Dit protocol beschrijft de implementatie van een asymmetrische detectie tijdstens optisch microscopiesysteem voor single-cell imaging in ultrafast microfluidische stroom en zijn toepassingen in beeldstroomcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microfluïdische Imaging Flow Cytometry door Asymmetrische Deteksie Time-stretch Optische Microscopie (ATOM)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het scaleren van het aantal meetbare parameters, waarmee multidimensionale data-analyse en daarmee hogere-vertrouwen statistische resultaten mogelijk zijn, is de belangrijkste trend in de geavanceerde ontwikkeling van flowcytometrie. Met name, het toevoegen van hoge resolutie beeldvorming mogelijkheden staat voor de complexe morfologische analyse van cellulaire / subcellulaire structuren. Dit is niet mogelijk met standaard flow cytometers. Het is echter waardevol voor het bevorderen van onze kennis van cellulaire functies en kan profiteren van wetenschappelijk onderzoek, klinische diagnostiek en milieu-monitoring. Het integreren van beeldcapaciteit in flowcytometrie maakt een compromis voor de analyse, vooral door de beperkingen op snelheid en gevoeligheid in de camera technologieën. Om deze snelheid of doorstroomuitdaging tegen beeldstroomcytometrie tegen te gaan terwijl de beeldkwaliteit wordt behouden, is de asymmetrische detectie-tijdoptische optische microscopie (ATOM) aangetoond om in hoge resolutie, single-cell imagMet een subcellulaire resolutie, bij een beeldvormende doorvoer zo hoog als 100.000 cellen / s. Op basis van het beeldvormende concept van conventionele time-stretch imaging, die afhankelijk is van all-optical image encoding en retrieval door het gebruik van ultrafast breedband laser pulsen, bevordert ATOM de beeldprestatie verder door het beeldcontrast van ongemerkt / niet-gestikte cellen te verbeteren. Dit wordt bereikt door toegang te krijgen tot de fase-gradiëntinformatie van de cellen, die spectraal gecodeerd wordt in single-shot breedbandpulsen. Bijgevolg is ATOM bijzonder gunstig in metingen met een hoge doorvoer van single-cell morfologie en textuurinformatie die indicatief is voor celtypes, staten en zelfs functies. Uiteindelijk zou dit een krachtig beeldvormend flow cytometry platform kunnen worden voor de biofysische fenotypering van cellen, die de huidige state-of-the-art biochemische markering gebaseerde cellulaire test aanvullen. Dit werk beschrijft een protocol om de sleutelmodules van een ATOM-systeem vast te stellen (van optische frontend naar data pRocessing en visualisatie backend), evenals de workflow van beeldstroom-cytometrie gebaseerd op ATOM, met behulp van menselijke cellen en microalgen als voorbeelden.
Inleiding
Optische beeldvorming presenteert een krachtige tool en cel gebaseerde analyse om (bijna) niet-invasieve de gedetailleerde ruimtelijke verdeling van veel cellulaire / subcellulaire componenten te visualiseren, waardoor een groot aantal morfologische, biofysische en biomoleculaire signaturen van cellen wordt ontdekt. Deze mogelijkheid om high-content informatie uit enkele cellen te verzamelen is echter in het algemeen gecompromitteerd wanneer een enorme en heterogene celcellen onderzocht moesten worden. Dit markeert een gemeenschappelijke afweging in celanalyses tussen meting doorvoer en inhoud. Een opvallend voorbeeld is dat het toevoegen van beeldcapaciteit om de cy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbeeld Bereiding
- Proefbereiding (hechtende cellen; MCF-7 cellen)
- Neem de celcultuurschotel uit de incubator en laat het kweekmedium af.
- Spoel de cellen op een schotel met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om excessief kweekmedium te verwijderen.
- Voeg 3 ml van een oplossing van 0,25% trypsine toe aan de kweekschotel (diameter 100 mm) en zet deze gedurende 4 minuten in een 37 ° C, 5% C02 incubator.
OPMERKING: De trypsine lost het lijmproteïne van de cellen op, zodat ze loskomen van de kweekschotel. - Controleer of alle cellen losgemaakt zijn van de cultuurschotel met behulp van een lic....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit werk illustreert twee demonstraties met één cel van ATOM: één met zoogdiercellen (humane perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) en borstkankercellen (MCF-7)) en een ander met phytoplankton s (Scenedesmus en Chlamydomonas). Het eerste experiment werd gemotiveerd door de groeiende belangstelling voor vloeibare biopsie voor het detecteren, opnemen en karakteriseren van circulerende tumorcellen (CTC's) in het bloed 23 . De mogelijkhei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende technische details die speciale aandacht behoeven tijdens de installatie van het ATOM-systeem. Ten eerste is het essentieel om op te merken dat asymmetrische / schuine spectraal gecodeerde verlichting residuele fase-gradiëntcomponenten ( dwz het schaduw effect) in het absorptiecontrast kan introduceren en de versterking van fase-gradiëntcontrast in ATOM kunnen beïnvloeden. Daarom moet dit effect van schuine verlichting worden geminimaliseerd. In de tweede plaats moet worden benadrukt dat d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de heer P. Yeung voor het voorbereiden van de MCF-7 voor ons. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Research Grant Council van de speciale administratie regio Hongkong, China (Project nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 en HKU 720112E), het innovatie- en technologieondersteuningsprogramma (ITS / 090/14 ) En het Universiteits Ontwikkelingsfonds van HKU.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objectieflens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objectieflens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | Voor het doorleiden van spectraal licht |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | Voor het uitzenden en verzamelen van laserpulsen |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | Voor het maken van een straalreplica |
| Beschermde zilveren spiegel | Thorlabs | PF10-03-P01 | Voor het reflecteren van licht |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | Voor het omzetten van licht in een elektrisch signaal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | Om de licht-geconverteerde elektrische signalen op te slaan |
| HI1060 optische vezel | Corning | HI1060 | Optische vezel voor time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optische in-line versterker |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Raster |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Spuitpomp voor het laden van monsters in microfluïdische kanalen |
Referenties
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic ph....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
