Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Summary

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Abstract

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA interacties is van cruciaal belang voor het begrijpen van genregulatie, chromatin remodeling en andere chromatin-residente processen. Formaldehyde verknoping gevolgd door chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) is gebruikt om veel waardevolle inzicht in genoombiologie te verkrijgen. X-ChIP-seq heeft echter opvallende beperkingen verbonden aan crosslinking en sonication. Inheemse ChIP vermijdt deze nadelen door crosslinking weg te nemen, maar resulteert vaak in slecht herstel van chromatine gebonden eiwitten. Bovendien zijn alle ChIP-gebaseerde methoden onderworpen aan antilichaamkwaliteit overwegingen. Enzymatische methoden voor het mappen van eiwit-DNA-interacties, waarbij fusie van een eiwit van belang is voor een DNA-modificerend enzym, is ook gebruikt om eiwit-DNA-interacties te coderen. We hebben onlangs een dergelijke methode gecombineerd, chromatine endogene cleavage (ChEC), met high-throughput sequencing als ChEC-seq. ChEC-seq berust op fusie van een chromatine-assocGeïncentreerd eiwit van belang voor micrococculaire nuclease (MNase) om gerichte DNA-splitsing te genereren in aanwezigheid van calcium in levende cellen. ChEC-seq is niet gebaseerd op immunoprecipitatie en vermijdt zo mogelijke problemen met crosslinking, sonicatie, chromatinoplossing en antilichaamkwaliteit, terwijl het een hoge resolutie mapping biedt met minimaal achtergrondsignaal. We zijn van mening dat ChEC-seq een krachtige tegenpartij bij ChIP zal zijn, waardoor een onafhankelijke methode wordt verkregen om beide bevindingen van ChIP-seq te valideren en nieuwe inzichten te ontdekken in genomische regulering.

Introduction

Mapping van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren (TF's), chromatine remodelers en andere chromatin-geassocieerde regulerende factoren is de sleutel tot het begrijpen van alle chromatin gebaseerde processen. Terwijl chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (ChIP-seq) benaderingen zijn gebruikt om veel belangrijke inzichten in genoombiologie te krijgen, hebben ze opmerkelijke beperkingen. Wij hebben onlangs een alternatieve methode geïntroduceerd, genaamd chromatin endogene splitsing en high-throughput sequencing (ChEC-seq) ¹ , om deze nadelen te omzeilen.

ChIP-seq wordt meestal uitgevo....

Protocol

1. Generatie van giststammen

1. Genereer een giststam die de factor van interesse met MNase draagt.
   1. PCR amplificeer de MNase-merkcassette van de gewenste vector ( Tabel 1 ) onder gebruikmaking van het gespecificeerde reactiemengsel ( Tabel 2 ) en cyclische condities ( Tabel 3 ). Meng 5 μl van de PCR-reactie en 1 μl 6X DNA-laadkleuring. Run elke PCR-aliquot op een 0,8% agarosegel bij 120 V gedurende 40 minuten. De verwachte productgrootte is ~ 2,3 kb.
   2. Transformeer de geamplificeerde tagcassette naar keuze door gebruik te maken van standaard lithium acetaat transformatie

Results

In het geval van een succesvol ChEC-experiment, zal analyse van DNA door agarosegel-elektroforese een calciumafhankelijke toename in DNA-fragmentatie over de tijd onthullen, zoals aangegeven door het uitknippen en eventueel volledige vertering van genomisch DNA. In sommige gevallen wordt een ladder van banden vergelijkbaar met die gezien met een traditionele MNase-spijsvertering waargenomen na uitgebreide spijsvertering. Dit is het geval voor ChEC analyse van Reb1, een algemene reguleren.......

Discussion

We hebben aangetoond dat ChEC diverse klassen gistproteïnen op chromatine kan plassen en anticiperen dat het in grote mate van toepassing zal zijn op verschillende families van TF's en andere chromatine-bindende factoren in gist. ChEC-seq is voordelig doordat het geen crosslinking, chromatinoplosbaarheid of antilichamen vereist. Zo vermijdt ChEC artefacten die mogelijk aanwezig zijn in X-ChIP-seq, zoals het hyper-ChIPable artefact ^{3 , 4} en native ChIP, zoals.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342