Methodenartikel

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

12.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55858

⸱

4 december 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, waarmee geïmmobiliseerdet redox eiwitten spectroscopically worden bestudeerd onder directe elektrochemische controle op een koolstof-elektrode. Infrarood spectra van een enkele eiwitSteekproef kunnen opgenomen worden op een scala van toegepaste potentieel en onder uiteenlopende omstandigheden van de oplossing.

Samenvatting

Inzicht in de chemie van redox eiwitten eisen methoden waarmee nauwkeurige controle over redox centra binnen de proteïne. De techniek van eiwit film elektrochemie, die een eiwit op het oppervlak van een elektrode is geïmmobiliseerd, zodanig dat de elektrode fysiologische elektron donors of acceptanten vervangt, heeft verstrekt functionele inzicht in de redoxreacties van een aantal verschillende eiwitten. Volledige chemische inzicht vereist elektrochemische control worden gecombineerd met andere technieken die extra structurele en mechanistische inzicht kunnen toevoegen. Hier tonen we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, die eiwit film elektrochemie met infrarood spectroscopische bemonstering van redox eiwitten combineert. De techniek maakt gebruik van een multiple-reflectie verzwakte totale reflectantie geometrie sonde een redox-eiwit geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte roet elektrode. Opneming van deze elektrode in een flow-cel kan pH van de oplossing of opgeloste concentraties worden gewijzigd tijdens de metingen. Dit is bijzonder krachtig bij de aanpak van Redoxenzymen, waar snelle katalytische omzet kan worden ondersteund en gecontroleerd op de elektrode spectroscopische waarnemingen van langlevende tussenliggende soorten in de katalytische mechanisme toe te staan. We laten zien dat de techniek met experimenten op E. coli hydrogenase 1 niet-omzet onder omzet (H2 oxidatie).

Inleiding

Een belangrijke uitdaging in de studie van eiwitfunctie heeft betrekking op de ontwikkeling van in situ methoden waarmee directe observatie van eiwitten verrichten hun fysiologische functies, in vivo of met behulp van geïsoleerd EiwitSteekproeven. Dit vereist de integratie van controle of triggering processen in experimentele procedures en het gebruik van gecombineerde technieken waarmee zowel de reactiviteit te worden beoordeeld, en afzonderlijke chemische stappen tijdens eiwitfunctie te worden gemeten, tegelijkertijd. In het geval van redox eiwitten is dit vaak gelijk aan het combineren van elektrochemische technieken, die juist controle van de toegepaste potentieel, maar bieden geen rechtstreekse chemische informatie, met spectroscopische technieken die gevoelig voor chemisch-specifieke zijn wijzigingen eiwitfunctie is gekoppeld. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry is een algemene term voor een aantal gekoppelde elektrochemische en spectroscopische methoden die een verscheidenheid van spectroscopische technieken en niveaus van elektrochemische controle omvatten. Veel eiwitten elektronen met kunstmatige, oplosbaar elektron donoren en Acceptanten kunnen uitwisselen en dit heeft benut in studies die gebruik maken van kleine molecules te bemiddelen elektron overdracht, met inbegrip van de koppeling met UV-zichtbaar,4,5 , 6 , 7 magnetische circulair dichroïsme8 en infrarood5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. In een beperkt aantal gevallen is het mogelijk om te exploiteren onbemiddelde, diffusie-gecontroleerde elektron uitwisseling tussen eiwitten en elektroden gebleken. 15 , 16

Voor katalytische reacties uitgevoerd door Redoxenzymen, oplossing elektrochemie benaderingen aanwezig een duidelijk nadeel. Elektron diffusie-gecontroleerde overdracht via redox bemiddelaars in oplossing dreigt te worden snelheidslimieten. Kinetische en mechanistische informatie over het enzym of kan worden verloren, op zijn minst moeilijk te deconvolute van diffusie artefacten die voortvloeien uit de experimentele methode. Directe, spontane elektrochemische controle is daarom een belangrijk instrument voor de studie van redox eiwitten en enzymen. De techniek van eiwit film elektrochemie (PFE) werkzaam redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, op zodanige wijze dat de elektronen rechtstreeks naar of vanuit de redox cofactoren binnen de proteïne worden overgedragen zoals de elektrode is gepolariseerd op een reeks van mogelijkheden. 17 , 18 , 19 PFE is van bijzonder belang voor de studie van oxidatie of reductie reacties gekatalyseerd door Redoxenzymen, zoals Interfaciale elektronen overdracht kan worden bereikt op een zeer hoog tempo. Bijvoorbeeld, werd de Verwerkingsfrequentie van de electrocatalytic van de nikkel-ijzer ([connectoren]) hydrogenase van Allochromatium vinosum gemeten door PFE als ca 1.000-10.000 s−1 voor H2 oxidatie. 20 de potentiële elektrode fungeert als een trigger om katalyse 'aan' of 'uit', en de huidige verslagen van electrocatalytic over de enzymactiviteit te zetten. PFE is dus een waardevolle methode voor het analyseren van de reactiviteit van complexe enzymen die nauw afhankelijk zijn potentieel, zoals de reacties van de di-strijkijzer actieve site van [FeFe]-hydrogenases met CO en O2,21 of potentieel-geïnduceerde de reacties van de inactivatie van22 koolmonoxide dehydrogenase,23 , hydrogenases en andere complexe Redoxenzymen. 24

De belangrijkste belemmering voor spectroscopische technieken te combineren met de directe elektrochemische besturing geboden door PFE vloeit voort uit de lage oppervlakte dekking van Redoxenzymen, over de volgorde van 1-2 pmol cm-2 voor de [connectoren] hydrogenase van A. vinosum, 20 ten opzichte van de in situ oppervlaktekunde studies van klein molecuul adsorbates op bulk metalen elektroden. Dit vormt een uitdaging voor de gevoeligheid van de spectroscopische meting. Verschillende spectroelectrochemical methoden zijn gemeld voor het bestuderen van geïmmobiliseerd redox eiwitten op een aantal verschillende elektroden: UV-zichtbaar spectroscopie op transparante metaaloxide-elektroden; 25 , 26 , 27 Fluorescentiespectroscopie op gouden elektroden; 28 , 29 oppervlakte verbeterde infraroodabsorptie (SEIRA) spectroscopie op gouden elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 en oppervlak verbeterd Raman spectroscopische technieken, hoofdzakelijk op zilveren elektroden. 34 , 35

Hier beschrijven we een methode voor het koppelen van PFE met IR spectroscopie, in een techniek die bekend staat als eiwit film infrarood elektrochemie (PFIRE). 36 de PFIRE methode bestudeert Redoxenzymen geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte koolstof werken elektrode in combinatie met een verzwakte totale reflectantie IR (ATR-IR) geometrie, benutting van het gemak van adsorptie van een reeks eiwitten op koolstof oppervlakken. IR spectroscopie is nuttig in studies van Redoxenzymen en eiwitten als vele kleine molecules, liganden en cofactoren diagnostische verticaal absorptie die kunnen worden gebruikt om bindende, remming, reactiviteit en redox toestand te beoordelen. Voorbeelden zijn bindend voor NO tot ijzer-zwavel centra,37 studie van flavoproteinen,38,39,40 klein molecuul te binden aan Heem centra enz. 41 de ATR-IR geometrie maakt de bouw van een geoptimaliseerde drie-elektrode (spectro) elektrochemische cel42 en daarom biedt uitstekende elektrochemische controle. Oplossing resistentie en mogelijke drift zijn geminimaliseerd door het plaatsen van een referentie-elektrode dicht bij de werken-elektrode. Hoge oppervlakte teller elektroden worden gebruikt die compatibel met hoge electrocatalytic stromingen geproduceerd door snelle enzym omzet op de elektrode werken zijn. Stroom van oplossing via de spectroelectrochemical cel biedt facile controle over de concentratie van substraten, inhibitors en pH. 36 , 43 , 44 de PFIRE methode kan daarom IR spectra te worden opgenomen in situ tijdens aanhoudende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE is ook geschikt voor het verstrekken van chemische informatie in de afwezigheid van katalytische huidige,43 in tegenstelling tot PFE waar het moeilijk is om informatie te extraheren uit niet-katalytische processen in Redoxenzymen kan zijn. 45 , 46

Wij hebben de methode van de PFIRE voor de studie van electrocatalytic H2 oxidatie aangetoond door [connectoren] hydrogenases, waarin intrinsieke CO en GN-liganden afgestemd op Fe op een bimetallic actieve site. 36 , 43 , 44 [connectoren] hydrogenases zijn dan ook bijzonder geschikt om te bestuderen door PFIRE. De methode PFIRE bevat informatie over de soorten die aanwezig tijdens steady-state omzet zijn, en biedt daarom cruciaal mechanistische inzicht naast de rijkdom van de literatuur op IR spectroscopie van hydrogenases zonder experimentele controle over omzet. 47 , 48 Dyer en collega's hebt gebruikt time-resolved IR methoden om te studeren van connectoren hydrogenases,49,50,51 met behulp van een licht trigger toe te passen of een kleine negatieve potentiële stap (via gebruik van oplossing bemiddelaars/mediators en de bron van een 'gekooide' elektron) of photolyse een afhankelijke hydride. Hoewel de PFIRE-methode kan niet, op dit moment tijd resolutie bieden aan deze metingen,40 doet het bestuderen van zowel reductieve en oxidatieve katalytische processen, geraadpleegd op een aantal duidelijk omlijnde potentieel toestaan en vrij van collectief vervoer beperkingen.

De methode PFIRE is verschillend van SEIRA studies van redox eiwitten, die ook de geometrie van een ATR-IR te gebruiken en een nanoschaal-geruwd metaalelektrode ter verbetering van de IR-absorptie van moleculen geadsorbeerd aan het oppervlak van de elektrode in dienst. 30 SEIRA is een uiterst waardevolle techniek voor het bestuderen van membraaneiwitten, in het bijzonder aan geadsorbeerde of binnen mimetische membraan platforms,32 maar de behoefte aan een metalen elektrode kunt beperken het toepassingsgebied van het substraat en remmer als gevolg van reactiviteit van het elektrode-steun ten behoeve van kleine molecules zoals CO, GN--, CO2 enz. Vermindering van de proton en desorptie van zelf geassembleerde enkelgelaagde kunnen worden op metalen oppervlakken op zeer negatieve potentieel problematisch, heeft1,52 hoewel enzym electrocatalysis op onbeschermde elektroden metalen gemeld. 53 , 54 een nadeel van PFIRE ten opzichte van SEIRA is de relatieve moeilijkheidsgraad van het opnemen van membraaneiwitten in native modus of mimetische membraan platforms. Echter, de relatieve chemische bestendigheid van de Koolelektroden concurrerende klein molecuul activering reacties maakt PFIRE een uitstekende techniek voor het bestuderen van enzym electrocatalysis, met name in het lage-potentieel domein relevant zijn voor biologische redox processen zoals proton vermindering door hydrogenases. 1 , 43

Het doel van dit artikel is om de methode van de PFIRE als een techniek voor het bestuderen van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, connectoren hydrogenase 1 (Hyd1) van Escherichia coli gebruiken als voorbeeld. Overwegingen voor de bereiding van de monsters, de behoefte goed substraat stroom en gegevensverwerking worden besproken. PFIRE is een breed toepasbare techniek, goed geschikt voor het bestuderen van eventuele redox-eiwit (met karakteristieke IR verticaal absorptie) dat kan worden geadsorbeerd op Koolelektroden, hetzij rechtstreeks of met behulp van oppervlakte modificatie, zodanig dat het elektronen met wisselen kan de elektrode.

Protocol

1. het herscheppen van het compartiment van de interne monster van een Spectrometer FTIR binnen een anaërobe, droge Glovebox en experimentele Algemeneeisen

  1. Gebruik een commerciële FTIR-spectrometer, uitgerust met een externe kwik cadmium telluride (MCT) detector en ATR accessoire. Zuiveren van het lichaam van de spectrometer met droge lucht of dinitrogen, of alternatief gebruiken een spectrometer met een geëvacueerd optische bank.
  2. Plaats de spectrometer op een stabiele, trillingsvrij tafel op dezelfde hoogte als een anaërobe (< 1 ppm O2), drogen (dauwpunt <-75 ° C) ' glovebox '. Doorschakelen van de IR-straal van de spectrometer liggen in de ' glovebox ', via een IR transparant venster dat is groot genoeg voor de intreepupil-straal.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de ruimte tussen de ' glovebox ' en een spectrometer ook gezuiverd of geëvacueerd, vooral als een hygroscopisch venster materiaal, zoals NaCl of KBr bijvoorbeeld wordt gebruikt.
  3. De interne monster compartiment van de spectrometer liggen binnen de ' glovebox ' repliceren.
    1. Direct de lichtbundel binnen de ' glovebox ' op een off-axis ellipsvormige spiegel, liefst met de dezelfde brandpuntsafstand als de interne focus spiegel van de spectrometer.
      Opmerking: Het is nuttig te beschikken over twee extra vliegtuig spiegels geplaatst voordat deze focus spiegel, zodat zowel de hoogte en de richting van de IR-straal worden aangepast binnen de ' glovebox '; Dit zal eventuele onjuistheden in de eerste plaatsing van de spectrometer gecompenseerd.
    2. Plaats een externe MCT-detector, compleet met een geschikt, zoals voor het repliceren van de afmetingen van het interne monster gericht optiek (zoals een korte brandpuntsafstand ZnSe lens, of off-axis parabolische spiegel, met een korte brandpuntsafstand) binnen de ' glovebox ', geplaatst compartiment van de spectrometer.
    3. Pas de 'focus' van de IR-straal te zijn ongeveer gelijke afstanden tussen de focus spiegel en de MCT-detector.
  4. Koel de dewar van de externe MCT-detector met vloeibare stikstof.
  5. Monteer de ATR-accessoire in de glovebox monster compartiment. De input en output gericht optica en ATR accessoire om maximale doorvoer naar de MCT-detector uitlijnen Gebruik indien nodig een diafragma of andere geschikte demping (zoals een draad rooster) om te voorkomen dat overbelichtingseffecten van het signaal van de detector.
    Opmerking: voor de hier gepresenteerde gegevens, een vijf-reflectie ATR accessoire met alle reflecterende optica en een verwijderbare trapeziumvormige Si interne reflectie element (IRE) wordt gebruikt (Crystal GmbH, afmetingen ca 5 × 8 × 1 mm3, face hoek 39,5 °). Het IRE is gemonteerd in een verwijderbare basisplaat gefreesd uit polyether ether keton (PEEK).
  6. Gebruik van een handschoenenkast naar het huis van de nieuwe monster compartiment met geschikte feedthroughs om verbinding met een extern gehuisvest potentiostaat (strakke BNC gasnetverbindingen nuttig zijn voor dit doel), gas access en kabel overbrengen van het signaal van de MCT detector. Het is belangrijk te behouden een afscherming van de kabel van de detector te vermijden introductie ruis- of interferentieniveau naar de maten.
  7. Plaats een peristaltische pomp, staat debiet meer dan 60 mL/min binnen de ' glovebox '. Een schematische weergave van de spectrometer, ATR accessoire, peristaltische pomp en potentiostaat setup is afgebeeld in Figuur 1.
  8. Bouw een spectroelectrochemical cel, als schematisch afgebeeld in Figuur 2, dat de zeehonden op de ATR accessoire. De cel moet bevatten een hoge oppervlakte teller elektrode (Pt draad of gaas), een aansluiting voor de werkende elektrode (carbon staaf) en een miniatuur referentie-elektrode. De cel moet ten minste twee verdere poorten als inlaat en uitlaat voor snelle stroom van oplossingen via de cel bevatten.
    Opmerking: Een miniatuur verzadigde kalomel referentie-elektrode is ideaal voor dit doel. 36

2. voorbereiding van de roet deeltjes bewerkt met E. coli Hydrogenase 1

  1. In een 'natte' anaërobe ' glovebox ', meng 20 mg hoge oppervlakte roet deeltjes (> 1000 m3/g) met 1 mL met zuiver water (soortelijke weerstand > 18 MΩ cm) in een microcentrifuge buis. Verspreiden van de deeltjes met het ultrasoonapparaat spaarstand (< 100 W) gedurende ten minste 15 minuten, of totdat de spreiding is uniform en niet sediment binnen 1 uur, niet geven een roet-dispersie met een lading van ongeveer 20 mg/mL.
  2. Neem een aliquoot gedeelte van E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ongeveer 50 µL, bereid volgens een gepubliceerde procedure55) met een concentratie van ~ 7 mg eiwit/mL en ruilen in een lage Ionische sterkte buffer met een pH dicht bij het elektrisch punt (voor in het volgende voorbeeld kalium fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout). Beste resultaten, gebruik een enzympreparaat die zo actief mogelijk is. Het uitvoeren van de uitwisseling van de buffer door concentratie en verdunning, in een centrifugaal filter-apparaat met een passende molecuulgewicht cutoff (50 kDa werkt goed voor Hyd1).
    1. De Hyd1 toevoegen aan de filter-apparaat.
    2. Verdun met ongeveer 450 µL van exchange buffer.
    3. Reconcentrate met een volume van 50 µL met milde centrifugeren (< ~ 2700 × g) om te voorkomen dat onherstelbare neerslag.
    4. Herhaal de stappen 2.2.2 en 2.2.3 om buffer exchange is voltooid (meestal binnen ~ 5 cycli).
  3. Meng een deel van de 5 µL van 20 mg/mL roet dispersie (bereid in 2.1) met de 50 µL hoeveelheid Hyd1 buffer-uitgewisseld. Sla het enzym-deeltje mengsel in een ijskast (bij 0 ° C) 's nachts zodat het enzym te adsorberen. Mogelijk moet schud het mengsel af en toe om ervoor te zorgen dat de deeltjes blijven verspreid.
  4. De Hyd1 gemodificeerde deeltjes met lage Ionische sterkte buffer (kalium, fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout) wassen door opeenvolgende cycli van sedimentatie en opnieuw dispersie in een microcentrifuge (~ 2700 × g). Herhaal dit proces 3 - 5 keer voor het verwijderen van niet-geadsorbeerde enzym.
    Opmerking: Voordat u de eerste was het supernatant moet vrijwel kleurloos, die goede adsorptie van enzym aangeeft.
  5. Het concentreren van de deeltjes tot een eindvolume van ~ 5 µL, het geven van een definitieve laden van ~ 20 mg/mL van enzym gemodificeerde deeltjes.
    Opmerking: De Hyd1 gemodificeerde deeltjes kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal twee weken als ze gehydrateerd blijven; Dit is het best bereikt door te slaan deeltjes verdund met ~ 50 µL van met zuiver water.

3. voorbereiding van de PFIRE metingen op E. coli Hydrogenase 1

  1. Het IRE Si schoon met het lage-aangedreven ultrasoonapparaat (< 100 W), eerst in H2dus4 (< 90% w/w) voor ~ 15 min en vervolgens in HNO3 (70% w/w) voor maximaal 1 uur. Deze schoonmaak procedure moet leiden tot een hydrofiele IRE oppervlak. Als verdere reiniging vereist is het IRE in piranha-oplossing kan worden geplaatst (een verhouding 1:3 H2O2: H2SO4) om te oxideren van eender welk resterende organisch materiaal.
    Opmerking: Harde zure reinigingsmethoden wellicht niet geschikt voor gebruik met alle materialen van het IRE. Piranha-oplossing is zeer corrosief en een sterke oxidator, oppervlakken moet redelijk schoon voordat gebruik van piranha-oplossing en zorg moet worden genomen tijdens de bereiding en het gebruik van piranha-oplossing het exotherme karakter van het proces - altijd toevoegen H2O 2 langzaam aan H2SO4 en verwijzen naar de juiste veiligheidsprocedures voor voorbereiding, gebruik en verwijdering.
  2. Spoel de schone IRE in met zuiver water en drogen onder een stroom van droog stikstofgas. Verrichten alle prisma behandeling met behulp van schone pincet om verontreiniging te voorkomen.
  3. Het IRE zegel in de ATR accessoire basisplaat met behulp van een dunne strook van elektrische-grade silicone sealant. Zorg voor het beperken van het afdichtmiddel aan de randen van het IRE. Laat het afdichtmiddel volledig drogen.
  4. De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de spectrometer ' glovebox ' en dit op de ATR-accessoire koppelen. Maatregel een referentiespectrum (achtergrond) tussen 4000-1000 cm-1 op 4 cm-1 resolutie, met behulp van de standaard snelle scan modus van de spectrometer en 1024 gemiddelde interferograms (meting tijd ~ 3-5 min). Gebruik dit spectrum als input voor berekening van de extinctie spectra verderop in het experiment.
    Opmerking: Als gevolg van de kleine extinctie verwacht voor de Hyd1 actieve site is het noodzakelijk om te verzamelen van spectra met hoog signaal ruis verhouding.
  5. De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de 'natte' glovebox waarin de vooraf bereid Hyd1 gemodificeerde deeltje dispersie (sectie 2). Drop-cast een hoeveelheid van 1 µL van de spreiding van de deeltjes op het grote gezicht van het IRE, en ze gelijkmatig over het oppervlak. Opmerking: De deeltjes worden volledig droog op het IRE niet toegestaan.
  6. Knip een stukje van carbonpapier, zoals die gebruikt als gas verspreiding laag materiaal in brandstofcellen, naar een grootte ~0.1 mm kleiner dan de oppervlakte afmetingen van het IRE (d.w.z. ca. 8.2 × 4.9 mm2). De oppervlakte van het carbon papier moet groot genoeg zijn ter dekking van de drop-cast Hyd1 gemodificeerde deeltjes, maar niet zo groot over overlappen de siliconen-sealant gebruikt voor het beveiligen van het IRE. Geniet van het carbon papier in water en zachtjes plaats deze over de bovenkant van de deeltjes film. Het carbon papier levert een goede elektrische verbinding over de hele deeltje film.
    Opmerking: Het is gunstig voor het bereiden van verschillende soorten carbonpapier op voorhand en sla ze vooraf gedrenkt in met zuiver water binnen de 'natte' anaërobe ' glovebox '.
  7. Monteren van de cel van de spectroelectrochemical (beschreven in 1.7 en schematisch afgebeeld in Figuur 2) over het IRE, veilig in de basisplaat met schroeven. Voeg ~ 200 µL van de experimentele buffer te houden van het enzym gehydrateerd. Een gemengde buffersysteem, dat kan bufferen over een breed pH-bereik, is handig voor studies over connectoren hydrogenases:56 Natriumacetaat, 2-[N'-morfolino] ethaan-Sulfonzure zuur (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[2-ethaan-Sulfonzure zuur] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] methyl-3-amino-propaan-Sulfonzure zuur (kranen), en 2-[N'-cyclohexylamino] ethaan-Sulfonzure zuur (CHES), met elk onderdeel op een eindconcentratie van 15 mM en 0,1 M met NaCl als ondersteunend elektrolyt, met pH aangepast aan de pH 6 met behulp van geconcentreerd NaOH en HCl.
    Opmerking: De elektrode werkende verbinding moet iets uitsteken onder het vlak van de spectroelectrochemical cel top (~0.1 mm) om goede elektronische verbinding met het carbonpapier (Figuur 2).
  8. De oplossing inlaat en uitlaat van de cel van de spectroelectrochemical verbinden met een stroomsysteem met peristaltische pomp slang en een flesje van de experimentele buffer. De samengestelde cel overbrengen in de 'droge' glovebox met de spectrometer.
  9. Monteer het spectroelectrochemical cel op de ATR-accessoire. Sluit de werken, de teller en de referentie-elektroden aan de potentiostaat. Sluit de peristaltische pomp slang aan de pomp.
  10. Een extinctie spectrum met 1024 gemiddeld interferograms bij 4 cm-1 resolutie opnemen over een spectrale serie van 4.000-1000 cm-1, met behulp van het spectrum verzameld in 3.4 als een referentie/achtergrond. Op dit punt het spectrum moet bevatten belangrijke (> 100 mO.D.) amide II banden op ~ 1,540 cm-1 en actieve site bands van Hyd1 moeten blijken in de spectrale regio 1.850-2,150 cm-1, grotendeels in geoxideerde, inactieve staten (Figuur 3 ).

4. de activering van E. coli Hydrogenase 1 en testen van de Spectroelectrochemical-cel

  1. Een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op de film Hyd1 gemodificeerde deeltje. Verzadigen de experimentele buffer met H2 en stroom buffer langzaam door de spectroelectrochemical-cel. Laat het monster overnachting volledig activeren de Hyd1.
    Opmerking: Het is belangrijk te gebruiken anaërobe H2, N2 enz., en dus alle anaërobe gassen moeten worden doorgegeven door een O2 filter.
  2. Record een spectrum van de extinctie van het monster na activering. Een verdeling van verminderde, 'actief' Staten moeten nu worden weergegeven door de νCO en vCN bands voor de actieve site. Dit wordt meest gemakkelijk waargenomen door het gebruik van het spectrum van een verschil, ten opzichte van het spectrum opgenomen in 3.10 (Figuur 4).
  3. Test de elektrische verbinding van de cel spectroelectrochemical. Om dit te doen, door de experimentele buffer te verzadigen met N2 gas. Toepassen van een reeks oxiderende (0 V vs SCE) en vermindering van de (−0.8 V vs SCE) mogelijkheden (van ca 30 min duur) voor de film Hyd1 gemodificeerde deeltje en neem een spectrum van de extinctie bij elk programma. De Hyd1 moet worden snel geoxideerd verminderd en als de film deeltje goed verbonden is 100% van het monster moeten reageren op de toegepaste potentieel.
  4. Het instellen van een juiste debiet van de experimentele buffer. Om dit te doen, een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op het monster en de experimentele buffer te verzadigen met H2. Opnemen van een serie van cyclische voltammograms tussen-0.707 - 0.039 V vs SCE op een scansnelheid van 10 mV/s. Verhoog geleidelijk het debiet van H2-verzadigde buffer tussen voltammograms tot de katalytische waveshape op die op een vlakke roterende lijkt disc elektrode55 en de maximale stroom is onafhankelijk van debiet (Figuur 5).
    Opmerking: De oplosbaarheidsgrens van H2 in water is ~0.8 mM bij 293 K en 1 bar.
  5. Als het monster nu klaar voor PFIRE metingen is, verzamelen spectra op een scala aan mogelijkheden, onder een aantal voorwaarden van de oplossing (pH, temperatuur, H2 concentratie enz.). Alle elektrochemische gegevens met behulp van de software van de potentiostaat, want het is belangrijk om het correleren van spectroscopische en elektrochemische gegevens, met name bij de studie van electrocatalytic processen zoals H2 oxidatie door Hyd1 te kunnen opnemen.

5. spectroscopische gegevens behandeling

  1. Bevestigen dat de actieve site niet permanent veranderd in de loop van de metingen door het opnemen van spectra op 0 V en −0.8 V vs SCE aan het einde van het experiment. Deze moeten identiek zijn aan de spectra opgenomen in 4.3, en geen verlies van actieve site moet worden waargenomen tijdens de meting (Figuur 6).
  2. Absolute extinctie spectra van de spectrometer software in een geschikt formaat exporteren (.csv, ASCII, 'matlab", Jcamp etc.) voor verwerking met behulp van software zoals oorsprong of Matlab.
  3. Basislijn corrigeren de gegevens, met behulp van het proces geïllustreerd in Figuur 7.
    1. Het bereik 1.800-2,150 cm-1, de tweede afgeleide van elk extinctie spectrum deelnemen teneinde kleine (< 1 mO.D.) actieve site bands tegen de achtergrond van zeer-gebogen water.
    2. Basislijn marker punten plaats op het oorspronkelijke extinctie spectrum en stel de punten ' snap ' tot de experimentele spectrum.
    3. Past een basislijn door de punten met behulp van een geïnterpoleerde kubieke spline functie of een polynomiale functie. Deze functie van de basislijn van de experimentele gegevens aftrekken.

Resultaten

Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de experimentele regeling van de spectrometer, ' glovebox ', ATR-accessoire, potentiostaat en gas-stroomsysteem gebruikt voor metingen van de PFIRE. Figuur 2 toont een vertegenwoordiger die tekening van de spectroelectrochemical-cel.

Figuur 3 toont extinctie spectra van drop-cast Hyd1 gemodificeerde deeltjes, met de experimentele buffer (een gemengde buffersysteem, zoals beschreven in 3.7, pH 6.0) stroomt door de spectroelectrochemical-cel. De oppervlakte dekking van Hyd1 is bijzonder hoog in het voorbeeld in Figuur 3, met een amide II band intensiteit van ~ 235 mO.D. en minimale 'bulk' water zoals blijkt uit de omvang van de O-H uitrekkende regio (~ 3.000-3.600 cm-1) ten opzichte van de band op ~ 1640 cm-1, oftewel een convolutie van het amide ik band van Hyd1 en de water H-O-H-bocht. Extra banden als gevolg van het eiwit kunnen worden gezien in de C-H uitrekkende regio (ca 2900 cm-1). De brede band gecentreerd rond 2100 cm-1 is een band van de combinatie van de H-O-H buigende trillingen met een set van lagere energie libratie banden, die beperkt rotaties van H2O moleculen als het gevolg van de waterstof binding netwerk in vloeibaar water zijn. De νCO band van de geoxideerde, inactief, Ni-B staat voor de actieve site is duidelijk op 1,943 cm-1, zelfs zonder de correctie van de basislijn, en νCN functies zijn duidelijk zichtbaar tussen 2,050-2.100 cm-1 . Bij hoge Hyd1 dekkingen, veel van de microporeuze structuur van de carbon zwart film57 door enzym wordt geblokkeerd en daarom de 'bulk' water concentratie tijdens de PFIRE metingen wordt verlaagd.

De spectra in Figuur 3 blijkt dat vóór activering, Hyd1 films bevatten Hyd1 in geoxideerde, inactieve staten. Activering overnachting op −0.8 V vs SCE onder een H2 atmosfeer leidt tot vorming van verminderd, catalytically actieve statussen, zoals aangetoond in Figuur 4 , waaruit een geactiveerde (lagere) minus (geoxideerd) verschil als voorbereid spectrum blijkt van Hyd1. Verschil spectra van Hyd1 kunnen duidelijk worden geïnterpreteerd met behulp van de νCO regio. Elke unieke status van de actieve site heeft slechts één CO band vergeleken met twee CN bands en is daarom de νCN regio intrinsiek meer ingewikkeld, met vele overlappende bands. Het spectrum van het verschil in Figuur 4 ziet u dat activering leidt tot verlies (negatieve absorptie banden) van geoxideerd, inactief Ni-B en een kleine hoeveelheid Ni-SI (de meest geoxideerde 'actief' staat) die aanwezig is in de film Hyd1-bereid was. Deze worden vervangen door 'actief' Staten van Hyd1; Ni-C, Ni-R en Ni-L. Merk op dat er twee vormen van zowel de Ni-R en valt bestuurlijk gezien onder Ni-L, zoals blijkt uit de twee νCO bands waargenomen voor deze soorten in Figuur 4. De observatie van meerdere toestanden van de Ni-R en Ni-L is in overleg met de hydrogenases van andere connectoren. 48 , 58 , 59

Een zeer belangrijke controle van de PFIRE-methode is dat de cyclische voltammograms vastgelegd van Hyd1 binnen de spectroelectrochemical stroom cel show vergelijkbare katalytische waveshapes die geregistreerd op een vlakke elektrode voor roterende schijf. 55 in de praktijk betekent dit dat de massatransport van substraat (H2) en product (H+) aan/uit geïmmobiliseerdet Hyd1 in de spectroelectrochemical-cel efficiënt in het debiet gebruikt tijdens de PFIRE metingen is. Het effect van debiet op de katalytische waveshape is afgebeeld in Figuur 5, waarin opeenvolgende voltammograms opgenomen onder een H2 atmosfeer (1 bar), zoals het debiet van de oplossing via de spectroelectrochemical-cel wordt verhoogd. In alle gevallen de overspanning voor H2 oxidatie door Hyd1 is identiek (rode grijze rechthoek), maar de mate van oxidatieve inactivering (hysteresis tussen de huidige tijdens de oxiderende en reducerende veegt op potentieel boven ca 0 V vs SCE) en de huidige maximale H2 oxidatie zijn afhankelijk van het debiet van de oplossing. Op debiet boven 52 mL/min (licht grijze voltammogram) de katalytische waveshape ongevoelig voor verdere is verhoogt debiet.

Figuur 6 vergelijkt de relatieve intensiteiten van de νCO band van de Ni-B staat na initiële activering en anaerobe re-oxidatie op 0 V vs SCE (onder een Ar-sfeer, zoals beschreven in 4.3) en anaerobe oxidatieve inactivatie onder een Ar sfeer op 0 V vs SCE na 48 hr continu experimenten (zoals beschreven in punt 5.1). Geen verlies van actieve site band intensiteit wordt waargenomen tijdens de meting, en alle monster van de Hyd1 reageert op de toegepaste mogelijkheden.

Figuur 7 ziet u de basislijn correctieprocedure werd ingeleid in dit werk gebruikt. Het absolute spectrum van het monster van de Hyd1 in de actieve site regio (Figuur 7een) bevat belangrijke kromming als gevolg van water. De verplichting tot het gebruik van water als oplosmiddel is echter een probleem voor de meeste toepassingen van IR spectroscopie in de biowetenschappen. De tweede afgeleide van het absolute spectrum (Figuur 7,b), berekend aan de hand van oorsprong software met Savitsky-Golay vloeiend maken over een 9 punt-venster, kan worden gebruikt om te identificeren scherpe banden van de Hyd1 actieve site tegen de gebogen achtergrond. De identificatie van geschatte piek posities met behulp van een tweede afgeleide spectrum kunt basislijn ankerpunten worden geplaatst in het absolute spectrum regio's die vrij van actieve site bands (cirkels in Figuur 7een zijn). Een kubieke spline functie is vervolgens via deze ankerpunten op een basislijn functie maakt die vervolgens kan worden afgetrokken van het absolute spectrum te geven van een basislijn-gecorrigeerde spectrum met alleen de pieken die voortvloeien uit de Hyd1 actieve site (Figuur 7 gemonteerd c).

Figuur 8 toont de resultaten van een meting van de PFIRE op Hyd1, onder zowel niet-omzet (Ar sfeer) omzet (H2 sfeer) op een scala van mogelijkheden. 36 de huidige-tijdweergave sporen (Figuur 8een) verslag over de katalytische stroom bij elk potentieel toegepast en blijven dicht bij nul huidige voorwaarden niet-omzet (Ar sfeer). De gedeeltelijke spectroelectrochemical redox titratie in Figuur 8b dus verslagen over het gedrag van de redox evenwicht van de actieve site, waarin de verdeling van Staten verwacht op elk potentieel in de afwezigheid van katalytische omzet. De spectra in Figuur 8c werden geregistreerd onder omzet voorwaarden (onder een H2 atmosfeer) en daarom vertegenwoordigen de verdeling van de stationaire toestand van actieve site staten aanwezig tijdens katalytische oxidatie van H-2 door Hyd1. Dat de steady-state omstandigheden zijn bereikt wordt bevestigd door het feit dat de katalytische H2 oxidatie huidige (Figuur 8een, H2) constant is als functie van de tijd op −0.199 V en −0.074 V vs ze blijft; het monotone verval in stroom bij +0.356 V vs , ze te wijten aan de bekende anaërobe oxidatieve inactivering van Hyd1 is. 55 de verdeling van de actieve site staten is duidelijk verschillend onder Ar en H2 op alle mogelijkheden waar Hyd1 presteert katalyse (Figuur 8b, spectra op −0.199, −0.074 en +0.356 V vs ze). De spectra opgenomen onder Ar en H2 zijn vrijwel identiek op −0.594 V vs zij, echter, en dit is een belangrijke test van experimentele consistentie; Hyd1 vermindert niet H+ met een aanzienlijke snelheid bij pH 6.0 (de huidige in Figuur 8een onder zowel de Ar en de H2 is dicht bij nul) en de spectra op −0.594 V wordt daarom verwacht dat hetzelfde.

Figuur 9 toont de anaërobe oxidatieve inactivering van Hyd1 via de vorming van Ni-B van Ni-SI tijdens H2 oxidatie op +0.356 V.36 Spectra werden opgenomen tijdens de grijze tijdsintervallen aangetekend op de huidige-tijdweergave trace in Figuur 9een. −0.074 V Hyd1 geen oxidatieve inactivatie ondergaan en de verdeling van de actieve site staten blijft constant gedurende de gehele potentiële stap. Dit is aangetoond door de spectra in Figuur 9bi, die rapporteert het absolute basislijn-gecorrigeerde spectrum aan het begin van de −0.074 mogelijke stap en Figuur 9bii die werd opgenomen in een later tijd tijdens de potentiële stap en wordt gerapporteerd als een spectrum van verschil ten opzichte van Figuur 9bik. De spectra in Figuur 9biii en biv zijn ook gemeld als verschil spectra ten opzichte van figuur 9biken geleidelijke omzetting van Ni-SI met Ni-B tijdens hoge potentiële weergeven inactivatie, consistent met de monotone daling in huidige vertoond op de V +0.356 in Figuur 9een.

Spectra opgenomen in een bereik van pH van de oplossing geven inzicht in de proton-overdracht stappen tijdens de katalytische Hyd1 cyclus. 43 Figuur 10 een toont PFIRE spectra opgenomen op dezelfde Hyd1 film bij pH 3.0 en pH 9.0, met behulp van oplossing stroom in de spectroelectrochemical-cel om te wisselen van de experimentele buffer. De relatieve concentraties van de Ni-C en Ni-L Staten zijn duidelijk verschillend in deze twee spectra. Door het variëren van de toegepaste potentieel onder niet-omzet voorwaarden stelt de potentiële afhankelijkheid van de netwerkkaart en Ni-L kan snel worden bepaald op een bereik van pH-waarden (Figuur 10b), en beide Staten blijken te zijn isopotential over een breed pH-bereik. (Merk op dat de piek verticaal absorptie in Figuur 10b toont alleen de Ni-C en Ni-L Staten voor de duidelijkheid, volledige redox titraties van Hyd1 zijn gemeld door Hidalgo et al.) 36 een pH titratie van de concentraties van Ni-C en Ni-L kan vervolgens worden geëxtraheerd, nemen de extinctie van de piek op potentieel waar de totale concentratie van Ni-C en Ni-L op zijn maximum bij elke pH (Figuur 10c). Op deze manier, en in combinatie met gegevens van de EPR, is een pH evenwicht tussen de Ni-C en valt bestuurlijk gezien onder Ni-L werd geïdentificeerd. 43

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de regeling van IR-spectrometer, anaërobe glovebox, ATR accessoire, MCT detector, gas-stroomsysteem en potentiostaat gebruikt voor metingen van PFIRE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: Schematisch diagram van de cel van de spectroelectrochemical die wordt gebruikt voor metingen van de PFIRE, waaruit blijkt dat de regeling van de elektroden oplossing inlaat/uitlaat verbindingen. De cel- en basisplaat zijn gefreesd uit polyether ether keton (PEEK), met schroefgaten voor een carbon staaf werken elektrode verbinding, Pt draad teller elektrode, verzadigde kalomel referentie-elektrode, en oplossing inlaat en uitlaat. De verzadigde kalomel referentie elektrode bouw is zoals eerder gemeld. 36 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: absorptie spectrum van Hyd1 gemodificeerde roet deeltjes, gestort op het IRE en gerehydrateerd met buffer. De posities van de amide die ik band, amide II band en Hyd1 actieve site regio worden weergegeven, samen met extra functies als gevolg van C-H uitrekkende trillingen en oplosmiddel water. De inzet toont een vergrote weergave van de actieve site-regio, met de vCO en vCN bands label. 'Als voorbereid' deeltjes bevatten Hyd1 voornamelijk in de geoxideerde, inactief Ni-B staat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4 : Activering van de Hyd1 op −0.8 V vs SCE onder een H2 atmosfeer, gepresenteerd als een verminderde minus geoxideerde verschil spectrum. Bij lage potentiële activering geoxideerd, converteert inactieve Ni-B (en een kleine concentratie van Ni-SI) naar meer verminderd, actieve Staten Ni-C, Ni-R en Ni-L. Merk op dat Hyd1 twee verschillende sub Staten Ni-L en Ni-R. heeft Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5 : Het effect van het debiet van de oplossing op de waveshape van katalytische cyclische voltammograms vastgelegd in de cel spectroelectrochemical. Voltammograms werden opgenomen in de toenemende stroomsnelheid van H2-verzadigd buffer zoals aangegeven. Een snelheid van 20 mL/min (rood) toont de voltammogram aanzienlijke inactivatie boven 0 V vs ze op de voorwaartse scan. Op debiet boven 52 mL/min is de omvang van de inactivatie enorm lager en de huidige is onafhankelijk van debiet op alle mogelijkheden. Andere parameters: 1 bar H2, 10 mV/s scanfrequentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-6
Figuur 6 : Basislijn gecorrigeerd IR spectra in de actieve site νCO regio van geoxideerd, inactief Ni-B staat op 0 V vs SCE. Er is geen meetbare verlies van actieve site intensiteit gedurende 48 uur continumetingen van de PFIRE, en daarom de Hyd1 krachtig op de roet deeltjes is geadsorbeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-7
Figuur 7: Details van de basislijn correctie methoden voor gegevensverwerking. Basislijn ankerpunten worden geplaatst op het spectrum van de absolute absorptie in de actieve site regio (een), verzorgen om te voorkomen dat eventuele νCO en νCN pieken geïdentificeerd door een tweede afgeleide analyse (b). Het resulterende gecorrigeerde spectrum van de basislijn wordt weergegeven in (c). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-8
Figuur 8: PFIRE metingen op Hyd1 onder niet-omzet (Ar) omzet (H2). (een) huidige-tijdweergave sporen van Hyd1 in de cel van de spectroelectrochemical in Ar-verzadigd (grijs) en H2-verzadigde (zwart) buffer; (b), (c) PFIRE-spectra tonen de νCO regio op elk potentieel onder Ar (b) en H2 (c). Potentieel geciteerd in V vs ze. Overgenomen met toestemming van Hidalgo et al. 35 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-9
Figuur 9: Anaërobe inactivatie van Hyd1 via vorming van Ni-B van Ni-SI. (een) huidige-tijdweergave trace onder een H2 atmosfeer, met een stabiele electrocatalytic op −0.074 V en langzame anaërobe inactivatie (monotone afname in huidige) +0.356 V vs ze. (b) Spectra opgenomen tijdens de grijze gearceerde gebieden gemarkeerd (a). Spectrum bik is een basislijn gecorrigeerde spectrum opgenomen aan het begin van de −0.074 V potentiële stap. Spectrum bii, opgenomen op een later tijdstip tijdens de −0.074 V stap, is gerapporteerd als een spectrum van verschil ten opzichte van bik en laat zien dat geen verandering in de verdeling van de actieve site staten optreedt, consistent met de stabiliteit van het potentieel op −0.074 V. Spectra biii biv worden ook gemeld als verschil spectra ten opzichte van bik en geleidelijke omzetting van Ni-SI met Ni-B tijdens anaërobe inactivatie Toon op +0.356 V vs ze. Overgenomen met toestemming van Hidalgo et al. 35 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-10
Figuur 10 : Spectra opgenomen in een bereik van pH van de oplossing geven inzicht in de proton-overdracht stappen tijdens de katalytische cyclus van Hyd1. (een) IR spectra tonen de νCO regio van Hyd1, opgenomen in pH 3.0 (-54 mV vs ze) en pH 9.0 (-334 mV vs ze). (b) Spectroelectrochemical titraties werden uitgevoerd om te bepalen van het potentieel waartegen de Ni-C en Ni-L concentraties maximaal op een bereik van de waarden van de pH van de oplossing zijn. Alleen de Ni-C en Ni-L concentraties worden weergegeven voor de duidelijkheid, voor een volledige spectroelectrochemical titratie van Hyd1 Zie Hidalgo et al. 36 (c) de afhankelijkheid van de pH van de relatieve concentratie van Ni-C en Ni-L, zoals bepaald door een reeks experimenten zoals die worden weergegeven in (b). Spectra werden geregistreerd bij 20 ° C. Aangepast met toestemming van Murphy et al. 42 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

PFIRE is een breed toepasbare IR spectroscopische techniek voor de aanpak van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten. In het bijzonder, kunnen electrocatalytic reacties van Redoxenzymen worden gesondeerd omstandigheden snel omzet. De PFIRE methode bouwt voort op de directe elektrochemische besturing geboden door de techniek van PFE, die geeft geen directe structurele informatie, en het koppelt aan IR spectroscopie op een koolstof-elektrode. De PFIRE benadering dus voegt chemische inzicht om de beschikbare informatie uit elektrochemie alleen en is zeer geschikt voor het bestuderen van redox eiwitten en enzymen betrokken bij klein molecuul bindende en activering. Bovendien bieden PFIRE informatie over potentieel-afhankelijke structurele veranderingen in de eiwitten in de afwezigheid van katalytische omzet. Dergelijke niet-omzet elektron overdracht gebeurtenissen zijn vaak moeilijk op te sporen met behulp van de 'standaard' toepassingen van PFE, hoewel de uitbreiding van PFE tot Fourier-getransformeerd AC voltammetrie is gebruikt met succes. 45 , 46

De PFIRE-methode is in principe geschikt voor de studie van elke redox-eiwit dat kan worden bestudeerd met behulp van PFE. Daarom, zoals bij PFE, eiwit adsorptie is een cruciale stap voor een succesvolle PFIRE experiment. In dit protocol beschrijven we een toepassing van de techniek van de PFIRE met behulp van E. coli Hyd1 als een case-studie. 36 , 43 echter we hebben ook toegepast de PFIRE-techniek op de cytoplasmatische regelgevende hydrogenase van R. eutropha,44 en flavine mononucleotide geadsorbeerde op carbon zwart. 40 in al deze gevallen biedt eenvoudige fysische adsorptie aan ongewijzigde hoge oppervlakte roet (zoals beschreven in dit Protocol) een oppervlak dekking van eiwit dat hoog genoeg is om goede kwaliteit IR spectra met een hoge signaal-/ ruisverhouding. In gevallen waarin dergelijke hoge mate van adsorptie kunnen niet worden bereikt kunnen moet het oppervlak van de koolstof deeltjes, bijvoorbeeld voor het toestaan van covalente gehechtheid van eiwitten aan het oppervlak van de elektrode te wijzigen. 60 , 61 , 62 het gebruik van een handschoenenkast voor metingen van de PFIRE is alleen strikt noodzakelijk als monstes dat anaëroob moet worden behandeld. Echter in de praktijk de zeer constante en lage (< 80 ° C dauwpunt) niveaus van waterdamp die worden geboden door de ' glovebox ' sfeer geven hoge signaal-ruis-waarmee de winning van zeer kleine verticaal absorptie. 44 in veel gevallen een anaëroob milieu, zoals dat verstrekt door de ' glovebox ', is ook wenselijk voor de elektrochemische meting (integraal deel uitmaakt van de PFIRE techniek) om te voorkomen dat de huidige vanwege O2 vermindering op de elektrode werken.

IR verticaal absorptie als gevolg van bulk water, experimentele buffers en de koolstof deeltjes waarop het monster is geadsorbeerd alle aanzienlijk bijdraagt aan de experimentele spectra en kunnen elkaar overlappen bands van belang, met name in het amide I, II en III-regio's van de spectrum. 63 de amide-regio bevat ook gegevens uit biologische soorten zoals flavins of cofactoren nicotinamide, evenals de substraten en producten van vele reacties van oxidatie en reductie. In het geval van connectoren hydrogenases, νCO en νCN bands van de actieve site vallen in een relatief duidelijk deel van het spectrum en zo de PFIRE-techniek is zeer goed geschikt voor de studie van deze enzymen. In andere gevallen echter kunnen verschil spectra in combinatie met isotopische etikettering benaderingen nodig zijn om isoleren van veranderingen als gevolg van de geïmmobiliseerdet proteïne. Soortgelijke benaderingen zijn gebruikt, bijvoorbeeld Protonering om veranderingen te identificeren, structurele herschikkingen en te bestuderen of Michaelis-Menten complexen met behulp van IR spectroscopie. 64 , 65 , 66 PFIRE is dan ook niet, beperkt tot de studie van hydrogenases maar kan worden toegepast op elke redox-eiwit dat bevat (of waarvan substraten, de producten of de remmers bevatten) groepen met diagnostische IR-actieve trillingen; koolmonoxide dehydrogeanses nitrogenases67 ,68,,14 flavoproteinen,40 en formate dehydrogenases, bijvoorbeeld.

De verwante techniek, SEIRA, is zeer goed geschikt voor de studie van membraan-geassocieerde eiwitten in een biomimetische omgeving. 32 SEIRA is een aanpassing van de IR spectroscopie, dat ook een ATR-IR-configuratie gebruikt, en maakt gebruik van een verhoging van de oppervlakte-effect dat de IR-absorptie van moleculen gelegen dicht bij (binnen een paar nm versterkt) van het oppervlak van het ATR-prisma (IRE). SEIRA is dan ook prachtig gevoelig voor spectrale veranderingen die zich voordoen binnen de geadsorbeerde eiwitten en membraan architectuur en is relatief vrij van concurrerende signalen van oplosmiddel en substraten/remmers presenteren in oplossing. Dit is enigszins in tegenstelling tot de techniek van de PFIRE die hier worden beschreven, die gebaseerd op een aanzienlijk grotere indringingsdiepte boven het oppervlak van het IRE is (~ 1 µm), wat betekent dat PFIRE gevoeliger voor substraten is, producten of remmers presenteren in oplossing. Deze verhoogde gevoeligheid voor 'bulk' oplosmiddel kan nuttig zijn; Als het substraat of product worden rechtstreeks door IR waargenomen kan, verslag PFIRE spectra over beide steady-state kinetiek van langlevende actieve soorten en bijbehorende productvorming tijdens electrocatalysis. 69 de mogelijkheid om te observeren steady-state concentratie van substraat en product zullen met name waardevol voor enzymen zoals koolmonoxide dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van CO-CO2, een sterke IR-absorber) of formate dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van formate CO2).

Op dit moment is de PFIRE beperkt tot steady-state kinetische studies van enzym electrocatalysis als gevolg van de macroscopische Koolelektroden gewend 'concentreren' het enzym op het oppervlak van een IRE voor het verzamelen van de gegevens in en ATR-IR geometrie. In dit opzicht zijn PFIRE studies van connectoren hydrogenases complementair aan het werk van Dyer en medewerkers,49,50 , die gebruik maken van licht-geactiveerd voorbijgaande absorptie IR spectroscopie te bestuderen sub omzet kinetiek. Er wordt gewerkt aan de spectroelectrochemical cel,40 miniaturize en met het gebruik van microelectrodes tijd resolutie over de volgorde van microseconden moet haalbaar zijn. Dit maakt studie van sub omzet kinetiek voor enzymen met omzet frequenties tot ca 100-500 s-1, en de studie van zowel reductieve en oxidatieve processen in staat zal stellen.

PFIRE is over het algemeen een spectroscopische techniek waarmee chemische karakterisering van electrocatalytic reacties van Redoxenzymen steady-state omstandigheden. De aanpak van de PFIRE maakt het mogelijk meerdere chemische en elektrochemische titraties worden uitgevoerd op hetzelfde enzym monster, zoals de hoge oppervlakte elektroden gebruikt een robuuste adsorptie van eiwit bieden en de geometrie van de ATR-IR mogelijk facile oplossing te wisselen maakt. De mogelijkheid voor het verzamelen van dergelijke structurele informatie in situ tijdens enzym functie is een waardevol instrument voor de bredere gemeenschap van de bioelectrochemistry.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Dankbetuigingen

Het werk van K.A.V. en P.A.A. werd gesteund door de European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), de Engineering and Physical Sciences Research Raad IB katalysator award EP/N013514/1, en de biotechnologie en de biologische onderzoek van Wetenschappen Raad (BB/L009722/1 en BB/N006321/1). R.H. werd gesteund door Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, en Lincoln College, Oxford. De auteurs erkennen Mr. Charlie Jones, Mr Charlie Evans en personeel van de mechanische Workshop (Department of Chemistry) voor hulp bij het ontwerp en de vervaardiging van spectroelectrochemical cellen die worden gebruikt in dit werk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SpectrometerAgilent680-IRmet een externe MCT-detector
ATR-accessoirePike TechnologiesGladiATRAangepast voor gebruik met een 5-reflectie Si IRE
HandschoenenkastGlove Box Technology Ltd.N/AOp maat ontworpen 'nat' en 'droog' kast voor anaërobe monsterbehandeling en meting
KBr-vensterCrystranAangepastOm koppeling van de handschoenenkast met de externe straal van de FTIR-spectrometer mogelijk te maken
Aanvullende optiekAgilentN/AComponenten van een PM-IRRAS-accessoire
Silicium IRECrystal GmbHAangepastTrapezium: 8,4 mm x 5 mm (grote zijde), 1 mm dikte, ca 39 graden gezichtshoek
PotentiostatMetrohmAutolab PGSTAT 128N
Nova 10.1MetrohmSoftware voor het besturen van de potentiostat
PeristaltiekpompWilliamson Manufacturing Company LtdQL-1000-024-300
Pt-draadSurepure Chemetals327299,95% Zuiver platinadraad, 0,014 inch diameter
KoolstofstaafWH Smith307292090,7 mm HB potloodspits
RutskoolCabot CorporationBlack Pearls 2000
Ultrasoon badUltrawaveU10035 W
CentrifugeerfilterMerck MilliporeUFC5050BKAmicon Ultra, 50 KDa MW-afsnijding
MicrocentrifugeEppendorf5452000018MiniSpin
NaClSigma71376
H2SO4FisherS/9240/PB17
HNO3FisherN/2300/PB17
SiliconenkitCow Corning Toray Co., Ltd.SE 4486
KoolstofpapierTorayTGP-H-030
H2-gasBOC
N2-gasBOC
OriginPro 2015OriginLabGegevensanalyse/grafieksoftware
Resolutions Pro 4.0VarianSoftware voor het besturen van FTIR-spectrometer

Referenties

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48 (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64 (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394 (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38 (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105 (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10 (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359 (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187 (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44 (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45 (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13 (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113 (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8 (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119 (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108 (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38 (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131 (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107 (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129 (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283 (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28 (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37 (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134 (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133 (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125 (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828 (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10 (6), 0129940(2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136 (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53 (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142 (21), 212416(2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88 (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. , John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137 (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119 (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656 (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107 (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114 (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137 (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55 (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138 (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115 (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285 (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125 (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172 (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827 (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. , (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3 (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84 (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22 (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35 (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121 (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48 (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7 (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119 (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52 (85), 12665-12668 (2016).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

PFIRE-techniekelektrochemische controleinfraroodspectroscopiecarbon black-elektrodeflowcel-opstellingenzymimmobilisatiespectroelektrochemische cel
Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.