Herhaald bloedinzameling van staart ader van niet-verdoofd ratten met een systeem voor het verzamelen van vacuüm bloed

Samenvatting

Hier beschrijven we een eenvoudige staart veneuze bloedmonsters methode bij niet-verdoofd ratten met behulp van een systeem van de buisjes opzuigen. Deze methode vermindert het risico van directe blootstelling aan bloed en vereenvoudigt meerdere bemonstering van een enkele Venapunctie.

Samenvatting

Bloed kunnen worden verzameld van ratten in een aantal locaties van de bemonstering. Bijvoorbeeld, is de staart-ader een superieure locatie voor bloedmonsters. Echter is de ader van de staart dun zodat het is soms moeilijk te doorprikken. Bovendien, de staart-ader heeft lage bloedtoevoer en vereist een lange bemonsteringstijdstip om voldoende bloed. Dit verslag beschrijft een eenvoudig bloed bemonsteringsmethode, de vacuüm bloed collectie methode, die meestal gebruikt wordt om het verkrijgen van bloedmonsters van patiënten, hier gebruikt voor niet-verdoofd ratten. De 22 G vlinder naald tip is ingevoegd in een van de aders van de laterale staart ongeveer 2-3 cm vanaf het puntje van de staart onder een hoek van ongeveer 20°, en bloed in de buis vacuüm collectie werd verzameld door het invoegen van het einde van de rubber van de vlinder naald in de va cuum bloed collectie buis. De huidige experimentele resultaten blijkt dat het slagingspercentage 95% in de experimentele groep en 90% in de groep van de beginner. Het slagingspercentage en punctie tijden waren vergelijkbaar tussen twee groepen. De bemonstering duur was aanzienlijk korter in de experimentele groep ten opzichte van beginner groep. Kortom, is deze methode vacuüm bloed collectie voor sequentiële bloedmonsters van de ader van de staart van niet - narcose ratten haalbaar en easy-to-learn, die kan dienen als een betrouwbare alternatief voor andere conventioneel bloed sampling technieken voor gebruikt ratten.

Inleiding

Bloedmonsters van ratten is vereist voor een breed scala aan experimentele studies. Technieken voor de bloedinzameling van de rat omvatten aanprikken van het hart, retro-orbitaal plexus halsslagader, saphenous ader, staart bloedvaten, halsslagader, abdominale aorta en vena cava. De meeste technieken (behalve saphenous ader en staart bloedvat punctie) vereisen verdoving^1,2. Aderen van de staart van de rat zijn routinematig doorboord voor bloedmonsters en vasculaire injectie. Na behandeling van de staart met warm water, zijn de bloedvaten goed verwijde en geschikt voor manipulatie, zelfs wanneer er ratten zijn narcose³.

Ondanks de ontwikkeling van nieuwe en verbeterde technieken voor het verkrijgen van bloedmonsters in kleine laboratorium dieren², is het niet altijd gemakkelijk te verkrijgen van voldoende bloed bij de bemonstering van kleine dieren. De ader van de staart van ratten is een superieure locatie voor bloed bemonstering⁴. Echter, de ader van de staart is dun, dus het is soms moeilijk te doorprikken en lang zou duren om genoeg bloed als gevolg van zijn lage bloedtoevoer. Bloedinzameling via een opzuigen buis systeem is een typische methode in de dagelijkse klinische praktijk. Dit gesloten systeem voor het verzamelen van bloed vermindert het risico van directe blootstelling aan bloed en gemakkelijker meerdere monsters van een enkele Venapunctie⁵te nemen. Het onderhavige verslag wordt een eenvoudige staart veneuze bloedmonsters methode bij niet-verdoofd ratten met behulp van het opzuigen buis systeem beschreven. Deze methode is gemakkelijk te beheersen en kan worden gebruikt voor het verkrijgen van een grote hoeveelheid bloed herhaaldelijk bij ratten.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Tongji Medical College Council op het Animal Care Comité van Huazhong Universiteit voor wetenschap en technologie (Wuhan, China). Het manuscript werd voorbereid volgens aankomen (dier onderzoek: rapportage van In Vivo experimenten) richtsnoeren⁶.

1. veehouderij

1. Gebruik van Sprague-Dawley (SD) ratten (n = 20, 10 mannen, 8 weken oude, gewicht 261 tot 291 g, betekenen = 272.85 ±9.07 g) uit de experimentele dieren Center van Huazhong Universiteit van wetenschap en technologie en onderhouden van ratten volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van Proefdieren die worden gepubliceerd door de ons National Institute of Health (NIH publicatie No.85-23, herziene versie van 1996)
2. Huis onder standaardomstandigheden met gratis toegang tot voedsel en drinkwater. Houden beddengoed ratten in 530 cm² kooien met hout-scheren. Huis twee ratten in elke kooi. Alle kooien open te houden voor het milieu van de kamer (geen micro-isolatie of geventileerde kooien)
3. Zorgen dat het personeel dat betrokken is in de experimentele protocol regelmatig behandelen de ratten.
4. Handhaven van de kamertemperatuur tussen 21 ° C en 23 ° C. Tarieven geven een normale zout dieet (0,3% NaCl) tijdens de studie.

2. bloed verzameling Procedure

Opmerking: Het systeem voor het verzamelen van vacuüm bloed bestaat uit een dubbel-puntige naald [22 G (0.7 mm x 25 mm)], een plastic houder, en een reeks van vacuümbuizen (2 mL) met rubberen stoppen (Figuur 1).

1. Plaats de rat in een kunststof beteugeling houder en wassen van de staart met warme (20-30 ° C) water te verwijderen van zichtbaar vuil of ontlasting. Terwijl een assistent de staart in een verlengde positie houdt, veeg de staart met 70% ethanol, en reinig met gaas om de ader die duidelijk.
2. Breng de tip van 22 G vlinder naald in een van de laterale staart nerven (ongeveer 5 mm) op een positie ongeveer 2-3 cm afstand van het puntje van de staart onder hoek van ongeveer 20 ° (Figuur 2). Het verzamelen van bloed in de buis vacuüm collectie door het invoegen van het einde van de rubber van de vlinder naald in de vacuüm bloed collectie buis (Figuur 3).
   Opmerking: De maximale collectie bloed volumewaarde bedraagt 1,2 mL⁷.
3. Na de bloedinzameling, verwijder de naald en zachtjes druk uitoefenen op de site van de punctie met gaas voor 15-30 s om te stoppen met de doorstroming van het bloed. Vervolgens laat de rat van de kunststof houder van de beteugeling en de rat terug naar haar kooi.
4. Gebruik buizen die EDTA als een antistollingsmiddel bevatten voor het verzamelen van bloed plasma. Voorzichtig omkeren de buis meerdere malen te mengen antistollingsmiddel in het bloed en leg de monsters op ijs verticaal.
5. Centrifugeer het bloed monster collectie buizen in een gekoelde centrifuge bij 2.000 x g gedurende 10 minuten om te scheiden van plasma of serum.
6. Pak de plasma/serum, verzorgen niet te storen van de rode en witte bloedcellen lagen. Gebruik voor het verzamelen van bloedserum, buizen zonder antistollingsmiddel. Beide soorten monster kunnen worden onmiddellijk gebruikt of opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal één jaar.
   Opmerking: Succesvolle bloedinzameling werd gedefinieerd als het verkrijgen van 1,2 mL bloed elke keer. Maximale punctie tijd was ingesteld naar drie proeven, als het volume van de totale bloed lager dan 1,2 mL na de derde lekke band was, was het gedefinieerd als een mislukte bloedinzameling. De duur van de bemonstering begint vanaf de staart ader punctie voor de verwijdering van de vlinder naald na bloed-collectie.
7. Het verzamelen van bloed twee keer binnen twee weken⁷.
   1. Om te testen en controleren van de haalbaarheid van deze methode, trainen twee medische studenten (beginners) voor 2 h alvorens dit bloed collectie protocol uit te voeren. Gebruik van twintig ratten en bloed trekken uit 10 ratten van 2 ervaren fellows (experimentele groep) en 10 ratten door de 2 medische studenten (beginner groep).

3. statistische analyse

1. Express-gegevens als een gemiddelde ± standaardafwijking en analyseren met PASW Statistics 17. Een α-waarde van 0.05 werd daarom gekozen voor p < 0.05 werd beschouwd als een statistisch significant.

Resultaten

Duur van de bemonstering, lichaamsgewicht en bloed collectie volume van de twee groepen
Bloed werd bijeengezocht uit 10 ratten (5 reutjes) tweemaal binnen twee weken in elke groep. Het gemiddelde lichaamsgewicht in beide groepen gelijkaardig was (272.00 ±9.66 g en 273.70 ±8.87 g). Bemonstering van duur was aanzienlijk korter in de experimentele groep ten opzichte van beginner groep (2,77 ±0.53 min vs. 3,28 ±0.83 min, p < 0.05) (tabel 1).

Succes tarief en perforaties van de tijden van twee groepen
Het slagingspercentage was 95% (19/20) in de experimentele groep en 90% (18/20) in de beginner groep (p > 0,05). Punctie tijden waren niet significant verschillend tussen de twee groepen (1,50 ±0.61 min vs. 1.85 ±0.75 min, p > 0,05) (tabel 2). Deze resultaten geven aan deze methode is eenvoudig te leren, en de techniek onder de knie kan worden na de training voor 2 h.

Figuur 1 : vacuüm blood collection tube 2 mL (links); 22 G vlinder naald (midden); de kunststof beteugeling houder (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : De naald tip was de laterale staart ader (ongeveer 5 mm) ingevoegd op de positie ongeveer 2-3 cm afstand van het puntje van de staart onder hoek van ongeveer 20 °. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Succesvol Venapunctie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Experimentele groep						Beginner groep
	Geslacht	Lichaamsgewicht (g)	Verzamelde bloed volume (mL)	bemonstering duur (min)			Geslacht	Lichaamsgewicht (g)	Verzamelde bloed volume (mL)	bemonstering duur (min)
E1-1	man	291	1.2	3.12		B1-1	man	282	1.2	3.18
E1-2	man	291	1.2	2.73		B1-2	man	282	1.2	2.18
E2-1	man	276	1.2	2.3		B2-1	man	264	1.2	3,73
E2-2	man	276	1.2	2.37		B2-2	man	264	1.2	2,47
E3-1	man	267	1.2	2.73		B3-1	man	265	1.2	3.52
E3-2	man	267	1.0	3,88		B3-2	man	265	1.2	2,53
E4-1	man	263	1.2	2.41		B4-1	man	289	1.2	2.32
E4-2	man	263	1.2	2,52		B4-2	man	289	1.2	3.62
E5-1	man	265	1.2	3.61		B5-1	man	277	1.2	3.48
E5-2	man	265	1.2	2.42		B5-2	man	277	1.2	3.12
E6-1	vrouw	285	1.2	3,33		B6-1	vrouw	274	0.9	4.87
E6-2	vrouw	285	1.2	3.03		B6-2	vrouw	274	1.2	3.37
E7-1	vrouw	271	1.2	2,82		B7-1	vrouw	268	1.0	3.93
E7-2	vrouw	271	1.2	2.42		B7-2	vrouw	268	1.2	3.82
E8-1	vrouw	268	1.2	1.93		B8-1	vrouw	262	1.2	2.07
E8-2	vrouw	268	1.2	3,05		B8-2	vrouw	262	1.2	3.67
E9-1	vrouw	273	1.2	2,52		B9-1	vrouw	281	1.2	4,38
E9-2	vrouw	273	1.2	3.17		B9-2	vrouw	281	1.2	4.57
E10-1	vrouw	261	1.2	1.82		B10-1	vrouw	275	1.2	2,53
E10-2	vrouw	261	1.2	3,25		B10-2	vrouw	275	1.2	2.28
Gemiddelde				2,77						3.28
Nl-1: serienummer van ratten in de experimentele groep voor de eerste collectie van bloed.
Nl-2: serienummer van ratten in de experimentele groep voor de tweede collectie van bloed.
Bn-1: serienummer van ratten in de groep van de beginner voor het eerste bloed-collectie.
Bn-2: serienummer van ratten in de groep van de beginner voor de tweede collectie van bloed.

Tabel 1: Resultaten van bloed opgevangen in de experimentele groep en de groep van de beginner.

	Bloed collectie keer	Gemiddelde punctie keer	Een punctie van de tijd	Twee keer perforaties	Driemaal perforaties	Mislukt	Slagingspercentage
Experimentele groep	20	1,50 ±0.61	11	8	0	1	95%
Beginner groep	20	1.85 ±0.75	7	9	2	2	90%
Een punctie van de tijd: aantal ratten met succesvolle bloedinzameling na de eerste lekke band
Twee keer lek: aantal ratten met succesvolle bloedinzameling na de tweede lekke band
Drie keer een lekke band: aantal ratten met succesvolle bloedinzameling na de derde lekke band
Mislukt: ratten met het aantal mislukte bloedinzameling na de derde lekke band

Tabel 2: Vergelijking van de punctie times en slagingspercentages van de experimentele groep en de groep van de beginner.

Discussie

Dit verslag beschrijft een methode collectie easy-to-learn bloed bij ratten. Onze resultaten toonden aan dat deze methode haalbaar is voor herhaaldelijk het verzamelen van een grote hoeveelheid bloed van ratten. Bovendien, deze methode gemakkelijk kan worden beheerst met een korte leercurve. Deze procedure kan worden uitgevoerd bij ratten niet-verdoofd en veroorzaakt alleen minimale stress voor de dieren.

Bloed kunnen worden verzameld van ratten op verschillende locaties. De ader van de staart is een superieure locatie voor bloed bemonstering⁴. Het is echter niet altijd eenvoudig te verkrijgen genoeg bloed volume van de dunne en lage bloed stroom staart ader van de ratten. Het systeem voor het verzamelen van vacuüm bloed wordt meestal gebruikt voor het verzamelen van bloedmonsters van patiënten in de dagelijkse klinische praktijk. Dit systeem voor het verzamelen van vacuüm bloed is bij patiënten en onderzoek dieren gebruikt voor een lange tijd^8,9,10. Dit systeem bestaat uit een vacuüm bloed collectie buis met siliconen gecoate binnenband muur en vlinder naald. Het was gebaseerd op het beginsel van de vacuüm onderdruk en laat de continue tekening van bloed zonder het risico van het verzamelen van bloed, dat ook de kans op besmetting en hemolyse^{11 vermindert}. De hoeveelheid bloedmonster in de katheter is ongeveer 0.3 mL. Na de terugtrekking van de naald uit de staart ader, zullen het bloed geblokkeerd in de katheter vloeien in de verzamelen vacuüm buis als gevolg van het vacuüm. Deze methode is ook van toepassing voor het verzamelen van bloed van ratten met een gewicht van minder dan 100 g met het gebruik van een kleinere naald punctie.

Dit bloed collectie methode heeft verschillende voordelen. Deze procedure slechts minimale schade toebrengt aan ratten en bloedinzameling kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van verdoving, dus de invloed van de stress-respons en de verdoving op het bloedmonster kan worden vermeden. Onze observaties bleek dat ratten stil in de plastic houder van de matigende tijdens de procedure en er geen doden tijdens deze experimenten waren. Ten tweede, herhaalde bloedinzameling elke één of twee dagen is mogelijk, waardoor frequente bemonstering van bloed met een voldoende volume voor verschillende onderzoeksdoeleinden. Ten slotte, deze methode is eenvoudig te leren en was gemakkelijk onder de knie door beginners na een periode van korte (2 h) leren, zoals aangegeven door de soortgelijke slagingspercentages en de punctie tijden tussen de groepen van het experimentele en beginners in dit verslag. In een vorig rapport, Lee et al. aangetoond een gelijkaardige methode voor de bemonstering van bloed uit de ader van de laterale staart van de rat-⁴. Onze methode is eenvoudiger dan die gerapporteerd door Lee et al. ⁴ in dat we direct de naald punctie in de ader van de staart en het andere uiteinde van de buis invoegen is direct verbonden met de vacuüm buis voor het verzamelen van het bloed, zonder het gebruik van een extra spuit en handmatige aspiratie van het bloed en zonder de noodzaak van ' melk ING' de ader ter vergemakkelijking van de bloedstroom. Het verzamelen van bloed met dit gesloten systeem vermindert de kans op besmetting van bloed. Gebruik van de plastic beteugeling houder ook vermindert de stress aan de rat en bevordert de fixatie van de staart.

De volgende twee stappen zijn cruciaal voor de succesvolle toepassing van deze methode. 1) het uitbreiden van de staart en te voorkomen dat het verkeer van de staart; 2) voorzichtig doorprikken de ader onder een hoek van 20 ° te voorkomen van lekke band via de ader en houd de naald punctie in de ader.

Kortom, is de aangenomen vacuüm bloed collectie methode bij ratten veilig, haalbaar en makkelijk om te oefenen. Deze methode kan regelmatige bemonstering van bloed met een volume van voldoende bloed verkregen uit niet-verdoofd ratten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
een dubbelpuntige naald	Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China	22G	(0.7×25mm)
vacuümbuizen	Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China	2 ml
rat houder	Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China	250g rat houder model
normale zoutvoeding voor ratten			Ratten ontvingen gedurende het hele onderzoek een normale zoutvoeding (0,3% NaCl)
SPSS-software voor statistische analyse	SPSS Inc,  Chicago; USA	Versie 17.0.