Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

Summary

We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.

Abstract

Cellulaire processen zijn complex en voortvloeien uit het interactie tussen meerdere celtypes en hun omgeving. Bestaande celbiologie technieken staan ​​vaak niet toe voor een nauwkeurige interpretatie van dit interactie. Met behulp van een kwantitatieve beeldvormende aanpak presenteren wij een protocol met een hoog gehalte voor het karakteriseren van de dynamische fenotypische responsen ( dwz morfologische veranderingen, proliferatie, apoptose) van heterogene celpopulaties voor veranderingen in milieu-stimuli. We benadrukken ons vermogen om onderscheid te maken tussen celtypes, gebaseerd op fluorescentieintensiteit of inherente morfologische eigenschappen, afhankelijk van de toepassing. Dit platform zorgt voor een meer uitgebreide karakterisering van subpopulatie respons op verstoring, terwijl kortere tijd, kleinere hoeveelheden reagentia, en lagere kans op fout dan traditionele celbiologie analyses gebruikt worden. In sommige gevallen kan celpopulaties echter moeilijk zijn te identificeren en te kwantificeren op basis van complexe celluLar functies en vereist extra probleemoplossing; We onderstrepen enkele van deze omstandigheden in het protocol. We tonen deze applicatie aan met behulp van reactie op drugs in een kankermodel; Het kan echter makkelijker toegepast worden op andere fysiologische processen. Dit protocol maakt het mogelijk om subpopulaties binnen een co-cultuur systeem te identificeren en de specifieke respons van elk naar externe stimuli te karakteriseren.

Introduction

Cell-based tests zijn een werkhorse in basisonderzoek en drug ontwikkeling instellingen. De beperkingen van deze standaardbepalingen zijn echter steeds meer zichtbaar met de discordantie tussen in vitro en klinische data en het mislukken van de meeste geneesmiddelen om FDA-goedkeuring te ontvangen. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het gebruik van kwantitatieve beeldvorming om tegelijkertijd heterocellulaire fenotypes te analyseren in reactie op relevante, samen voorkomende milieu-stimuli.

Traditionele cellen gebaseerde assays die worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten omvatten: trypan blue exclusion assays, MTT / MTS en Annexin V-FITC flow cytometry staining. Trypan Blue Exclusion Assays, die eenvoudig en goedkoop zijn, hebben een groot aantal cellen nodig, zijn tijdrovend en worden vaak beïnvloed door gebruikers vooroordeel ¹ . MTT- en MTS-analyses bepalen indirect de levensvatbaarheid van cellen door metingen van mitochondriale metabolische snelheid. Echter, de metabolische activiTijden van cellen kunnen beïnvloed worden door verschillende kweekomstandigheden (zoals media of zuurstofconcentratie), wat leidt tot onnauwkeurige resultaten en voorkomt normalisatie over celtypen en condities ^{2 , 3} . Een ander belangrijk nadeel van deze technieken is hun onvermogen om onderscheid te maken tussen meerdere celtypes - de meeste biologische systemen zijn heterocellulair. Hoewel stromingscytometriemethoden het vermogen hebben om te onderscheiden tussen meerdere celpopulaties, zijn er celletiketten vereist, dynamische bemonstering is uitdagend en bij toepassing van hechtende cellen wordt deze applicatie tijdrovend en fout gevoelig.

Andere belangrijke cellulaire fenotypes, waaronder morfologische veranderingen, optreden in reactie op milieu-stimuli, maar worden niet opgevangen door traditionele cel-gebaseerde assays. Profiele celstaten door middel van morfologische karakterisering en mapping overeenkomsten over monsters is een krachtig, onbevooroordeeld instrument met de aMogelijkheid om nieuwe inzichten te geven in veel aspecten van basis- en translatieonderzoek, met inbegrip van basiscelbiologie en drugsontdekking ⁴ . Bovendien is aangetoond dat tumorcelmorfologie verband houdt met tumor subtypes ⁵ en agressiviteit ⁶ . Daarom is het van groot belang om deze mobiele functies te bestuderen en hoe ze betrekking hebben op specifieke milieuverstoringen. Daarnaast kan men verschillen in morfologische kenmerken gebruiken om te onderscheiden tussen subpopulaties in co-cultuur systemen. Fluorescent labeling cellen hebben downfalls ( dwz het veranderen van inherente cel eigenschappen, tijdrovend) en daarom zijn extra methoden om celtypen te classificeren voordelig.

Microscopie gebaseerde beeldvorming is een alternatieve methode voor het profileren van cellulaire fenotypes op een multiplexed, kwantitatieve en robuuste manier. In dit manuscript passen we onze kwantitatieve beeldvormingspijpleiding toe om de evolutio te markerenNijndynamiek van heterogene celpopulaties binnen een tumor. We richten ons op de interactie tussen cellen met niet-kleine celkanker (NSCLC) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's), het meest voorkomende stromale celtype dat in tumoren voorkomt. CAF's zijn betrokken bij tumorinitiatie, progressie en therapeutische respons; Daarom kan het uitvoeren van fenotypische analyses op tumorcellen bij afwezigheid van CAF's misleidende ^{7 , 8 , 9 zijn} . Specifiek hebben we de effecten van CAF's op tumorcellen geëvalueerd in reactie op erlotinib, een klein molecuul dat de Epidermale Groeifactor Receptor (EGFR) richt, die vaak wordt gebruikt bij de klinische behandeling van NSCLC. We hebben gebruik gemaakt van een hoogwaardig screeningsplatform en de bijbehorende beeldanalysesoftware voor evaluatie; Echter, in een poging om deze methodologie toegankelijk te maken voor andere onderzoekers, hebben we ook een vergelijkbaar downstream protocol ontwikkeld met behulp van de open source software:CellProfiler ¹⁰ en CellProfiler Analyst ¹¹ . De meeste beeld gebaseerde high-content screening analyses worden geanalyseerd met gecommercialiseerde software specifiek voor een bepaald instrument model. Resultaten zijn moeilijk te repliceren in andere laboratoria met verschillende software omdat de onderliggende algoritmen vaak eigendom zijn. Met behulp van deze beeldgebaseerde pijplijn werden cel proliferatie, dood en morfologie van elke subpopulatie van een heterocellulaire cultuur als reactie op medicijnbehandeling met behulp van zowel fluorescentie- als morfologie gebaseerde classificatie gemeten. Het volgende protocol biedt een robuuste methodologie voor het onderzoeken van complexe cellulaire processen.

Protocol

1. Celcultuur

OPMERKING: hier werden fenotypische reacties van NSCLC-cellen (H3255) naar het EGFR-targetingmiddel, erlotinib, gecombineerd met longfibroblasten (CCD-19Lu GFP) onderzocht. Voor dezelfde dataset werd fluorescentie gebaseerde en morfologie gebaseerde classificatie van de twee celpopulaties (H3255 en CCD-19Lu GFP) om hun concordantie te laten zien, uitgevoerd. Echter, slechts één classificatie methode moet worden gebruikt en moet gekozen worden op basis van de applicatie.

1. Bereid 500 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 1% penicilline / streptomycine.
   OPMERKING: Het groeimedium en supplementen kunnen zo nodig vervangen worden voor andere celtypes.
2. Cultuurcellen in 10 cm ³ platen als zuivere populaties in 5% CO ₂ bij 37 ° C en passeer de bij elke geschikte verhouding elke 3-4 dagen.

2. Bereiding van cellen

1. Om een ​​celsuspensie te bereiden, verwijder cEll media en wascellen met 5 ml 1X fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS).
2. Aspireren uit de PBS, voeg 1 ml 0,05% trypsine toe tot 37 ° C en incubeer gedurende 5 minuten (of totdat cellen niet langer aan de plaat worden gehecht) bij 37 ° C.
3. Om trypsine te neutraliseren, voeg 4 ml RPMI aan H3255 en CCD-19Lu GFP platen toe en pipet de celoplossingen in 15 ml conische buizen.
4. Centrifugeer cellen bij 150 xg gedurende 5 min bij RT.
5. Aspiratie van de supernatant en resellerende celpellets in 10 ml RPMI media in conische buizen om voor te bereiden op het zaaien.

3. Cell Plating

1. Tel de cellen om het zaaien te standaardiseren.
   1. Inverteer buizen om cellen in oplossing te mengen. Pipetteer 10 μl van elke celsuspensie in een microcentrifugebuis en voeg 10 μL trypan blauw toe.
   2. Pipetteer 10 μL van deze oplossing in een celtellende dia en plaats in een geautomatiseerde celteller.
      OPMERKING: Andere methoden van celtelling ( dwz. Hemocytometer) kunnen worden gebruikt.
   3. Herhaal de celtelling ten minste drie keer, of tot de verkregen cijfers consistent zijn.
2. Zaadcellen op een multi-well plaat
   OPMERKING: Het aantal borden naar zaad is afhankelijk van het aantal tijdspunten dat wordt afgebeeld. Als alternatief kan één plaat over de tijd opnieuw worden afgebeeld als de cellen worden getransduceerd met histone-2B-GFP (of andere stabiele lentivirale nucleaire vlekken die voldoende nucleaire segmentatie verschaffen).
   1. Zaad in totaal 10000 cellen / putje in 100 μl RPMI. Bereid drie celsuspensies op drie celpopulaties van plaat: H3255, CCD-19Lu GFP en 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Voer elk in drievoud met identieke plaatopstellingen voor elk tijdstip uit.
      OPMERKING: De initiële zeedichtheden moeten worden geoptimaliseerd voor elke cellijn en plaatgrootte.
   2. Zaadcellen in 3 x 96-putjes platen met behulp van een multikanaalspipet. Incubeer cellen O / N bij 37 ° C, 5% CO ₂ .

4. Drugsdosering

1. Voeg DMSO toe aan erlotinibpoeder om een ​​uiteindelijke oplossing van erlotinib voorraad van 10 mM concentratie te maken.
   OPMERKING: Het geneesmiddel kan als gewenst worden gesubstitueerd.
2. Verdun het geneesmiddel met celcultuurmedium tot 2x de uiteindelijke concentratie met de hoogste eindconcentratie bij 10 uM en verdubbel viermaal vier keer bij een 1:10 verhouding, voor een totaal van vijf geneesmiddelconcentraties en geen drugssturing.
   OPMERKING: Als de concentratie van DMSO gelijk is aan of hoger is dan 0,1% v / v bij de hoogste dosis van geneesmiddelen, dient de geen geneesmiddelcontrole equivalente hoeveelheid DMSO te bevatten om ervoor te zorgen dat de waargenomen waargenomen effecten niet te wijten zijn aan DMSO toxiciteit.
3. Pipette 100 μL geneesmiddeloplossing in de juiste put voor een uiteindelijke geneesmiddelconcentratie van 1x verdund in media.

5. Image Acquisition

OPMERKING: Beelden werden op dagen 0, 2 en 3 verworven. Afhankelijk van de celsoorten en de cellulaire processen die worden bestudeerd, oDaarbij kunnen gewenste tijdspunten worden bestudeerd.

1. Vlekcellen om voor beeldvorming voor te bereiden.
   1. Maak de kleurstofoplossing op bij de volgende eindconcentraties.
      1. Voor de fluorescentie gebaseerde classificatie, berei 5 μg / ml nucleaire vlek en 5 μM dode cel vlek in PBS (zie Tabel van Materialen ).
      2. Voor morfologie gebaseerde classificatie bereiden 5 μg / mL kernvlek, 5 μM dode celvlek en 5 μM celvlek in PBS (zie Tabel van Materialen ).
   2. Voeg 20 μL kleurstofoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht.
2. Optimaliseer en verwerven afbeeldingen.
   1. Verwijder de putplaat van de incubator, veeg de bodem van de plaat met 70% EtOH en plaats de plaat in de beeldkamer.
   2. Klik in het tabblad 'Setup' op de knop '+' onder 'Channel Selection' om de juiste kanalen toe te voegen aanAfbeelding ( dwz brightfield, nucleaire vlek, dode celvlek, GFP en RFP signalen).
   3. Klik op 'Lay-out Selection' en neem z-gestapelde testafbeeldingen elke 2 μm vanaf 0 μm en eindig op 20 μm om het focusvlak te identificeren. Voer deze afstand in voor elk kanaal onder 'Hoogte'.
   4. Klik op 'Snapshot' onder elk kanaal om intensiteiten te evalueren en de belichtingstijden te optimaliseren. Voer hogere of lagere waarden in onder 'Tijd' zoals vereist.
   5. Aan de rechterkant van het scherm markeert u passende bronnen (die worden afgebeeld) op de schematische plaat. In de onderstaande schema's markeer de vijfentwintig velden die op een vergelijkbare manier worden afgebeeld.
   6. Onder 'Run Experiment' identificeert u de plaat in 'Plate Name' op het linker tabblad en klikt u op de knop 'Start' (onder) om het beeldverhaalprotocol met een 10X-object te richten om grijze TIFF-afbeeldingen te genereren in de hiervoor genoemde kanalen.
      OPMERKING: stap-voor-stap instRuwingen voor beeldvormingsprotocol kunnen verschillen tussen instrumenten, maar parameterwaarden moeten nog geoptimaliseerd worden.
   7. Herhaal de afbeeldingen op dag twee en drie.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Alle beeldanalyses werden uitgevoerd met behulp van eigen software. Omdat dit echter niet publiekelijk beschikbaar is, werden vergelijkbare analyses ook ontworpen op CellProfiler 2.2 en CellProfiler Analyst 2.0, met een kort protocol hieronder en gedetailleerd protocol dat als aanvullend materiaal wordt geleverd (testafbeeldingen zijn al in pijplijnen geladen om de workflow te testen). De afbeeldingen van dit experiment werden per keer samengevoegd, zodat elke bron individueel geladen kon worden. De onderstaande pijpleidingen van CellProfiler bevatten een regelmatige expressie die metadata informatie uit elke afbeeldingbestandsnaam analyseert en de afbeeldingen verder kunnen groeperen per kanaal.

1. Download en installeer de open source software: 'CellProfiler9; En 'CellProfiler Analyst'. Aanvaar alle standaardopties en add-ons tijdens de installatie.
2. Herken heterocellulaire culturen in subpopulaties.
   1. Open 'CellProfiler' software, klik op 'Bestand' | 'Import Pipeline' | 'Uit bestand' en selecteer het juiste bestand ('Fluorescence_Classification.cppipe' voor fluorescentie gebaseerde classificatie , of 'Morphology_Classification.cppipe' voor morfologie-gebaseerde classificatie).
      OPMERKING: Deze bestanden bevatten protocollen voor basisafbeelding en kern- / celsegmentatie. Vanwege de ongelijke Hoechst-vlek die aanwezig is over deze cellen, werden kernen gesegmenteerd en vergroten en vervolgens gebruikt om het beeld te maskeren om segmenten van kernen met lagere intensiteiten mogelijk te maken.
      1. Selecteer de fluorescentie-gebaseerde classificatiepijpleiding om cellen als H3255 of CCD-19Lu te classificeren op basis van eGFP-intensiteit, en om morfologische eigenschappen te berekenen.
         OPMERKING: CCD-19Lu-cellen werden getransduceerd met GFP.
      2. Selecteer de morfologie gebaseerde classificatie pijpleiding om segmenten van kernen en cellen te definiëren en om morfologische eigenschappen te berekenen.
         OPMERKING: Voor verdere indeling is verder nader onderzoek nodig in 'CellProfiler Analyst'. Dode cellen worden geclassificeerd door middel van fluorescentie gebaseerde classificatie.
   2. Klik onderaan op het scherm op 'Uitvoerinstellingen weergeven'. Selecteer de locatie van de afbeeldingsbestanden voor analyse ('Default Input Folder') en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens ('Default Output Folder').
   3. Klik op 'Analyses Images' om de analyse te starten. Wanneer de analyse is voltooid, klikt u op 'OK' en gaat u naar de 'Standaarduitvoermap' om de berekende gegevens te bekijken.
      OPMERKING: Voorbeeldparameterwaarden en afbeeldingen zijn beschikbaar in Aanvullende Bestand 1-CellProfilerProtocol.pdf .
   4. Voor de morfologie gebaseerde classificatie (alleen) doe het volgende.
      1. Open 'CellProfiler Analyst' software, selecteer het database eigenschappen bestand dat is gegenereerd in CellProfiler, en klik op 'Open'.
      2. Klik op het tabblad 'Classificeren' boven in het scherm. Om willekeurige celafbeeldingen van experiment te beluisteren, klikt u op 'Halen'; Afbeeldingen verschijnen in het niet-geclassificeerde venster.
   5. Categoriseer je cellen handmatig als positief (H3255) of negatief (CCD-19Lu) door cellen te selecteren en naar de juiste bin te slepen (zie Aanvullend Bestand 2-Pipeline.pdf : Figuur B ). Na het classificeren van ten minste 50 cellen per subpopulatie, klikt u op 'Train Classifier' en vervolgens op 'Progress Check'.
      OPMERKING: Cellen worden ingedeeld via een door gebruikers gecontroleerde willekeurige forest machine learning algoritme ¹² . Als de nauwkeurigheid niet hoger is dan de goedgekeurde drempelwaarde (> 90%), kan het nodig zijn om celsegmentatie terug te gaan en te optimaliseren op 'CellProfiler', of de cellen zijn mogelijk niet ideaal voor classiSteken door morfologie.
   6. Klik op 'Score All' om een ​​tabel met celtellingen te genereren voor elke subpopulatie.

Results

We gegenereerd een beeldset bestaande uit 25 velden / putjes, 54 putten / plaatjes (3 celpopulaties x 6 geneesmiddelconcentraties x 3 replicaten), over drie platen voor in totaal 4.050 individuele afbeeldingen. De in de loop van het experiment gegenereerde beeldsets werden geanalyseerd met behulp van proprietary software (zie tabel van materialen) om verschillende kwantitatieve eigenschappen van cellen te trekken ( dwz morfologie, fluorescentie) die vervolgens gebruikt kan worden om cel subpopulaties te classificeren. Aangezien de gebruikte commerciële software beperkte toegang heeft, werden vergelijkbare downstream-pijpleidingen in CellProfiler en CellProfiler Analyst gemaakt.

Heterocellulaire classificatie in subpopulaties

Nuclei werden geïdentificeerd en gesegmenteerd op basis van de DNA-vlek (hier Hoechst) en celpopulaties werden ingedeeld op basis van fluorescentie of moRfologie ( figuur 1 ). Voor fluorescentie gebaseerde classificatie werden de fibroblasten (CCD-19Lu) eerder getransduceerd met GFP-lentivirus. De GFP-intensiteitsniveaus werden gemeten voor elke kern en die welke werden berekend boven de aanvaarde drempel (gebaseerd op het achtergrondsignaal) werden geclassificeerd als CCD-19Lu, terwijl die hieronder werden geïdentificeerd als tumorcellen (H3255). Voor morfologie gebaseerde classificatie werden cellen eerder gekleurd met een niet-toxische cellulaire vlek (zie de tabel van materialen) en dit werd gebruikt om de cytoplasma te identificeren en te segmenteren. Een machine algoritme werd getraind met ~ 50-100 cellen van elke populatie. Morfologische eigenschappen werden geïdentificeerd die significant verschillend waren tussen de populaties, die vervolgens gebruikt werden om een ​​lineaire classifier te ontwerpen om te onderscheiden tussen CCD-19Lu en H3255 cellen. De classificatieprotocollen voor fluorescentie en morfologie waren 97,4% (n = 1403) concordant bij het onderscheiden van de twee cel populatieAtions in onbehandelde condities en 92,5% (n = 916) concordant bij geneesmiddelbehandelde condities (1 μM erlotinib) ( Figuur 2 ).

Fenotypische analyses van subpopulaties

Naast het onderscheiden van celtypes streven we naar fenotypische eigenschappen van elke subpopulatie. Multiplexing assays bespaart tijd en reagentia, voegt consistentie toe en geeft aanvullende informatie over het systeem dat wordt onderzocht. Er zijn veel potentiële fenotypische outputs en men moet ze kiezen op basis van de vragen van belang. Hier werden veranderingen in de celmorfologie en levensvatbaarheidsstatus in reactie op erlotinibbehandeling onderzocht. Na drie dagen medicijnbehandeling werd een daling van het nucleaire gebied en een toename van het cellulair gebied van de H3255-cellen ( Figuur 3A ) waargenomen. Het gemiddelde verschil in kerngebied tussenDe populaties van "geen geneesmiddel" en "drug" werden statistisch significant gevonden door middel van een dubbelzijdige type-2 (gelijke variantie) t- test ( p = 7,92 x 10 ^-16 ). Wij veronderstellen dat deze waarneming een cellulaire reactie is op de stress die wordt opgelegd door middel van geneesmiddelenbehandeling.

Het is ook van belang om te onderzoeken of een geneesmiddel cytotoxisch is (dat wil zeggen een toename van het aantal dode cellen in de loop van de tijd) of cytostatische ( dwz afname in aantal celgeborenen over de tijd) effect op cellen, aangezien dit een grote klinische impact heeft. Bijvoorbeeld induceert een cytostatische drugseffect groei arrestatie maar elimineert de cellen niet van de tumor, dus er is het potentieel voor kankercellen om de proliferatie van de cel opnieuw in te tappen zodra het geneesmiddel verwijderd is. Drugseffecten kunnen vaak context, concentratie en afhankelijk celltype zijn. We hebben voorheen erlotinib waargenomen dat een cytotoxische reactie in één celtype werd geëxploiteerd, terwijl ac blijkt te wordenYtostatische respons in een andere ¹³ .

Traditionele levensvatbaarheidsassays uitvoeren relatief cijfersnummer en onderscheiden derhalve niet tussen groeistoornissen en celdood. Hierin werden dode cellen geïdentificeerd op basis van propidiumjodide vlekken ( Figuur 3B ). Beide cytotoxische en cytostatische effecten van erlotinib op H3255-cellen werden waargenomen, met een toename van het aantal sterfgevallen en een afname van het aantal geboortes na de behandeling van geneesmiddelen ( Figuur 3C ). Het is op te merken dat het aantal dode cellen daalt na dag 1, waarschijnlijk als gevolg van celcorrectie. CCD-19Lu-cellen werden niet beïnvloed door het geneesmiddel. Een extra voordeel van dit platform is de opwekking van kwantitatieve data. Bijvoorbeeld in ons co-cultuur experiment werd een eerste subpopulatie van 1.118 (75.8%) H3255 cellen gevonden na 2.8 dagen (87.9%) of 396 (57.2%) zonder of met erlotineIb behandeling, respectievelijk ( figuur 4 ). Omdat we daadwerkelijke celtellingen kunnen genereren in plaats van relatief percentage (zoals bij flow cytometrie methoden) concluderen we dat de verandering in samenstelling tijdens de behandeling van geneesmiddelen het gevolg is van een daling van H3255 cellen en niet een toename van CCD-19Lu. Het is niets waard dat de sterftecijfers onderschat kunnen worden door celcorrectie, die moeilijk experimenteel kan worden beoordeeld en waarschijnlijk verschilt over celtypes.

Figuur 1: Overzicht van het Protocol voor Beeldanalyse. Twee mogelijke stroomafwaartse beeldanalysepijpleidingen om heterocellulaire populaties te classificeren met behulp van een op morfologie gebaseerde classificatie of op fluorescentie gebaseerde classificatie. Schaalstaven = 100 μm. Klik alstublieft op haarE om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Concordantie tussen Morfologie en Fluorescentie gebaseerde classificatie. ( A ) Concordance plot die de overlapping van de twee classificatieprotocollen toont. De zelfde cellen werden ingedeeld als H3255 met behulp van zowel morfologie- als fluorescentie gebaseerde classificatie. De twee protocollen waren in overeenstemming, met classificatie voor 97,4% (n = 1403) van onbehandelde cellen en 92,5% (n = 916) van de cellen die werden behandeld met erlotinib (Opmerking: het witte gebied is te klein om te visualiseren). ( B ) 10X beelden die voorbeelden tonen van goede en slechte concordantie tussen fluorescentie gebaseerde en morfologie gebaseerde classificatie. De witte pijlen wijzen op cellen die inconsequent zijn ingedeeld tussen platforms. Input image: blue-nuclei (Hoechst); Groen - CCD19Lu (GFP). classiFicatie beelden: Red - H3255; Groen - CCD-19Lu. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Multiplexe fenotypische metingen uit een enkele experimentele instelling. ( A ) Morfologische kenmerken, zoals kernen en celgebied, werden berekend op het enkelcelniveau in aanwezigheid en afwezigheid van geneesmiddel. Opmerking: celoppervlakken die kleiner zijn dan 100 μm ² werden beschouwd als puin en werden uitgesloten van analyses. Box-grafiek toont mediaan met eerste en derde kwartielbereik en 95% confidence interval error bars. ( B ) H3255 (blauw) en CCD-19Lu (groene) cellen werden gecultiveerd en dode cellen werden geïdentificeerd op basis van de intensiteit van propideIum iodide vlek (rood) en afgebeeld met behulp van een 10X objectief. Schaalbalk = 1 mm (bovenpaneel); 100 μm (onderafbeeldingen). ( C ) Totaal aantal levende en dode cellen werden over drie dagen berekend met of zonder geneesmiddelbehandeling, met een duidelijke afname in het aantal levende cellen en toename van de doodcellen met toevoeging van erlotinib. Foutbanden vertegenwoordigen standaardfout van het gemiddelde op basis van drie replicaten. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Subpopulatie Dynamiek over Tijd. Representatieve 10X beelden van putten die H3255 (blauw) en CCD-19Lu (groen) bevatten op dag 0 of dag 3 met en zonder medicijnen. Cellen die behoren tot elke subpopulatie werden geteld en proportionele taartdiagrammen tonen de aCtual verandering in populatie samenstelling over monsters. Schaalstaven = 1 mm (middenpanelen, ingepakt in; achterste paneel), 1 mm (bovenste beeld), 100 μm (onderafbeeldingen). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het hierboven beschreven protocol verbetert de huidige celbiologie-assays door meer uitgebreide inzichten te bieden in de fenotypische dynamica van meerdere celtypen in reactie op omgevingsstoornissen, terwijl het minder reagentia en tijd gebruikt. Een groot voordeel van dit experimentele ontwerp is de mogelijkheid om meerdere fenotypes met een enkele opstelling te analyseren en kwantitatieve gegevens te genereren die deze fenotypes op eencellig niveau karakteriseren. Een technisch voordeel van deze platform is de gemakkelijke aanvang van probleemoplossing vergeleken met andere assays. Omdat deze methode op beeld gebaseerd is, is het mogelijk om de putjes te visualiseren op duidelijke over/onder bezaaiing. Het is raadzaam om cellen in de exponentiële groeifase te hebben gedurende de duur van het experiment en niet beperkt te zijn door voedings- of ruimtelijke beperkingen of verward te worden door veroudering als gevolg van schaars bezaaien. Anders kunnen geboortecijfers en sterftecijfers niet reproduceerbaar zijn tussen experimenten. Voor referentie is CellPD een openbaar beschikbaar programma voor berekening van geboortecijfers en sterftecijfers¹⁴. Bovendien kan men visualiseren of adequate concentraties kleurstoffen aan elke put zijn toegevoegd. Pipetteringsproblemen in een individuele put kunnen resulteren in foutmatige segmentatie en vertekende gegevens, maar kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met het eerder genoemde protocol.

Helaas zijn niet alle celtypen geschikt voor deze toepassing. Het is belangrijk om de kernen en cellen nauwkeurig te kunnen segmenteren, daarom is de analyse van cellen die zich organiseren in meer bolvormige of geclusterde structuren mogelijk niet geschikt. Voor sommige cellen kan het ook voordelig zijn om een celzeef te gebruiken vóór het bezaaien om de initiële bezaaiing van enkele cellen te garanderen. Bovendien is de lineaire classificatietechniek alleen toepasbaar op celtypen die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden op basis van morfologische kenmerken.

Voor het succes van het protocol is het belangrijk om eerst de beeldvormingsomstandigheden te optimaliseren, omdat de geldigheid van downstream-analyses afhankelijk is van de kwaliteit van de beelden. Hoewel we hier experimenten hebben uitgevoerd met behulp van een high-content screening-platform, kan beeldverwerving ook worden uitgevoerd met elke fluorescente microscoop (hoewel een geautomatiseerd beeldvormingsplatform ideaal is voor high-throughput-benaderingen). Testbeelden moeten worden gemaakt vóór elke beeldvormingstijdstip om ervoor te zorgen dat er geen problemen zijn met de microscoop of het protocol. Het signaal-ruisverhouding moet hoog zijn, vooral voor de kanalen die zullen worden gebruikt voor segmentatie (d.w.z. kernen, celkleuringen). Bovendien is het belangrijk om in het optimale focusvlak te beelden. Als de beelden niet scherp zijn, wordt segmentatie veel moeilijker en zullen de berekende morfologische kenmerken waarschijnlijk onnauwkeurig zijn. Verschillen in verlichting tussen velden kunnen ook problemen veroorzaken met beeldsegmentatie. Grote verschillen in helderheid maken de geautomatiseerde selectie van drempelwaarden moeilijk. Bovendien, als er heterogene fluorescentie-intensiteiten tussen cellen zijn, kan een enkele drempelwaarde mogelijk niet alle cellen in een beeld voldoende segmenteren. In deze analyse werden deze problemen overwonnen door maskers te maken rond helderdere en zwakkere celpopulaties en elke populatie afzonderlijk te segmenteren.

Hoewel de fenotypes onder onderzoek in dit protocol beperkt zijn tot levende, dode en morfologische karakterisering, kunnen ze gemakkelijk worden uitgebreid om andere kenmerken te onderzoeken. Bijvoorbeeld, functionele genetische studies kunnen worden toegevoegd met RNAi, overexpressie of andere chemische verstoringen.

In dit artikel is de mogelijkheden van het protocol om de respons van non-kleincellige longkankercellen op erlotinib in de aanwezigheid en afwezigheid van CAF's te meten, aangetoond. Dit is echter slechts een voorbeeld van de vele celtypen en micro-omgevingsparameters die kunnen worden getest. We hebben dit protocol uitgebreid voor gebruik met andere celtypen en medicijnstudies, inclusief primaire cellen geïsoleerd uit tumoren van patiënten^13,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Corning	10-040-CV	celcultuurmedium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini	100-106	medium supplement
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122	medium supplement
TC20	Biorad	1450102	celteller
TC20 slides met trypan blue	Biorad	1450003	celteller slides
96-well platen	Corning	3904	heldere bodem zwarte platen
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	oplossing om het medicijn opnieuw te suspenderen
Hoechst	Invitrogen	H21491	nucleaire kleurstof
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P1304MP	dode celkleur
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	hele celkleur
Operetta hoogwaardig beeldvormingssysteem	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	versie 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Celcultuur incubator			Elke celcultuur incubator zal geschikt zijn - cellen werden gekweekt onder 37 ºC bij 5% CO2.
15 mL Falcon kegelbuisjes	Falcon	14-959-53A
10 cm2 celcultuur platen	TPP	93040