Methodenartikel

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/55836

⸱

3 juni 2017

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA interacties is van cruciaal belang voor het begrijpen van genregulatie, chromatin remodeling en andere chromatin-residente processen. Formaldehyde verknoping gevolgd door chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) is gebruikt om veel waardevolle inzicht in genoombiologie te verkrijgen. X-ChIP-seq heeft echter opvallende beperkingen verbonden aan crosslinking en sonication. Inheemse ChIP vermijdt deze nadelen door crosslinking weg te nemen, maar resulteert vaak in slecht herstel van chromatine gebonden eiwitten. Bovendien zijn alle ChIP-gebaseerde methoden onderworpen aan antilichaamkwaliteit overwegingen. Enzymatische methoden voor het mappen van eiwit-DNA-interacties, waarbij fusie van een eiwit van belang is voor een DNA-modificerend enzym, is ook gebruikt om eiwit-DNA-interacties te coderen. We hebben onlangs een dergelijke methode gecombineerd, chromatine endogene cleavage (ChEC), met high-throughput sequencing als ChEC-seq. ChEC-seq berust op fusie van een chromatine-assocGeïncentreerd eiwit van belang voor micrococculaire nuclease (MNase) om gerichte DNA-splitsing te genereren in aanwezigheid van calcium in levende cellen. ChEC-seq is niet gebaseerd op immunoprecipitatie en vermijdt zo mogelijke problemen met crosslinking, sonicatie, chromatinoplossing en antilichaamkwaliteit, terwijl het een hoge resolutie mapping biedt met minimaal achtergrondsignaal. We zijn van mening dat ChEC-seq een krachtige tegenpartij bij ChIP zal zijn, waardoor een onafhankelijke methode wordt verkregen om beide bevindingen van ChIP-seq te valideren en nieuwe inzichten te ontdekken in genomische regulering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mapping van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren (TF's), chromatine remodelers en andere chromatin-geassocieerde regulerende factoren is de sleutel tot het begrijpen van alle chromatin gebaseerde processen. Terwijl chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (ChIP-seq) benaderingen zijn gebruikt om veel belangrijke inzichten in genoombiologie te krijgen, hebben ze opmerkelijke beperkingen. Wij hebben onlangs een alternatieve methode geïntroduceerd, genaamd chromatin endogene splitsing en high-throughput sequencing (ChEC-seq) 1 , om deze nadelen te omzeilen.

ChIP-seq wordt meestal uitgevoerd met een initiële formaldehyde verknopingstap (X-ChIP-seq) om eiwit-DNA-interacties te behouden. Een aantal recente studies hebben echter aangetoond dat X-ChIP-seq transiënte of niet-specifieke eiwit-DNA-interacties vastlegt 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , die aanleiding geven tot valse positieve bindingsplaatsen. Bovendien, sonicatie, die gewoonlijk wordt gebruikt om fragmentin te fragmenteren in X-ChIP-seq experimenten, bij voorkeur schaarstreken van open chromatine, wat resulteert in voorspannen herstel van fragmenten uit deze gebieden 9 , 10 . Sonicatie levert ook een heterogeen mengsel van fragmentlengtes op, waardoor de bindingsplaatsresolutie uiteindelijk wordt beperkt, hoewel de toevoeging van een exonuclease-verteringstap de resolutie 11 , 12 aanzienlijk kan verbeteren. Inheemse ChIP-methoden zoals bezette gebieden van genen uit affiniteitszuiverde natuurlijk geïsoleerde chromatine (ORGANISCHE) 13 gebruiken geen verknoping en fragmentchromatine met micrococculaire nuclease (MNase), waardoor potentiële vooroordelen worden geassocieerd met formaldehydeverknoping en sonicatie. Echter,De oplosbaarheid van veel chromatine gebonden eiwitten onder de relatief milde omstandigheden die nodig zijn voor natieve chromatine extractie is slecht, wat mogelijk leidt tot verminderde dynamische bereik en / of valse negatieven 14 .

Hoewel verschillende iteraties van ChIP-seq meestal worden gebruikt voor genoom-brede mapping van eiwit-DNA-interacties, zijn ook verschillende mappingstechnieken gebaseerd op fusie van eiwitten van belang voor diverse DNA-modificerende enzymen geïmplementeerd. Een dergelijke benadering is DNA-adenine-methyltransferase-identificatie (DamID) 15 , waarbij een chromatine-bindend eiwit van belang genetisch gesmolten is met Dam en deze fusie wordt uitgedrukt in cellen of dieren, resulterend in methylering van GATC sequenties proximaal voor bindingsplaatsen voor het eiwit. DamID is voordelig doordat het niet staat op immunoprecipitatie en vermijdt dus verknoping, antilichamen of chromatinoplosbaarheid. Het wordt ook in vivo uitgevoerd. Echter, De resolutie van DamID is beperkt tot de kilobase-schaal en de methyleringsactiviteit van het Dam-fusie-eiwit is constitutief. Een tweede methode op basis van enzymatische fusie is Calling Card-seq 16 , waarbij fusie van een factor van belang is voor een transposase, waarbij site-specifieke integratie van transposons wordt aangestuurd. Net als DamID is Calling Card-seq niet gebaseerd op immunoprecipitatie en heeft derhalve dezelfde voordelen, met als extra voordeel van een verhoogde resolutie. Calling Card-seq kan echter worden beperkt door sequentieverzettingen van transposases en is ook afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen nabij transposon-insertieplaatsen.

Een derde enzymatische fusie methode, ontwikkeld in het Laemmli lab, is chromatine endogene splitsing (ChEC) 17 . In ChEC wordt een fusie tussen een chromatine geassocieerd eiwit en MNase uitgedrukt in cellen, en na calciumtoevoeging om MNase te activeren, wordt DNA proximaal gesplitst aan bindingsplaatsen voor de getagdeFactor ( figuur 1 ). In combinatie met Southern Blotting is ChEC gebruikt om chromatinstructuur en eiwitbinding op een aantal individuele loci in gist 17 , 18 te karakteriseren en is gecombineerd met microarrayanalyse met lage resolutie om de interactie van kernpompcomponenten met de gist te onderzoeken Genoom 19 . ChEC biedt voordelen die vergelijkbaar zijn met DamID en Calling Card-seq, en de resolutie is bijna enkelbasispaar wanneer geanalyseerd door primeruitbreiding 19 . ChEC is ook controleerbaar: robuuste DNA-splitsing door MNase hangt af van de toevoeging van millimolair calcium, zodat MNase inactief is bij de lage vrije calciumconcentraties waargenomen in levende gistcellen 20 .

Voorheen hebben we gepostuleerd dat het combineren van ChEC met high-throughput sequencing (ChEC-seq) high-resolution kaarten van TF bindingsplaatsen zou verschaffen. Inderdaad, ChEC-seq gegenereerde kaarten met hoge resolutie van de ontluikende gistregulatieve factoren (GRF's) Abf1, Rap1 en Reb1 over het genoom 1 . We hebben ook succesvol ChEC-seq toegepast op het modulaire Mediator-complex, een geconserveerde, essentiële, globale transcriptiecoactivator 21 , die de toepasbaarheid van ChEC-seq uitbreidt naar megadalton-complexen die niet direct contact met DNA hebben en moeilijk kunnen zijn om te plotten door ChIP- Gebaseerde methoden. ChEC-seq is een krachtige methode, zowel voor de onafhankelijke validatie van ChIP-seq-resultaten en het genereren van nieuwe inzichten in de regeling van chromatin-residente processen. Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor de implementatie van deze methode in ontluikende gist.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van giststammen

  1. Genereer een giststam die de factor van interesse met MNase draagt.
    1. PCR amplificeer de MNase-merkcassette van de gewenste vector ( Tabel 1 ) onder gebruikmaking van het gespecificeerde reactiemengsel ( Tabel 2 ) en cyclische condities ( Tabel 3 ). Meng 5 μl van de PCR-reactie en 1 μl 6X DNA-laadkleuring. Run elke PCR-aliquot op een 0,8% agarosegel bij 120 V gedurende 40 minuten. De verwachte productgrootte is ~ 2,3 kb.
    2. Transformeer de geamplificeerde tagcassette naar keuze door gebruik te maken van standaard lithium acetaat transformatie 22 en selectie uit te voeren.
    3. Controleer de juiste integratie van de tagcassette met kolonie-PCR.
      1. Bereid het gespecificeerde reactiemengsel voor ( Tabel 4 ) voor het aantal te screenen kolonies. Blijf ijs totdat het nodig is.
      2. Kies een deel van elke kolonie als tesTed in de bodem van een PCR buis met behulp van een steriele tandenstoker of pipet tip.
      3. Magnetron de geplukte kolonies bij een hoge stroom gedurende 1 minuut.
      4. Voeg 50 μl PCR mengsel ( Tabel 4 ) toe aan elke microwaved kolonie en pipet omhoog en omlaag om te mengen. Voer PCR uit met de opgegeven fietsomstandigheden ( tabel 5 ).
      5. Meng de 50 μl PCR-reactie en 10 μl 6X DNA laadkleuren direct in elke PCR-buis. Run 10 μl van elk monster op een 1% agarosegel bij 120 V gedurende 40 minuten. De verwachte productgrootte is ~ 700 bp.
        OPMERKING: Controleer desgewenst de juiste expressie van het MNase-fusie-eiwit via western blotting. A ~ 20,6 kilodalton verschuiving in het molecuulgewicht van het getekende eiwit wordt verwacht.
  2. Genereer een vrije MNase stam door homologie gebaseerde kloning van de promoter van het gen van belang in pGZ136 (Tabel 1) en transformatie en selectie zoals in stap 1.1.2.
    1. AlternatiVoeg de promotor van het gen van belang en 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in een plasmide vector samen, transformeer en selecteer zoals in stap 1.1.2 en groei de stam in de geschikte selectieve conditie voor het behoud van het plasmide.

2. Chec

  1. In de middag / avond van de dag voorafgaand aan het ChEC experiment, inoculeer 3 ml gist-pepton-dextrose (YPD) of geschikt selectief medium met een enkele kolonie van de stam die de MNase-getagde factor draagt. Incubeer deze cultuur 's nachts (180 rpm schudden, 30 ° C).
  2. In de ochtend van de dag van het ChEC-experiment verdun de nachtcultuur in 50 ml medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600 ) van 0,2-0,3. Incubeer deze cultuur (180 rpm schudden, 30 ° C) totdat het een OD 600 bereikt van 0,5-0,7. Naarmate de cultuur de geschikte OD 600 nadert, zet het warmteblok of het waterbad op tot 30 ° C en start het ontdooien van Buffer A-additieven ( TaBle 6).
  3. Bereid 5 ml Buffer A plus additieven ( Tabel 6 ) per cultuur op. Hou buffer A bij RT tijdens de procedure.
  4. Maak microfugebuizen met 90 μL stopoplossing ( Tabel 7 ) en 10 μl 10% SDS voor elk tijdstip dat moet worden verzameld. Voor elke nieuwe factor geanalyseerd, neem monsters op 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min en 10 min.
  5. Decant cultuur in een 50 ml conische buis en centrifuge bij 1.500 xg en kamertemperatuur (RT) gedurende 1 min.
  6. Resusteer cellen grondig in 1 ml Buffer A en verplaats de geresuspendeerde cellen naar een microfuge buis. Pellet geresuspendeerde cellen in een microfuge bij 1.500 xg en RT gedurende 30 s.
  7. Aspirateer supernatant en doe de cellen grondig opnieuw in 1 ml Buffer A door pipettering omhoog en omlaag. Pellet geresuspendeerde cellen in een microfuge bij 1.500 xg en RT gedurende 30 s. Herhaal deze stap een keer.
  8. Resusteer cellen grondig in 570 μl buffer A. Voeg 30 μL 2% digitonine toe(0,1% uiteindelijke concentratie) om de permeabilisatie van de cellen te vergemakkelijken en om te mengen.
  9. Permeabiliseer cellen in warmteblok of waterbad bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
  10. Pipet de reactie omhoog en omlaag om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen te waarborgen. Verwijder een 100 μL aliquot van doorlaatbare cellen als een negatieve controle op een microfusie buis bevattende stopoplossing en SDS (stap 2.4) en vortex kort om te mengen.
  11. Voeg 1,1 μl 1 M CaCl2 (2 mM uiteindelijke concentratie) toe aan permeabiliseerde cellen om MNase te activeren en versnelde een paar keer snel of vortex om te mengen. Retourneer de gemengde reactie onmiddellijk bij 30 ° C en start een timer.
  12. Op elke tijdstip die moet worden verzameld, pipet de reactie omhoog en omlaag om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen te waarborgen, verwijder vervolgens een 100 μL aliquot door permeabiliseerde cellen naar een microfusiebuis met stopoplossing en SDS en vortex kort om te mengen. Voor elke nieuwe factor geanalyseerd, neem 0 s (geen CaCl 2 toegevoegd), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min en 10 min tijdspunten.
    OPMERKING: ChEC-experimenten met factoren die DNA snel bij 30 ° C splitsen kunnen bij lagere temperaturen worden uitgevoerd om de MNase-splitsingskinetica te vertragen.
  13. Zodra alle tijdspunten zijn verzameld, voeg 4 μL 20 mg / ml protease K toe aan elk monster, vortex kort om te mengen en incubeer bij 55 ° C gedurende 30 minuten.
  14. Voeg 200 μL 25: 24: 1 fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elk monster, vortex krachtig te mengen en centrifugeer bij maximale snelheid en RT in een microfuge gedurende 5 minuten.
  15. Verwijder elke waterfase (~ 150 μL) naar een nieuwe buis. Voeg 30 μg glycogeen en 500 μl 100% ethanol toe. Vortex krachtig te mengen en neerslaan op droog ijs gedurende 10 minuten of tot oplossing is viskeus.
  16. Pellet neergeslagen DNA bij maximale snelheid en 4 ° C in een microfuge gedurende 10 minuten.
  17. Decant supernatanten en waspellets met 1 ml RT 70% ethanol.
  18. Decant ethanol, verwijder de rest door een omkeren van eenD tik de buizen voorzichtig op een papierdoek aan. Spoel de monsters kort in een centrifuge en gebruik een pipet om resterende ethanol te verwijderen, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Luchtdroge pellets voor 5 minuten bij RT.
  19. Terwijl de pellets drogen, maak een master mix om gedroogde pellets opnieuw te suspenderen in 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL van 10 mg / mL RNase A elk. Digest RNA bij 37 ° C gedurende 20 min.
  20. Meng 1 μl 6X DNA laadkleuring met 5 μl van elk monster en laat deze gedurende 40 minuten op een 1,5% agarosegel lopen bij 120 V.

3. Grootte selectie

OPMERKING: Het doel van de grootte selectie is het verwijderen van multi-kilobase fragmenten van genomisch DNA uit het monster dat wordt gehersequentieerd en verrijkt fragmenten van ~ 150 bp (ongeveer de grootte van nucleosomale DNA) of kleiner. Bij sequentiegegevens worden fragmenten <400 bp verrijkt, met een opmerkelijke piek rond de grootte van nucleosomaal DNA (~ 150 bp) en een piek of brede verdeling van subnucleosomale fragmenten.

  1. Aan elk monster toevoegen 75 μL vaste-fase reversibele immobilisatie (SPRI) kralen in een polyethyleenglycol (PEG) oplossing 23 en pipet 10 keer omhoog en omlaag om te mengen. Incubeer de kraal: DNA-mengsel bij RT gedurende 5 minuten.
  2. Tijdens de incubatie van SPRI-kraal, bereiden microfugebuizen die 96 μl van 10 mM Tris, pH 8,0 en 4 μl van 5 M NaCl voor elk monster bevatten.
  3. Plaats buizen in een magnetisch rek om kralen aan de zijkant van de buis te verzamelen. Laat de kralen gedurende 2 minuten aan de zijkant van de buis verzamelen.
  4. Breng elke supernatant over naar een nieuwe buis die Tris en NaCl bevat (stap 3.2).
  5. Voeg 200 μL 25: 24: 1 fenol: chloroform: isoamylalcohol toe aan elk monster, vortex om te mengen en centrifugeer bij maximale snelheid en RT in een microfuge gedurende 5 minuten.
  6. Verwijder elke waterfase naar een nieuwe buis. Voeg 30 μg glycogeen en 500 μl 100% ethanol toe. Neerslaan DNA op droog ijs gedurende 10 minuten of tot oplossing is visceus.
  7. Pellet preciPitated DNA bij maximale snelheid en 4 ° C in een microfuge gedurende 10 minuten.
  8. Decant supernatanten en waspellets met 1 ml 70% ethanol.
  9. Decant ethanol, verwijder de rest door het omkeren en voorzichtig aan de buizen op een papieren handdoek te tikken. Spoel de monsters kort in een centrifuge en gebruik een pipet om resterende ethanol te verwijderen, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Luchtdroge pellets voor 5 minuten bij RT.
  10. Resuspendeer gedroogde pellets in 25 μl Tris, pH 8,0. Bepaal de monsterconcentratie met behulp van een analyse met een hoge gevoeligheid. Voor TF ChEC experimenten wordt 10-100 ng DNA routinematig hersteld na grootte selectie.
  11. Bereid sequencing bibliotheken op. Bibliotheekbereidingsprotocollen die niet afhankelijk zijn van grootteselectie, zoals eerder beschreven 24 , zijn gewenst om sequentiebepaling van een groot bereik van fragmentgroottes (25-500 bp) toe te staan.
  12. Sequentiebibliotheken in de gekoppelde modus. Een minimum van 25 bases sequentie aan elk uiteinde is nodig voor het lezen van hoge kwaliteitin kaart brengen. Tussen 1 en 2 miljoen lezingen biedt voldoende dekking voor een ChEC-monster.
    OPMERKING: Analyse van ChEC-seq data is een complexe procedure en buiten het bereik van dit artikel. Gedetailleerde informatie over data analyse is te vinden in eerdere publicaties 1 , 21 en de aangepaste scripts die worden gebruikt voor analyse zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kan ook worden gebruikt voor command-line analyse van ChEC-seq data.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het geval van een succesvol ChEC-experiment, zal analyse van DNA door agarosegel-elektroforese een calciumafhankelijke toename in DNA-fragmentatie over de tijd onthullen, zoals aangegeven door het uitknippen en eventueel volledige vertering van genomisch DNA. In sommige gevallen wordt een ladder van banden vergelijkbaar met die gezien met een traditionele MNase-spijsvertering waargenomen na uitgebreide spijsvertering. Dit is het geval voor ChEC analyse van Reb1, een algemene reguleren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben aangetoond dat ChEC diverse klassen gistproteïnen op chromatine kan plassen en anticiperen dat het in grote mate van toepassing zal zijn op verschillende families van TF's en andere chromatine-bindende factoren in gist. ChEC-seq is voordelig doordat het geen crosslinking, chromatinoplosbaarheid of antilichamen vereist. Zo vermijdt ChEC artefacten die mogelijk aanwezig zijn in X-ChIP-seq, zoals het hyper-ChIPable artefact 3 , 4 en native ChIP, zoals...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Moustafa Saleh en Jay Tourigny voor kritische lezing van het manuscript en Steven Hahn en Steven Henikoff voor mentor en ondersteuning tijdens de ontwikkeling van ChEC-seq en de toepassing ervan op het Mediatorcomplex. SG wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM053451 en R01GM075114 en GEZ wordt ondersteund door Indiana University startup funds.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
dNTPsNEBN0447
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LAndere high-fidelity DNA polymerases, zoals Phusion, kunnen worden gebruikt voor cassette-amplificatie.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymeraseNEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001Het is belangrijk dat een EDTA-vrije protease inhibitor mix wordt gebruikt, om MNase-splitsing door chelatie van Ca2+ niet te remmen.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMaak een 2% stock door 20 mg digitonin op te lossen in 1 mL DMSO met krachtig vortexen.
Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-achtige kralen kunnen worden gemaakt met behulp van een gepubliceerd protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
  2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
  3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).
  5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
  6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
  7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
  8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412(2014).
  9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).
  10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).
  11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
  13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
  14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042(2014).
  15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
  16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
  17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
  19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
  20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
  21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
  22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
  24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
  25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
  27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
  28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
  29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
  30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
  31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).
  32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
  34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
  36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Micrococcaal nucleasegistchromatinecalciumactivatieDNA splitsingSPRI beadsfenol chloroformagarosegel

Gerelateerde artikelen