Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Unified Methodological Framework voor Vestibular Schwannoma Research

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

20 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het samenstellen en verwerken van menselijke chirurgische monsters voor meerdere downstream toepassingen in vestibulaire schwannoma- en Schwann-celonderzoek.

Samenvatting

Vestibulaire schwannomen zijn de meest voorkomende neoplasma's van de cerebellopontinehoek, die 6-8% van alle intracraniale groeizen vormen. Hoewel deze tumoren sensorineuraal gehoorverlies veroorzaken in 95% van de getroffen individuen, blijven de moleculaire mechanismen die tot dit gehoorverlies leiden, onduidelijk. Dit artikel schetst de stappen in ons laboratorium om de inzameling en verwerking van diverse primaire menselijke weefselmonsters te vergemakkelijken voor downstream onderzoeksapplicaties die integraal zijn bij de studie van vestibulaire schwannomen. Specifiek beschrijft dit werk een verenigd methodologisch kader voor de verzameling, verwerking en cultuur van Schwann- en schwannomacellen uit chirurgische monsters. Dit is geïntegreerd met parallelle verwerkingsstappen die nu essentieel zijn voor huidig ​​onderzoek: de verzameling van tumor- en zenuwafscheidingen, het behoud van RNA en de extractie van eiwitten uit verzamelde weefsels, de fixatie van weefsel voor de bereiding van secties, eenD de blootstelling van primaire humane cellen aan adeno-geassocieerde virussen voor toepassing op gentherapie. Daarnaast benadrukt dit werk de translabyrinthine chirurgische benadering om deze tumor te verzamelen als een unieke kans om menselijk zintuiglijk epitheel van het binnenoor en periliem te verkrijgen. Tips voor het verbeteren van de experimentele kwaliteit worden verstrekt en gemeenschappelijke valkuilen worden gemarkeerd.

Inleiding

Vestibulaire schwannomen (VS's) zijn de meest voorkomende neoplasma's van de cerebellopontinehoek, gediagnosticeerd bij 1 op elke 100.000 individuen. Hoewel niet-metastatische, beïnvloeden deze tumoren een levenskwaliteit van een patiënt 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ernstig. Geïnteresseerden leven meestal met gehoorverlies, tinnitus en een gevoel van gehoorvervulling. Symptomen worden steeds meer belemmerend aangezien de tumor groeit, waardoor balansproblemen, gelaatsverlamming en vermindering van andere craniale zenuwfuncties ontstaan. Levensbedreigende complicaties als gevolg van hersenstam compressie kunnen ook 7 opleveren.

Beheersopties voor VS zijn in wezen beperkt tot waakzaam wachten op statische tumoren en stereotactische radiotherapie of chirurgische resectie voor groeiende tumoren 8. De chirurgische verwijdering van deze tumoren in onderzoeksgebonden ziekenhuizen biedt de mogelijkheid om vers tumorweefsel te verzamelen en te analyseren die tijdens de patiëntenoperaties worden verzameld. Een specifieke chirurgische benadering van VS, de translabyrinthine resectie, kan zelfs toegang bieden tot waardevolle menselijke zintuiglijke epithelium uit het binnenoor en periliem.

Omdat VS's voortkomen uit een perifere sensorische zenuw ( dwz de vestibulaire zenuw), is het belangrijk om VS-geassocieerde waarnemingen te vergelijken met die afgeleid van een passende controlevenuwe, zoals de menselijke grote auriculaire zenuw (GAN). Gezonde GAN's worden regelmatig geofferd tijdens parotidectomies of nekdissecties en kunnen gebruikt worden als robuuste modellen voor gezonde Schwann-celfysiologie 9 .

Omdat er geen FDA-goedgekeurde geneesmiddelen zijn voor de behandeling of preventie van sporadische VS, is het essentieel dat onderzoekers de onderliggende moleculaire mecha verduidelijkenNismen van de ziekte ter identificatie van therapeutische doelen. Proteïnen die zijn aangetoond dat ze een rol spelen in de VS-pathogenese, omvatten merlin, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), nucleaire factor kappa B (NF-KB), tumornekrosefactor alfa (TNF-alpha) , Epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en verwante signaleringsmoleculen 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Recente vooruitgang heeft uitgebreid en verbeterde protocollen voor het verzamelen, verwerken, culturen en stroomafwaarts onderzoek van primaire humane vestibulaire schwannomen en gezonde zenuwweefsels 18 , 19 . De meeste bestaande protocollen zijn echter ontworpen om de voorbereiding op te nemenAtion van dergelijke weefsels voor een enkele stroomafwaartse onderzoeksaanvraag ( dwz alleen celcultuur). Dit artikel bevat een uniforme methodologische kader voor de gelijktijdige verwerking van een enkelvoudig primair menselijk VS- of GAN-monster voor meerdere downstream toepassingen: celtype-specifieke cultuur, eiwit-extractie, RNA-behoud, insameling van tumorenecretie en weefselfixatie. Dit werk bevat ook details over de chirurgische insameling en verwerking van menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) en periliem tijdens transplantabyrinthine VS resectie, aangezien deze nauw verwante weefsels kunnen dienen als belangrijke bronnen van biomarkers voor VS. Tenslotte presenteert dit protocol stappen voor de virale transductie van primaire menselijke VS-cellen in cultuur als een nieuwe toepassing van dit weefsel voor gebruik bij gentherapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Schriftelijk geïnformeerde toestemming voor de verzameling van alle monsters is verkregen voorafgaand aan de operatie, en de experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de Wereld Medische Vereniging (Verklaring van Helsinki). Alle afdelingen van het studieprotocol werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Massachusetts Eye and Ear en Massachusetts General Hospital.

OPMERKING: De secties 1-7 hieronder zijn ontworpen om achtereenvolgens te worden uitgevoerd bij ontvangst van een primair menselijk VS- of GAN-monster uit de operatiekamer. Verwerking moet altijd beginnen met sectie 1. Dan moet RNA eerst als eerste worden bewaard (sectie 2), gevolgd door de bereiding van weefsel voor de verzameling van afscheidingen (sectie 3) en extractie van eiwitten (sectie 4). Weefsel dat wordt gekweekt (sectie 5 voor VS, sectie 6 voor GAN) kan in het aangevulde kweekmedium zitten, terwijl secties 2, 3 en 4 worden uitgevoerd. De fixatie van weefsel voor snede (sectie 7) is zeer kort en cEen worden uitgevoerd tijdens elke centrifugatie stap. Sectie 8 (periliemverwerking) en sectie 9 (CSF-verwerking) kunnen worden uitgevoerd bij ontvangst van perilymph of CSF uit de operatiekamer tijdens een translabyrinthine VS resectie. Sectie 10 (virale transductie) kan worden uitgevoerd op groeiende VS- of Schwann-cellen in cultuur.

1. Voorbereiding en ontvangst van een chirurgisch monster

OPMERKING: De volgende stappen moeten uitgevoerd worden in een steriele omgeving, zoals een weefselkweekhoofd of laminair stromende kap. Bekendheid met basis steriele techniek wordt verwacht.

  1. Bereiding van medium voor primaire menselijke VS- of Schwann-celkweek
    1. Doe een 50 ml aliquot van bevroren foetaal runder serum (FBS) in een 37 ° C waterbad.
    2. Voeg 5 ml penicilline / streptomycine mengsel toe aan een 500 ml fles DMEM / F-12, wat resulteert in een uiteindelijke verdunning van 1: 100.
    3. Voeg de 50 ml ontdooide FBS toe aan de 500 ml fles DMEM / F-12,Wat resulteert in een uiteindelijke verdunning van 1:10.
    4. Schrijf de datum, de voorletters van de onderzoeker en aanvullende informatie ( bijvoorbeeld 1% P / S, 10% FBS) op de fles.
    5. Plaats het nieuwe kweekmedium in de koelkast (4 ° C).
  2. Ontvangst en reiniging van VS of GAN monster
    1. Plaats in de operatiekamer het versgezette VS- of GAN-monster in steriele zoutoplossing in een monstercontainer. Vervoer het monster op ijs vanuit de operatiekamer naar een laminaire stroomkap in het laboratorium.
      OPMERKING: De steekproefgroottes en gewichten variëren sterk tussen patiënten op basis van de grootte van de relevante tumor of de hoeveelheid uitgesneden zenuw.
    2. Verwijder de voorraadoplossingsalimieten van hyaluronidase (25.000 U / ml) en collagenase (3.200 U / ml) uit de vriezer en laat de enzymen op kamertemperatuur ontdooien (vereist voor stap 5.1.4 of 6.1.6, afhankelijk van of het monster is Een VS of een GAN).
      OPMERKING: De resuspensie van gefijofiliseerde enzymen iS beschreven in detail op de productinformatiebladen. Collagenase kan opnieuw worden gesuspendeerd in elke calciumvrije gebalanceerde zoutoplossing en hyaluronidase in een oplossing van 0,02 M fosfaatbuffer (pH 7,0), 77 mM NaCl en 0,01% 1 mg / ml runder serumalbumine. De specifieke activiteit voor elk gelyofiliseerd enzym varieert met het lot en moet geverifieerd worden voor resuspensie.
    3. Met behulp van een reeks van drie 1,5 ml buizen gevuld met 1,4 ml 1x steriele PBS, was het VS- of GAN-monster driemaal. Zet het monster zorgvuldig over van buis naar buis met steriele tang. Sluit elke buis zodra het specimen bevat en schud zachtjes om te wassen.
      OPMERKING: Om overstroming van de 1,5 ml buizen te vermijden, kan minder dan 1,4 ml PBS per buis worden gebruikt als het tumorstuk groot is.
    4. Zet het monster in een droge 60 mm Petri-schotel en gebruik pincet om alle dode weefsels te verwijderen ( dwz cauterized porties, die gewoonlijk wit of ondoorzichtig van kleur zijn) en gebieden met prominente bloedvaten.
    5. Gebruik fOrceps of een scalpel blade om het monster in aparte stukken te verdelen voor RNA conservering, eiwit extractie, secretie collectie, fixatie en celcultuur (zie secties 2 - 6 hieronder).
    6. Breng het stuk van het specimen voor de celcultuur (sectie 5/6) over naar een nieuwe 60 mm kweekschotel die 5-8 ml koud, aangevuld DMEM / F-12 medium bevat (als alternatief kan het deksel van de eerste kweekschotel worden Gebruikt voor deze stap).
      OPMERKING: De hoeveelheid DMEM / F-12-medium nodig (vanaf stap 1.1) hangt af van de grootte van de tumor of de zenuw, maar het moet tussen 5 en 8 ml vallen. Dit stuk kan in cultuurmedium zitten, terwijl de volgende stappen worden uitgevoerd.

2. RNA Behoud van VS en GAN Weefsel (Ook Geldig voor Human Sensory Epithelium)

  1. Onder de laminar flow hood, overbrengen 1-1,2 mL RNA stabilisatie oplossing naar een nieuwe 1.5 mL tube.
  2. Nadat u het monster met PBS hebt gewassen (stap 1.2.3), duikt de kleine taart kort opCe van weefsel aangewezen voor RNA-behoud (ongeveer 3 mm 3 van VS of een 5 mm lengte van GAN) in de RNA-stabilisatieoplossing. Zorg ervoor dat het monster volledig in de oplossing is gedompeld.
  3. Bereid en label een nieuwe 1,5 ml buis. Haal het monster van de RNA-stabiliseringsoplossing, breng het over naar de nieuwe buis en berg deze in een -80 ° C vriezer.

3. Verzameling van de VS en GAN secreties

  1. Dag 1
    1. Na het wassen van het monster met PBS (stap 1.2.3), plaats het stuk VS of GAN aangewezen voor de verzameling van afscheidingen in een lege 1,5 ml buis.
    2. Bereid twee extra 1,5 ml buizen en pipet 500 μL DMEM (niet aangevuld met FBS) in elke buis.
      OPMERKING: De eerste buis DMEM wordt gebruikt om de tumorafscheidingen te verzamelen en de tweede buis DMEM zal dienen als een gecontroleerde controle. Afscheidingen kunnen worden verzameld in DMEM, elk ander typisch cultuurmedium nietAangevuld met serum, of PBS.
    3. Plaats een van de DMEM-bevattende buizen op een gekalibreerde digitale schaal. Trek de schaal aan, zodat wanneer de buis bovenop de schaal zit, leest het 0 mg.
    4. Verwijder de DMEM buis uit de schaal, plaats het specimen dat is aangewezen voor het verzamelen van afscheidingen in de buis en weeg het. Let op het resultaat, dat het gewicht van het weefsel alleen vertegenwoordigt.
    5. Onder een laminaatstroomkap zet het volume DMEM in de buis aan op 100 μL per 10 mg monster.
    6. Plaats de buis die het weefselmonster bevat en de gecontroleerde controle (DMEM alleen) in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) gedurende een periode die in overeenstemming is met de plannen voor dit experiment. Incubeer het weefsel gedurende ten minste 72 uur om biologisch bruikbare hoeveelheden tumor- of zenuwafscheidingen 15 te verzamelen .
  2. Dag 4
    1. Na incubatie gedurende 72 uur, verwijder het afscheidende bevattende medium uit deMonster ( dwz weefsel geconditioneerd medium) met een 1 ml pipet. Ter voorkoming van herhaalde bevriezing-ontdooicyclussen, verdeel het medium in nieuwe buizen volgens de geplande stroomafwaartse analyses ( bijv. Om een ​​ELISA met 4 putjes te verrichten, waarbij elk 50 μl nodig is, kan een hoeveelheid van 210 μl worden bereid).
    2. Indien nodig, vries het weefselstuk dat in de originele buis (al aangegeven op dag 1) bij -80 ° C is bevriezen voor aanvullende analyses, zoals DNA-extractie, op een later tijdstip.
    3. Bewaar het weefsel, afscheidingen en controleer DMEM in een -80 ° C vriezer tot de downstream toepassingen worden gestart ( bv. ELISAs, LC-MS / MS, cytokine arrays, enz. ).

4. Proteïne Extractie uit VS of GAN Weefsel

  1. Bereiding van versterkte RIPA buffer
    1. Voeg één tablet fosfataseremmer en één tablet proteaseremmers toe aan 10 ml RIPA-buffer in een 15 ml buis; Dit is versterktRIPA buffer.
      OPMERKING: Bewaar de RIPA-buffer bij 4 ° C en voeg de tabletten net voor gebruik toe.
  2. Proteïne-extractie
    1. Vervoer 210 μL versterkte RIPA buffer (stap 4.1.1) naar een nieuwe 1,5 ml buis.
    2. Na het wassen van het monster met PBS (stap 1.2.3), overstappen het kleine stukje weefsel dat is aangewezen voor eiwit extractie (ongeveer 3 mm 3 VS of een 5 mm lengte GAN) aan de RIPA buffer bevattende buis en plaats het op ijs Gedurende tenminste 10 minuten Bij het bestuderen van gefosforyleerde vormen van eiwitten, vul de RIPA-buffer aan met protease- en fosfataseremmers 14 . In de tussentijd kunnen stappen voor andere componenten van de weefselverwerking, zoals fixatie (sectie 7), worden uitgevoerd.
    3. Voorafkoelen van de centrifuge tot 4 ° C.
    4. Gebruik een plastic stamper, homogeniseer het weefsel in de RIPA buffer bevattende buis. Soniceer het weefsel gedurende 10-15 s bij 20% amplitude. Zorg ervoor dat het monsterBlijft op ijs, zelfs tijdens sonication.
    5. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 15.000 xg en 4 ° C.
    6. Aliquot het supernatant in 50 μl incrementeert in nieuwe buizen van 0,5 ml (afhankelijk van de beoogde stroomafwaartse toepassingen, kan elke gewenste maat worden gekozen).
    7. Bewaar de porties eiwitlysaat in een -80 ° C vriezer tot de downstream toepassingen worden gestart ( bijvoorbeeld ELISAs of Western blots) 20 , 21 .

5. Primaire menselijke VS-cultuur

  1. Dag 1
    1. Scheid het VS-weefsel dat is aangewezen voor celcultuur (die in kweekmedium zit, zoals beschreven in stap 1.2.6) in ongeveer 1 mm 3 stukken met behulp van een paar tang in elke hand.
    2. Aspirateer het tumorstuk bevattende medium met een 10 ml serologische pipet en laat alle inhoud overbrengen naar een 15 ml conische buis.
    3. Centrifuge gedurende 3 minuten bij1000 xg en 25 ° C.
    4. Ontbind het desintegratiemiddel in een nieuwe 60 mm kweekschotel door 4,7 ml aangevuld DMEM / F-12 medium met 250 μL collagenase (eindconcentratie: 160 U / ml) en 50 μl hyaluronidase (eindconcentratie: 250 U / ml) te combineren. , Voor een eindvolume van 5 ml.
      OPMERKING: Beide enzymen moeten worden opgeslagen in een -20 ° C vriezer, maar ontdooid voorafgaand aan de bereiding van dit medium (stap 1.2.2).
    5. Na centrifugeren zullen de tumorstukken een pellet vormen onderaan de conische buis. Pak de supernatant zorgvuldig af en gooi deze weg.
    6. Voeg 2 ml van het vers gemaakte enzym bevattende disintegratiemedium (stap 5.1.4) toe aan de tumorpellet. Pipet meerdere malen omhoog en omlaag om het weefsel te mobiliseren en het medium van het tumorstuk over te brengen naar de 60 mm kweekschotel.
    7. Leg de kweekschotel in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) gedurende 18 uur.
  2. Dag 2
    1. Warme DMEM / F-12 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine (bereid in stap 1.1) in een 37 ° C waterbad.
    2. Verwijder de petri schotel die de VS-cultuur bevat uit de incubator (stap 5.1.7). Gebruik een 22 G-naald die is bevestigd aan een 6 ml spuit, aspireer het cultureel bevattende medium en overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis.
    3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 37 ° C.
    4. In de tussentijd gebruik steriele tang om het vereiste aantal poly-D-lysine- en laminine-beklede glazen deklagen in een 24-putjes cultuurplaat te plaatsen.
      OPMERKING: Het aantal putten dat wordt gekweekt hangt af van de grootte van het monster; Ongeveer 24-32 putjes kunnen worden gekweekt uit een 1 cm 3 tumor, dus voor de meeste kleinere tumoren is planning voor 8-16 putjes van gekweekte cellen geschikt.
    5. Verwijder na het centrifugeren het supernatant ( dwz enzymverrijkt medium) en resuspendeer de resterende celpellet in vers, aangevuld DMEM / F-12 medium, voorwarmEd in stap 5.2.1.
      OPMERKING: Het volume waarin de pellet opnieuw wordt gesusploiteerd wordt bepaald door het aantal putten dat in stap 5.2.4 is gepland, waarbij 1 ml medium per geplande put wordt geschat.
    6. Aspireren 2 ml van het geresuspendeerde celmedium (stap 5.2.5) met behulp van een 5 ml serologische pipet. Deponeer 1 ml van het tumorcel bevattende medium in elke voorbereide put van de 24-putjesplaat.
    7. Ga verder met aspireren en afzetten van tumorcel bevattend medium (aspireren in stappen van 2 ml, van waaruit 1 ml in elke geplande put wordt gedeponeerd) totdat de tumorcel suspensie even verdeeld is tussen alle voorbereide putten.
    8. Plaats de 24-putjesplaat in de 37 ° C-incubator 's nachts.
  3. Dag 3
    1. Als er aanzienlijke rommel op de bodem van de putjes wordt genoteerd, verander het medium zorgvuldig in elke put naar nieuw aangevuld DMEM / F-12 kweekmedium, zorg ervoor dat u niet aanhechtende cellen loslaat. Als dat niet het geval is, stuur het bord terug naar de incubator en verander hetE medium voor de eerste keer op dag 5.
  4. Dagen 5-7 en daarna
    1. Verander het medium elke 3 dagen.
      OPMERKING: Primaire menselijke VS- en GAN-cellen worden doorgaans in cultuur gehandhaafd tot hun gebruik in downstream toepassingen, op of rond 14 dagen. De culturele zuiverheid neemt na dit 19 af .

6. Primaire menselijke GAN-cultuur

  1. Dag 1
    1. Onder een dissectiemicroscoop isoleren fascixen uit het weefsel dat is aangewezen voor de GAN-cultuur (die in cultuurmedium zit, zoals beschreven in stap 1.2.6).
      1. Isolateer de fascikels uit het epineurium en de vezelhuid door op het perineurium te trekken met nr. 5 pincet terwijl de epineurium met nr. 3 pincet.
    2. Zodra de fascicles voldoende geïsoleerd zijn van het omringende epineurium, overbrengen ze naar een nieuwe cultuurschotel met 2 ml verse supGeplande medium.
    3. Snijd de fascicles in 1 tot 2 mm segmenten met behulp van het scalpelblad.
    4. Pipetteer de kleine fascicale stukken en het omringende medium in een 15 ml buis die 3 ml vers aangevuld kweekmedium bevat, zodat het totale volume in de 15 ml buis 5 ml wordt.
    5. Centrifugeer het specimen gedurende 3 minuten bij 1.000 xg en 25 ° C.
    6. Ondertussen, maak een Schwann celcultuurmedium in een nieuwe 60 mm Petri-schotel door 4,7 ml aangevuld DMEM / F-12 medium, 250 μl collagenase en 50 μl hyaluronidase te combineren voor een eindvolume van 5 ml.
      OPMERKING: Bewaar beide enzymen bij -20 ° C; Ontdooien ze bij kamertemperatuur voor het bereiden van dit medium (stap 1.2.2).
    7. Na het centrifugeren van het monster zullen de fascikels condenseren in een kleine pellet in de conische buis. Gooi de supernatant weg.
    8. Voeg 2 ml van het vers gemaakte enzym bevattende disintegratiemedium (stap 6.1.6) toe aan de zenuwpellet. Pipette up en dMeerdere keren bezitten om het weefsel te mobiliseren en over te brengen naar een nieuwe 60 mm kweekschotel.
    9. Plaats de schotel in de incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) gedurende 20-22 uur.
      OPMERKING: Dit is een langere incubatie dan nodig is voor VS-monsters (stap 5.1.7).
  2. Dag 2
    1. Warm aangevuld DMEM / F-12 medium in een 37 ° C waterbad.
    2. Gebruik een 22 G-naald die is bevestigd aan een 6 ml spuit, aspiratie van het celcultuurbevattende medium en over te brengen naar een nieuwe 15 ml conische buis.
    3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 37 ° C.
    4. Gooi de supernatant weg en laat het monster opnieuw in een nieuw, voorverwarmd, aangevuld DMEM / F-12 kweekmedium worden gesuspendeerd.
    5. Gebruik steriele tang om het benodigde aantal bedekte deklagen in de putjes van een 24-putjes kweekplaat te plaatsen.
      OPMERKING: Het berekenen van twee putten van gekweekte cellen per 1 cm zenuwproef bevordert een robuuste groei van de cultuur.
    6. Voeg 1 ml van het kweekbevattende medium toe aan elkGoed aangewezen in de 24-putjesplaat.
    7. Plaats de 24-putjesplaat in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 .
  3. Dag 3
    1. Als er significante puin in de putjes wordt genoteerd, vervang het medium zorgvuldig met nieuw aangevuld DMEM / F-12 kweekmedium, zorg ervoor dat u niet aanhechtende cellen schuift. Als dat niet het geval is, stuur het bord terug naar de incubator en verander het medium voor de eerste keer op dag 5.
  4. Dagen 5-7 en daarna
    1. Verander het medium elke 3 dagen.

7. VS & GAN Tissue Fixation

  1. Pipet 1-1,2 ml 4% paraformaldehyde (PFA; CAUTION) in een nieuwe 1,5 ml buis.
  2. Na het wassen van de tumor of zenuw met PBS (stap 1.2.3), breng een klein stukje weefsel (ongeveer 3 mm 3 VS of 5 mm lengte GAN) in 4% PFA en plaats de buis op een shaker bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het exemplaar volledig ondergedompeld is in tHij oplossing.
  3. Na minstens 2 uur van fixatie, haal de buis van de shaker terug en ga verder met verdere verwerking ( bijv. Embedding in paraffine of optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) voor latere immunohistochemie of immunofluorescentie) 22 , 23 , 24 . Als alternatief kan het weefsel gesneden worden, zoals eerder beschreven 25 , 26 .

8. Inzameling en opslag van menselijke perilymph tijdens translabyrinthine VS resectie

  1. Plaats drie steriele 1,5 ml buizen op ijs.
    OPMERKING: Eén buis wordt als back-up bij besmetting gehouden.
  2. Vul een 1,5 ml buis met ongeveer 1,2 ml PBS-oplossing die twee keer gefiltreerd is met een 0,22 μm filter.
    OPMERKING: Om perilymph te verzamelen tijdens een translabyrinthine VS resectie, moet de chirurg eerst ervoor zorgen dat de surgiCal veld is vrij van botstof, bloed of zoutoplossing. De chirurg kan hiervoor een Schuknecht 21 of 24 G zuigbuis gebruiken in de niet-dominante hand.
    Een typische plaats waaruit de perilimf kan worden getrokken is de laterale halve cirkelvormige kanaal (echter kan ook de achterste halve cirkelvormige kanaal of ronde ruitmembraan worden toegankelijk, afhankelijk van de voorkeur van de chirurg). De chirurg moet het labyrintische botje met een diamantbur (met behulp van continue zuigbesproeiing) zorgvuldig verwijderen om de blauwe lijn ( dwz het membranale labyrint) van de halve cirkelvormige kanaal te identificeren. De halve cirkelvormige kanaal wordt door de blauwe lijn doordrongen met een lange 27 G-naald die is bevestigd aan een 1 ml tuberculinespuit.
  3. Vraag de chirurg om een ​​kleine hoeveelheid perilimf voorzichtig te aspireren en ga dan de spuit en de naald naar de chirurgische verpleegster.
    OPMERKING: Typisch wordt een druppel perilimf of minder verzameld. Als het waargenomen volume groter is, is het monster waarschijnlijk verontreinigd met andere fluid.
  4. Open de voorbereide, lege 1,5 ml buis en de buis direct met gebruik van PBS gevuld. Wees voorzichtig om de binnenkant van de buisdeksels niet aan te raken tijdens het openen.
  5. Ontvang de spuit en de bijgeleverde naald van de chirurgische verpleegkundige en maak de vloeistof helemaal in de lege buis, doe er zeker van dat u de buis zelf niet met de naald aanraakt.
  6. Maak de naald voorzichtig los van de spuit. Verontreinig de naaldpunt niet en houd deze in één hand vast.
    OPMERKING: Een zeer klein volume periliem is verzameld, zodat sommige vloeistof in de lange punt van de naald kan blijven.
  7. Anderzijds, gebruik de spuit zelf (zonder de naald) 0,2 ml gefiltreerde PBS oplossing van de bereide buis in het lichaam van de injectiespuit.
  8. Bevestig de naald aan de spuit. De spuit volledig ontruimen in de buis die perilymph bevat, met behulp van de steriele PBS om de naaldpunt te spoelen.
  9. Sluit de perilymph- en PBS-bevattende buis en plaats Het op ijs.
  10. Doe de naald in een sjaalcontainer.
  11. Plaats de buis die perilymph in de -80 ° C-vriezer zo snel mogelijk bevat.

9. Verzameling en opslag van menselijk CSF

  1. Plaats drie (of meer) steriele 1,5 ml buizen op ijs.
    OPMERKING: Eén tube is een back-up bij vervuiling of een monster volume dat groter is dan verwacht.
  2. Na het openen van de dura mater, vraag de chirurg om CSF te verzamelen met een 3 ml spuit (zonder een bijgeleverde naald).
    OPMERKING: Om contaminatie te voorkomen, moet de CSF-collectie onmiddellijk na de opening van de dura mater plaatsvinden.
  3. Vraag de chirurg om de spuit aan de chirurgische verpleegster te geven.
  4. Ontvang de spuit van de chirurgische verpleegkundige en evacueer het benodigde volume CSF volledig in de buis (en).
  5. Sluit de buis (en) en plaats ze op ijs.
  6. Plaats de buis (en) in de -80 ° C vriezer zo snel mogelijk.
E "> 10. Virale transductie experimenten voor primaire VS cellen

  1. Bereken het gewenste genoomgetal (gc) nummer en veelheid van infectie (MOI) die nodig zijn voor het voorgestelde transductie experiment met behulp van de virale voorraadconcentratie als referentie; Virusvoorraad kan rechtstreeks verdund worden in het aangevulde kweekmedium.
    OPMERKING: Elke virale vector die geschikt is voor primaire celtransductie kan gebruikt worden; Zie Landegger et al. (2017) voor een gedetailleerde vergelijking van zes verschillende adeno-geassocieerde virusserotypes 27 . Bovendien, bij het cultiveren van primaire menselijke cellen worden celltellingen niet typerend bepaald voordat ze op de deklagen worden geplateerd. Primaire VS-cellen reageren niet goed op trypsinisatie en passaging, dus voor een betrouwbare MOI-berekening kan het aantal aanhechtende cellen per putje worden geschat met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Als alternatief, als cellen dicht bij elkaar zijn, kunnen hun aantallen betrouwbaar worden geschat door gebruik te maken van standaard celdichtheidswaarden voorEen 24-putjesplaat ( bijv. 5 x 10 4 cellen per putje).
  2. Bereid onder een laminaire stromende afzuigkap aangevuld medium dat de gewenste hoeveelheid virus bevat in een 15 ml conische laboratoriumbuis, zodanig dat 1 ml virus bevattend medium bereid wordt voor elke bron van transducerende cellen. Pipet het virushoudende medium omhoog en omlaag om zachtjes maar grondig te mengen.
  3. Gebruik steriele tangen om de deklagen die primaire VS-cellen bevatten (stap 5.2.8) van de originele 24-putjesplaat naar een nieuwe 24-putjesplaat over te brengen. Na de overdracht van elke individuele deklaag, voeg 1 ml virushoudend medium toe. Wissel de plaat elke keer als het medium wordt toegevoegd om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig met het virus worden gecoat.
  4. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende de duur van het geplande experiment.
    OPMERKING: Incubaties variërend van 48 tot 120 uur hebben allemaal veelbelovende transductieresultaten getoond 27 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Primaire menselijke VS-cellen in cultuur, zoals vastgesteld in sectie 5, kunnen in veel downstream-onderzoeksaanvragen als informatieve modellen voor ziekteverwante processen worden behandeld ( Figuur 1 ). Gezonde Schwann-cellen die in sectie 6 zijn gekweekt, geven een direct en leerzaam vergelijkingspunt. Zoals hieronder uiteengezet, zijn uitgebreide gegevens van VS's en GAN's verwerkt volgens dit verenigde methodologische kader beschikbaar in meerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript beschrijft een verenigd methodologisch kader voor VS-onderzoek, waarin de gelijktijdige verwerking van menselijke VS- en GAN-monsters wordt beschreven voor downstream onderzoeksoepassingen. Aangezien VS-onderzoek de leeftijd van precisie geneeskunde oplevert, kan het opstellen van hetzelfde monster in formulieren die veel onderzoeksvragen kunnen beantwoorden, de detectie van moleculaire, cellulaire, genetische en proteomische inzichten die specifiek zijn voor individuele patiënten, mogelijk maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Nationale Instituut voor Doofheid en andere communicatiestoornissen, subsidies R01DC015824 (KMS) en T32DC00038 (ondersteunend JES en SD), het ministerie van Defensie-subsidie ​​W81XWH-14-1-0091 (KMS), de Bertarelli Foundation (KMS) , De Stichting Nancy Sayles Day (KMS), het Lauder Tinnitus Research Center (KMS) en de Barnes Foundation (KMS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass CoverslipCorning354087Of bereid coverslips met Corning Laminin (CB-40232) en Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mmGreiner Bio-One628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filteredSigma-AldrichC1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, SterileCorning3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 Forceps, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoclaveer voor gebruik
Dumont #5 Forceps, Standard tip, InoxFine Science Tools11251-20Autoclaveer voor gebruik
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot in 50 mL buizen en bewaar in -20°C vriezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized PowderSigma-AldrichH3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterieleEMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, CrystallineSigma-AldrichP6148Voor gebruik: stel standaard werkprocedures in op basis van protocollen die online beschikbaar zijn
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023Autoclaveer voor gebruik
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP Fosfatase Inhibitor TabletsRoche04906845001
Pierce Protease Inhibitor TabletsThermo Fisher Scientific88666
Pipetten en pipettentips, 5/10/25 mLVariabelVariabel
Plastic Homogenization Pestel voor 1,5/2,0 mL MicrotubesE&K ScientificEK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 inBD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (RNA stabilisatieoplossing)Thermo Fisher ScientificAM7021
Safe-Lock Microcentrifugebuizen, Polypropylene, 0,5 mLEppendorf022363719Autoclaveer voor gebruik
Safe-Lock Microcentrifugebuizen, Polypropylene, 1,5 mLEppendorf022363204Autoclaveer voor gebruik
Saline - 0,9% Natriumchloride Injectie, bacteriostatic, 20 mLHospira0409-1966-05
Scalpel Blades - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gaugeBausch & LombN1698 42Bruikbaar voor de chirurgische benadering (naast gangbare otologische chirurgische instrumenten) en bijv. een blauwe chirurgische marker
Specimen Container, OR steriele, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C Stereo MicroscopeZeiss000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in.BD309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mLBD309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mLBD309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probeCole-ParmerCP25013

Referenties

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215(2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Schwanncellenprimaire celkweekverzameling van tumorscheidingenRNA preserveringprote ne extractieweefselfixatieadeno geassocieerd virustranslabyrinthine benaderingcelkweekprotocol
Een Unified Methodological Framework voor Vestibular Schwannoma Research
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.