Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Wij presenteren een protocol voor de isolatie en de cultuur van de ruggengraat neuronen. De neuronen worden verkregen uit neonatale C57BL / 6 muizen en zijn geïsoleerd op postnatale dag 1-3. Een muis rommel, meestal 4-10 pups geboren uit een fokpaar, is verzameld voor een experiment, en wervelkoorden worden individueel van elke muis verzameld na euthanasie met isofluraan. De wervelkolom wordt uitgescheiden en vervolgens wordt het ruggenmerg uit de kolom vrijgegeven. De ruggenmergen worden vervolgens gehakt om het oppervlaktegebied van een enzymatische protease te verhogen waardoor de neuronen en andere cellen uit het weefsel vrijkomen. Trituratie wordt dan gebruikt om de cellen in oplossing te laten lossen. Deze oplossing wordt vervolgens gefractioneerd in een dichtheidsgradiënt om de verschillende cellen in oplossing te scheiden, waardoor neuronen geïsoleerd worden. Ongeveer 1-2,5 x 10 6 neuronen kunnen geïsoleerd worden uit één nestgroep. De neuronen worden dan geplant op putjes die met lijm facto zijn bedektRs die zorgen voor een goede groei en rijping. De neuronen duurt ongeveer 7 dagen om volwassenheid te bereiken in het groei- en kweekmedium en kan daarna worden gebruikt voor behandeling en analyse.
Inleiding
Het begrijpen van ruggengraatpatologie vereist het gebruik van verschillende modellen, zowel op macroscopische als microscopische niveaus. Grote en kleine dierenmodellen 1 , 2 , 3 worden gebruikt voor in vivo onderzoeken naar ruggengraatziekte en letsel. Terwijl het bestuderen van deze problemen in vivo zijn voordelen heeft, is de analyse van het ruggenmerg beperkt tot het gehele ruggenmerghomogenaat of aan weefselafdelingen 4 . Dit zorgt voor een beetje dubbelzinnigheid bij het proberen om specifieke reacties en doelen in het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De zorg en behandeling van dieren in deze procedure zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Universiteit van Colorado.
1. Oplossingen voorbereiden
- Bereid alle oplossingen op bij passende temperaturen, zoals weergegeven in tabel 1 .
2. Coating Wells en Slides
OPMERKING: Neurons houden zich niet goed aan plastic of glasoppervlakken.
- Een dag voorafgaand aan de isolatie van de neuronen, bedek de putjes van een steriele kweekplaat met 24 putjes met 0,5 ml Poly-D-Lysine....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van deze techniek kan een enkel nest (4-10 pups) de isolatie van 1-2,5 10 6 neuronen die geschikt zijn voor het zaaien op cultuurplaten. Typisch worden 4-8 putjes geplant bij de hierboven genoemde concentratie ( dwz 300.000 cellen / ml). Figuur 3 toont het uiterlijk van neuronen bij deze concentratie na een week in de cultuur bij lage ( a ) en hoge ( b ) vergrotingslichtmicroscopie. We hebben e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze techniek zorgt voor de betrouwbare cultuur van de ruggengraat neuronen. Zodra de vaardigheid in de techniek is bereikt, duurt het ongeveer 3,5 uur om te voltooien. We hebben in ongeveer 4 uur de isolatie van neuronen uit 2 afzonderlijke nestjes (16 muizen totaal) kunnen uitvoeren. De belangrijkste stap in haalbaarheid is om de ruggengraatjes van de muizen op een goede manier te kunnen extraheren. De opbrengst zorgt voor het platen van meerdere putjes en voor het vermogen om de neuronen onder verschillende omstandig.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen bekendmakingen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen erkenningen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 µL | Abcam | ab177487 | Na het fixeren in paraformaldehyde (PFA) en blokkeren met 5% BSA, werden cellen op een dekselglas van 12 mm gedurende 18 uur bij 4 °C in de antistof verdund 1:200 geïncubeerd |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 µL | Abcam | ab11267 | Na het fixeren in paraformaldehyde en blokkeren met 5% BSA, werden cellen op een dekselglas van 12 mm gedurende 18 uur bij 4 °C in de antistof verdund 1:500 geïncubeerd |
Referenties
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
