMR oplossing.
    5. Oog de embryo's op elk gewenst moment. Gebruik ze voor histologische, Western-blot- of gen-expressie-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ratiometrische expressie van fotoactivatabele eiwitparen: Figuur 1A toont het ontwerp van een bicistronisch optogenetisch construct, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (aangeduid als CRY2-2A-2CIBN), gebaseerd op de porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptide, dat de hoogste ribosom-overspringende efficiëntie onder zoogdiercellijnen 42 toont. In eerdere werkzaamheden is vastgesteld dat de optimale verhouding voor CIBN-GFP-CaaX: CRY2-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het bouwen van de lichtbox moet de stroom van individuele LED's worden gemeten. Op basis van eerdere ervaringen kan de stroomuitgang variëren tussen individuele LED's door de fabricagevariantie. Selecteer een set LED's die een stroomuitgang hebben binnen 10% van elkaar. Het aantal LED's, de stroombegrenzende weerstand en de voedingsingang kunnen worden aangepast voor verschillende soorten celcultuurcontainers (bijvoorbeeld een 6-put of een 24-putje plaat). Een 24 uur lichtverlichting bij een vermogen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign (UIUC) en de National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass coverslip VWR48393 230Substraat voor live celbeeldvorming
Coverslip holder Newcomer Supply6817BHouder voor coverslips
Detergent ThermoFisher16 000 104Voor het reinigen van coverslips
Boric acid Sigma-AldrichB6768-500GVoor het maken van PLL-buffer
Disodium tetraborateSigma-Aldrich71996-250GVoor het maken van PLL-buffer
Plastic beakerNalgene1201-1000Voor het reinigen van coverslips
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich221465-2.5KGVoor het aanpassen van pH
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP1274-500MGVoor het coaten van coverslips
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Behandeld waterThermoFisher Scientific750024Voor DNA-voorbereiding
Cover Glass ForcepsTed Pella5645Om cover glass te hanteren
WeefselcultuurschaalThermofisher12565321Celcultuurschaal
Steriele centrifugebuizenThermoFisher12-565-271Bufferopslag
TransfectiereagensThermoFisherR0534Transfectie
CO2-onafhankelijk mediumThermoFisher18045088Voor live celbeeldvorming
Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGVorm om celkamer te maken
Plasmid Maxiprep kitQiagen12965Plasmidvoorbereiding
DMEM mediumThermoFisher11965-084Celcultuurmediumcomponent
F12K mediumThermoFisher21127022Celcultuurmediumcomponent
Paarden serumThermoFisher16050122Celcultuurmediumcomponent
Fetal Bovine SerumSigna-Aldrich12303C-500 mLCelcultuurmediumcomponent
Penicilline-Streptomycine-GlutamineThermoFisher10378016Celcultuurmediumcomponent
Trypsine (0,25%), fenolroodThermoFisher Scientific15050065 Voor de dissociatie van zoogdiercellen
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Voor DNA-voorbereiding
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02Voor embryobuffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-Aldrich1.02839.0025Oöcytvoorbereiding
ApaIThermoFisherFD1414Voor het lineariseren van plasmiden
Dnase IThermoFisherAM2222Voor het verwijderen van DNA-template in de in vitro transcriptietest
Index-matchmaterialen (duikvloeistof)ThorlabsMOIL-20LNVoor het matchen van de index tussen monstersubstraat en objectief
Blauwe LEDAdafruit301Lichtbron voor optogenetische stimulatie
WeerstandskitAmazonEPC-103stroombegrenzende weerstand
Aluminium dozenBUD IndustriesAC-401lichtbak 
BreadBoardJekewin837654333686Voor het maken van LED-array
AansluitdraadElectronix Express27WK22SLD25Voor het maken van LED-array
RelaismoduleJbtekSRD-05VDC-SL-CVoor intermitterende lichtcontrole
DC-voeding TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)Voeding voor LED
Silicon Power HeadThorlabsS121CVoor lichtintensiteitsmeting
VermogenmeterThorlabsPM100D Voor lichtintensiteitsmeting
MicroscoopLeica BiosystemsDMI8Voor live celbeeldvorming
BioSafety CabinetThermoFisher1300 Series A2Voor de omgang met zoogdiercellen
CO2 incubatorThermoFisherIsotempVoor de kweek van zoogdiercellen
StereomicroscoopLeicaM60Voor micromanipulatie van embryo's
MicroinjectorNarishigeIM300Voor microinjectie van embryo's
MicropipettrekkerSutter InstrumentsP87Naaldtrekker
in vitro transcriptiekitThermoFisherAM1340Voor in vitro transcriptie. De kit bevat nuclease-vrij water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotidemix, cap-analogon, lithiumchlorideprecipitatieoplossing en spinkolom  
RNA-zuiveringsetQiagen74104Silica-membraanspinkolom voor zuivering van gesynthetiseerd RNA 
ConvectieovenMTI Corporation EQ-DHG-9015PDMS-uitharding
Centrifugemixer en tefloncontainerTHINKYAR310Voor het mengen van PDMS
Siliconen waferUniversityWafer452Basis voor het maken van PDMS  apparaten
MesTechni Edge01-801Voor het snijden van PDMS
CapillairglasSutter InstrumentsBF100-58-10Voor de fabricage van injectienaalden. 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975(2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469(2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917(2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256(2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057(2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische strategieCRY2 CIBN systeemprote ntranslocatiefluorescentiemicroscopieLED arraygenexpressieanalyse

Gerelateerde artikelen