Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Subcutane Neurotrofine 4 Infusie Met Osmotische Pompen Of Directe Spierinjectie Verbetert Veroudering Rat Larynx Spieren

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55837

⸱

13 juni 2017

 ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren wij een protocol om het gebruik van neurotrophin 4 (NTF4) systematisch te beschrijven en rechtstreeks te remodellen larynxale spierveroudering.

Samenvatting

Larynxale dysfunctie bij ouderen is een belangrijke oorzaak van handicap, van stoornissen aan dysfagie en verlies van luchtweg beschermende reflexen. Er zijn weinig, indien aanwezig, therapieën die gericht zijn op leeftijdgerelateerde larynxale spierdisfunctie. Neurotrofinen zijn betrokken bij spierinervation en differentiatie van neuromusculaire kruispunten (NMJ's). Het is van mening dat neurotrofinen neuromusculaire transmissie versterken door de vrijlating van neurotransmitteren te verhogen. De neuromusculaire kruispunten (NMJ's) worden kleiner en minder overvloedig in verouderende larynxale spieren van de rat, met bewijs van functionele denervation. We hebben de effecten van NTF4 onderzocht voor toekomstig klinisch gebruik als therapeutisch voor het verbeteren van de functie bij het verouderen van menselijke larynxspieren. Hier geven we het gedetailleerde protocol voor systemische toepassing en directe injectie van NTF4 om het vermogen van veroudering van de rat larynxale spier te onderzoeken in verband met NTF4 applicatie. Bij deze methode kregen ratten ofwel systematisch via o NTF4Smotische pomp of door directe injectie door de vocale plooien. Larynxale spieren werden vervolgens gedissecteerd en gebruikt voor histologisch onderzoek naar morfologie en leeftijdverwante denervation.

Inleiding

Larynxale spieren trekken snel en consistent samen en zijn kwetsbaar voor de nadelige effecten van veroudering. Deze constante activiteit wordt geacht bij te dragen aan spraakproblemen of dysfagie waargenomen bij personen ouder dan 65 jaar 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Verscheidene moleculaire en pathofysiologische mechanismen dragen bij aan deze leeftijdgerelateerde disfunctie. Deze mechanismen kunnen remodellering van larynxmucosa, spiervezelatrofie of -verlies omvatten, gebrek aan regeneratie of atrofie van spiervezels, waardoor de vocale vouwen worden gebogen en de glottisluiting 8 , 9 , 10 , 11 niet mogelijk is . Er is geen bewezen medische therapie op dit moment dat kan comDeze leeftijdsgebonden veranderingen in deze spieren verbeteren of voorkomen.

Modulatie van de effectiviteit van neuromusculaire transmissie kan de neuromotorische prestaties sterk beïnvloeden. De familie van neurotrophins omvat zenuwgroeifactor (NGF), hersenverwante zenuwgroeifactor (BDNF), neurotrophine 3 (NTF3) en NTF4 12 , 13 . Neurotrofinen hebben aangetoond dat ze synaptische werkzaamheid 1 , 4 moduleren. Hepatocytgroeifactor, transformerende groeifactor bèta en fibroblastgroeifactor, is onlangs bij mensen gebruikt voor de behandeling van vocal fold scarring 15-17. NTF4 regelt ook de effectiviteit van de NMJ; Muizen die NTF4 ontbreken tonen gedemonteerde NMJ's 11 , 18 , 19 . Deze studies leiden tot veelbelovende effecten van behandelaarsT van veroudering van larynxale spierstoornissen en denervering met groeifactoren.

Directe injectie therapeutica aan de weefsels van de vocale vouwen zijn niet bij elkaar in de mens. Bijvoorbeeld worden lokale injecties van botulinum toxine momenteel gebruikt als een effectieve behandeling voor neurologische bewegingsstoornissen die de spieren in de larinks beïnvloeden, zoals spasmodische dysfonie en bilaterale herhalende larynxale zenuwverlamming 20 , 21 . Hyaluronzuurhydrogel is een ander injecteerbaar, dat gebruikt wordt om vocale vouwverschrikking en glottale insufficiëntie 22 , 23 te behandelen. Injectie laryngoplastie kan worden gebruikt om een ​​verscheidenheid aan communicatie stoornissen te behandelen 24 . Deze directe injectiemethoden houden belofte om de vocale functie te verbeteren en te slikken in verouderende populaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Gebruik mannelijke Fischer 344-Brown Noorse ratten op 6 en 30 maanden oud voor dit protocol. Ratten werden verkregen uit het National Institute of Aging knaagdierkolonie. Wij hebben ratten gebruikt voor deze studie omdat de structuur van de larynx van de rat gelijkwaardig is aan die van de mens, functioneel voor de bescherming van de luchtwegen en soortenspecifieke vocalisaties. Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met het PHS-beleid inzake humane zorg en gebruik van laboratoriumdieren, De NIH Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en de dierenwelzijnswet (7 USC et seq.); Het protocol voor diergebruik werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky.

1. verdoving van ratten

  1. Bereid de anesthetica door middel van ketaminehydrochloride (dissociatieve verdoving) en xylazinehydrochloride (verdovend en pijnstillend) in gebufferde zoutoplossing. De concentraties ketamine en xylazine in de uiteindelijke oplossing zijn 100 mg / 8 mg per kgLichaamsgewicht respectievelijk.
  2. Spuit de anesthetica in de rat door intraperitoneale toediening met behulp van een injectiespuit met een 25 G-naald.
  3. Bepaal dat de rat voldoende verdoofd is door de teen of de voet te knijpen met tang. Als de rat niet reageert op de knijp, dan kan de operatie beginnen. Als de rat op de teenknijp reageert met reflex of spiercontracties, wacht dan 1-2 minuten en herhaal de knijp test. Als de rat weer reageert, vervang de rat met een nieuw dier en herhaal de procedure vanaf stap 1.2.
  4. Breng oogheelkundige salf aan de ogen van de rat, nadat de rat onbeweeglijk is, om te voorkomen dat de hoornvlies uitdrogen.

2. Implantatie van osmotische pompen

  1. Plaats de rat ventrale op het aseptische chirurgische gebied. Meloxicam dient als preanesthetische medicatie te worden toegediend. Administreer intraperitoneaal bij een dosering van 1-4 mg / kg lichaamsgewicht met behulp van een injectiespuit met een 25 G-naald.
  2. Gebruik clippers om een ​​approxima te verwijderen1 x 1 "vierkante bont van de achterkant van de nek en ongeveer 1" caudale ruimte tussen schouders. Scheer zo dicht mogelijk bij de huid.
  3. Natte de rug en nek met desinfecterende ethanol (70%).
  4. Na het scheren, schrob het dorsale aspect van de nek met 3 scrubs in opvolging van de jodium-alcohol afwerking met alcohol.
  5. Handhaving van de lichaamstemperatuur van de rat door het op een verwarmingspaneel op te zetten op 34 ° C.
  6. Vul aseptisch bereide osmotische pompen met 50 μL NTF4 of zoutoplossing voor systemische NTF4-behandeling ( Figuur 1 ).
    1. Gebruik een scalpel om een ​​horizontale incisie ongeveer 2 cm breed door de huid te maken, gewoon kraniaal naar de ruimte tussen de scapulae. Houd de achterkant van de insnijding met de pincet met de ene hand terwijl u de punt van de hemostaten plaatst en voorzichtig naar de incisie duwt.
    2. Na het punt van de hemostaten is ongeveer 2 cm cRoteer naar de incisie, open de handgrepen op de hemostaten, uitbreiding van de tips om een ​​holle "zak" subcutaan te vormen naar de incisieplaats. Dit zal de plaats van de pomp zijn.
  7. Oriënteer het einde van de pompleveringsportaal eerst bij invoeging om elke interactie van de NTF4 en de genezing van de incisieplaats van de zak te minimaliseren.
  8. Lever 50 μL NTF4 zoutoplossing voor 7 dagen of 7 dagen. De 7 dagen groep kreeg 6,72 mg / dag NTF4 voor een totale dosis van 47,04 mg. De 14-daagse groep kreeg 6,72 mg / dag voor een totale dosis van 94,08 mg NTF4 25 .
  9. Gebruik 5-0 nylon hechtdraad, hemostaten en tang om de insnijding te maken die is gemaakt voor de plaatsing van de pomp.
  10. Let op de ratten gedurende minimaal 30 minuten, zoals ze terugvinden van verdoving. Criteria voor de voltooiing van de monitoring omvatten het dier actief worden, de kooi bewegen, drinkwater, en andere normale activiteiten beginnen, zoals grooming.
  11. Monitor dieren dagelijksVoor de eerste week door de genezing van de chirurgische plaats te waarnemen, normale voeding en waterverbruik en doorgang van urine / ontlasting en eventuele abnormale gedragstekenen van stress, pijn of andere postoperatieve complicaties.
  12. Als de rat lijkt te zijn in pijn of verdriet, geef de rat eenmaal per 24 uur een 5 mg / kg subcutane injectie van carprofen gedurende maximaal 5 dagen om pijn te verlichten.
  13. Als er een infectie lijkt te zijn, raadpleeg een dierenarts om ervoor te zorgen dat de wond goed geneest.
  14. Afhankelijk van welke experimentele groep de rat binnen komt, verwijder de 5-0 nylon hechting 7-10 dagen na de operatie om irritatie van de draad te voorkomen.

3. Verdoving van ratten voor directe injectie

  1. Onthoud voedsel van de ratten de nacht voor de procedure. Dit zorgt ervoor dat er geen voedsel is om de endoscoop of injectienaald te blokkeren.
  2. Weeg ratten en bereid acepromazine 1-2 mg / kg lichaamsgewicht. Injecteer intramusculaire (de IM locatie is deLinker thyroarytenoid spier).
  3. Plaats de rat in de inductiebox. Verdedig anesthesie in de inductiebox met 5% isofluraan en 1 LO 2 .
  4. Verplaats de rat naar een neuskegel met 2% isofluraan en 600 ml O2.
  5. Bepaal dat de rat voldoende verdoofd is door de teen of de voet te knijpen met tang. Als de rat niet reageert op de knijp, dan kan het injectieprotocol beginnen. Als de rat op de teenknijp reageert met reflex of spiercontracties, wacht dan 1-2 minuten en herhaal de knijp test. Als de rat weer reageert, vervang dan de rat met een nieuw dier en herhaal de procedure vanaf stap 3.4.

4. Directe injectie en visualisatie

  1. Plaats aseptisch voorbereide doseringen van 50 μl die NTF4 of zoutoplossing bevatten in een H2O-bad dat 30 minuten voor 25 minuten bij 25 ° C is ingesteld.
  2. Plaats de rat in een liggende en teruggetrokken positie op een plexiglasplatform ( Figuur 2 ). SusDraai de rat in de teruggetrokken houding van hun frontale bovenste incisors door een geleidingsdraad over de bovenkant van het platform.
  3. Bevestig een 50 mm, 30 gauge, 100 μL spuit aan een 1,9 mm, 30 ° sinus endoscoop ( Figuur 3 ).
    OPMERKING: De spuitmontage is bevestigd via een jig die de canule stevig vastzet aan de buitenwand van de endoscoop. De endoscoop maakt het mogelijk om de vocale vouwen en leiding van de injectiespuit intraoraal te visualiseren. De positie van de canulepunt wordt voor elk dier aangepast om ervoor te zorgen dat de punt volledig en duidelijk zichtbaar is via de endoscopische weergave ( Figuur 4 ).
  4. Gebruik een rubberen tippenstift om de tong te verlengen en lateraal te bewegen. Daarna, voeg een plastic speculum in om mondelinge patiënt te behouden. Maak de speculum van een 5 ml plastic spuitvat, dat is gesneden tot een lengte van 1,5 tot 2 cm, waarbij de gesneden randen afgebroken en glad gepolijst zijn.
  5. Schakel de lichten in de roo uitM en bevestig een halogeenlichtbron aan de endoscoop. Zet de videorecorder aan om de procedure vast te leggen.
  6. Dompel het distale uiteinde van de endoscoop gedurende enkele seconden in warm water om de ontwikkeling van condensatie op de glazen punt te minimaliseren wanneer deze in de mond van de rat wordt geplaatst.
  7. Met behulp van visuele feedback van de monitor, leid de naald voorzichtig naar het gebied van de linker vocale vouw.
  8. Tijd de injectie van de oplossing met de inspirerende fase van de ademhalingscyclus van de dieren om volledig toegang te krijgen tot de vocale vouw. Tijdens de inspirerende fase van ademhaling is de vocale vouw volledig blootgesteld.
    1. Zodra de vocale vouw volledig zichtbaar is, steek de naald in de linker thyroarytenoid, die lateraal wordt gevonden aan de witte middelste rand van de vocale vouw. Met de naald op zijn plaats, lever de injectie door middel van depressie van de spuit.
  9. Zet de halogeenlichtbron uit op de endoscoop en de videospeler, en draai de ro weer aanOm lichten.
  10. Keer de rat terug naar zijn huiskooi en plaats op een verwarmingskussen.
  11. Laat de rat terugvinden voor verwijdering vanaf het verwarmingspaneel. Vervang voedsel en water in de kooi.
  12. Monitor ratten gedurende 7 dagen na de injectie en vernietig daarna. Verwijder de larynges voor cryosectie 24 .

5. Euthanization of Rats

  1. Verdoof ratten met ketaminehydrochloride en xylazinehydrochloride (100 mg / 8 mg per kg lichaamsgewicht geïnjecteerde intraperitoneale injectie).
  2. Euthanize door exsanguination na een mediale thoracotomie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De ratten werden geëuthaniseerd na 2 weken osmotische pompinfectie of 1 week na directe injectie van NTF4. Larynges werden geoogst, geplaatst in cryoprotectant (30% sucrose en 70% fosfaat gebufferde zoutoplossing) en vervolgens serieel gesneden in 10 μm breedten met een cryostat. Veroudering van larynxale spieren wordt beïnvloed door toediening van NTF4 25 . Naast de jonge en oude rat, vergeleken we de geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde kant van de thyroarytenoid...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Larynxale spieren zijn kwetsbaar voor de ongunstige effecten van veroudering. Vorige studies hebben aangetoond veranderingen in veroudering larynxale spieren die veranderingen in vezelgrootte, totaal aantal vezels, regeneratief vermogen, NMJ grootte en hoeveelheid veranderingen omvatten, naast variaties in contractiele functie en myosine isoform verschuivingen 4 , 11 , 27 , 30 ,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Doofheid en Andere Communicatie Stoornissen (R21DC010806 naar CAM en JCS en R01DC011285 naar CAM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neurotrophin 4Pepro Tech450-04200 ng in 50 μL
Alzet Osmotic PumpDURECT Corporation2001D
30 ° endoscopeStoltz61029D
50 mm 30 gauge 100-μL syringeHamilton84850 and 201812
saline (sodium chloride solution)Sigma-AldrichS8776
ketamine hydrochlorideHenry Schein56344
xylazine hydrochlorideHenry Schein33198
25 G 5/8 needleBecton-Dickinson305901
1 mL syringeBecton-Dickinson309659
ophthalmic ointmentHenry Schein8897
clippersOster44-018
ethanolDecon2716
iodine (Betadine)Purdue Pharma L.P.606404
heating padSunbeam731-5
5-0 nylon suture threadAD SurgicalPMN-518R6
crile hemostatFine Science Tools13005-14
delicate suture tying forcepsFine Science Tools11063-07
meloxicamHenry Schein49756
carprofenMerritt Veterinary Supplies148700
antibiotic ointmentHenry Schein57110
acepromizine AceprojectHenry Schein3845
isoflurane IsothesiaHenry Schein50033
induction box (anesthetizing box)Harvard Apparatus50-0116
oxygen compressed tankScott GrossUN1072
plexiglas platformSmall Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forcepsFine science tools rubber11075-00
liquid rubber for forceps aboveLowe's42518
plastic spectula (BD syringe cut to length)Becton-Dickinson309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscopeKay-PentaxRLS 9100 B
video recorderKay-Pentax
sucroseSigma-AldrichS0389-500G
phosphate buffered salineSigma-AldrichP4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525Thermo ScientificHM 525
Gill 1 hematoxylinVWR10143-142
Shandon eosin-Y alcoholicThermo Fisher Scientific6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbitSigma-AldrichS0819
Texas red-X phalloidinSigma-AldrichT7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugateThermo Fisher ScientificB-13422
Small animal anaesthesia machineSmiths MedicalCDS 9000

Referenties

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798(2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Implantatie van osmotische pomplarynxspier van verouderde ratteninjectie in de stembandhistologisch onderzoekanalyse van de neuromusculaire overgangmeting van vezelgroottebeoordeling van fibroseprotocol voor chirurgische procedure
Subcutane Neurotrofine 4 Infusie Met Osmotische Pompen Of Directe Spierinjectie Verbetert Veroudering Rat Larynx Spieren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.