Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering

Summary

Wij presenteren drie nieuwe methoden om gustatorische codering te bestuderen . Met behulp van een simpel dier beschrijven de mot Manduca sexta ( Manduca ) een dissectieprotocol, het gebruik van extracellulaire tetrodes om de activiteit van meerdere gustatorreceptorneuronen op te nemen en een systeem voor het leveren en bewaken van nauwkeurig ingestelde pulsen van tastanten.

Abstract

Het smaakgevende gevoel laat dieren toe om chemicaliën in het milieu op te sporen, waardoor gedragsmatige kritieken voor overleving ontstaan. Wanneer GAST-receptoren Neuronen (GRN's) proefmoleculen detecteren, coderen ze informatie over de identiteit en de concentratie van de smaakstof als patronen van elektrische activiteit die vervolgens voortplanten om neurons in de hersenen te volgen. Deze patronen vormen interne representaties van de smaker, die het dier dan toelaat om acties te selecteren en herinneringen te vormen. Het gebruik van relatief eenvoudige diermodellen is een krachtig instrument om fundamentele principes in sensorische codering te bestuderen. Hier stellen wij drie nieuwe methoden voor om de gustatorische codering te bestuderen met behulp van de mot Manduca sexta . Ten eerste presenteren we een dissectieprocedure voor het blootstellen van de maxillaire zenuwen en de subesofageale zone (SEZ), waardoor de activiteit van GRN's van hun axonen kan worden geregistreerd. Ten tweede beschrijven we het gebruik van extracellulaire elektroden om de activiteit van meerdere GRN's op te nemen door te plaatsenDraaddraden rechtstreeks in de maxillaire zenuw. Ten derde presenteren we een nieuw systeem voor het leveren en bewaken, met hoge temporale precisie, pulsen van verschillende smaken. Deze methoden laten de karakterisering van neuronale responsen in vivo direct uit GRN's toe, tijdens en na het leveren van proefpersonen. We geven voorbeelden van spanningspores die zijn opgenomen uit meerdere GRN's, en presenteren een voorbeeld van hoe een spikesorteringstechniek op de gegevens kan worden toegepast om de responsen van individuele neuronen te identificeren. Tenslotte, om onze opname-aanpak te valideren, vergelijken we extracellulaire opnames verkregen van GRN's met tetrodes op intracellulaire opnames verkregen met scherpe glaselektroden.

Introduction

De damp- en olfactorische systemen genereren interne representaties van chemicaliën in het milieu, waardoor respectievelijk opvattingen van smaken en geuren ontstaan. Deze chemische zintuigen zijn essentieel voor het uitlokken van tal van gedragingen die kritisch zijn voor het overleven van het organisme, variërend van het vinden van vrienden en maaltijden om roofdieren en toxinen te vermijden. Het proces begint wanneer milieuchemische stoffen interactie hebben met receptoren in de plasmamembranen van sensorische receptorcellen; Deze cellen, direct of door middel van interacties met neuronen, transformeren informatie over de identiteit en concentratie van chemicaliën in elektrische signalen. Deze signalen worden dan overgebracht naar hogere orde neuronen en naar andere hersenstructuren. Naarmate deze stappen vooruitgang ondergaan, ondergaat het oorspronkelijke signaal altijd veranderingen die het vermogen van het organisme om de sensorische informatie te detecteren, discrimineren, classificeren, vergelijken en op te slaan bevorderen en een passende actie selecteren. Begrijpen hoe de behaIn transformeert informatie over milieukemikalieën om het beste uit te voeren op verschillende taken een fundamentele vraag in de neurowetenschappen.

Vloeibare codering is relatief simpel gedacht: in het algemeen is het van mening dat elk chemisch molecuul dat een smaak ontstaat (een "smaakstof") natuurlijk behoort tot een van de ongeveer vijf of zo fundamentele smaakkwaliteit ( dwz zoet, bitter, zure , Zout en umami) ¹ . In deze 'basis smaak'-weergave is het werk van het rookstelsel om te bepalen welke van deze basis smaken aanwezig zijn. Verder zijn de neurale mechanismen die basale smaakvoorstelling in het zenuwstelsel baseren, onduidelijk, en men vindt dat ze door een "gelabelde lijn" ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} of een "overvezelpatroon" ⁷ worden geregeerd ^{, 8} code. In een gelabelde lijncode reageert elke sensorische cel en elk van zijn neurale volgelingen op een enkele smaakkwaliteit, die samen een direct en onafhankelijk kanaal vormt voor hogere verwerkingscentra in het centrale zenuwstelsel dat gewijd is aan die smaak. In tegenstelling, in een cross fiber code, kan elke sensorische cel reageren op meerdere smaakkwaliteiten, zodat informatie over de smaakstof wordt weergegeven door de algemene respons van de populatie van sensorische neuronen. Het is onduidelijk of gustatory informatie wordt weergegeven door basis smaken, door middel van gelabelde lijnen of via een ander mechanisme, en is de nadruk op recent onderzoek ^{3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} . Onze eigen recente werkzaamheden suggereren dat het gustatory systeem een ​​spatiotemporale populatiecode gebruikt om te genererenVertoningen van individuele smaken in plaats van basis smaak categorieën ¹⁰ .

Hier bieden wij 3 nieuwe tools aan om te helpen bij het bestuderen van gustatorische codering. In de eerste plaats raden wij aan het gebruik van de hawkmoth Manduca sexta als een relatief eenvoudig model organisme dat geschikt is voor elektrofysiologische studie van smaak en beschrijft een dissectie procedure. Ten tweede stellen wij voor het gebruik van extracellulaire "tetrodes" om de activiteit van individuele GRN's op te nemen. En ten derde stellen wij voor een nieuw apparaat voor het leveren en bewaken van nauwkeurig geplande pulsen van smaakstof aan het dier. Deze instrumenten werden aangepast aan technieken die ons laboratorium en anderen hebben gebruikt om het olfactorische systeem te bestuderen.

Insecten zoals de vruchtvlieg Drosophila melanogaster , de sprinkhaan Schistocerca americana , evenals de mot Manduca sexta, hebben al decennia krachtige bronnen geleverd om basisprincipes over de ner te begrijpenVous systeem, inclusief sensorische codering ( bijv. Olfaction ¹³ ). Bij zoogdieren zijn smaakreceptoren gespecialiseerde cellen die communiceren met neuronen via complexe second-messenger pathways ^{1 , 14} . Het is eenvoudiger in insecten: hun smaakreceptoren zijn neuronen. Voorts zijn zoogdierproeven in de buurt van de periferie relatief complex, met meerdere parallelle neurale routes, en belangrijke componenten zijn uitdagend om toegang te krijgen, bevattend in kleine benige structuren ¹⁵ . Insecten smaken wegen lijken eenvoudiger te zijn. In insecten bevinden zich GRN's in gespecialiseerde structuren bekend als sensilla, gelegen in de antenne, monddelen, vleugels en benen ^{16 , 17} . De GRNs projecteren direct naar de subesofageale zone (SEZ), een structuur waarvan de rol vooral geacht is ¹⁷ , en die tweede orde bevatGustatorische neuronen ¹⁰ . Van daaruit reist de informatie naar het lichaam om reflexen te richten en naar hogere hersengebieden die geïntegreerd, opgeslagen worden en uiteindelijk gedragskeuzes uitvoeren ¹⁶ .

Het is noodzakelijk om perifere smaakreacties te karakteriseren om te begrijpen hoe smaakinformatie wordt vermenigvuldigd en getransformeerd van punt tot punt door het zenuwstelsel. De meest gebruikte methode om de neurale activiteit van GRN's in insecten direct te controleren is de tip-opname techniek ^{12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23} . Dit houdt in dat een elektrode direct op een sensillum wordt geplaatst, waarvan veel relatief gemakkelijk toegankelijk zijn. De smaakstof is opgenomen in de elektrode, waardoor men kan activeren en extremenMeet neuronale responsen van GRN's in het sensillum racellulair. Maar omdat de smaakstof in de elektrode aanwezig is, is het niet mogelijk om GRN-activiteit te meten voordat de proefpersoon wordt afgeleverd of nadat deze is verwijderd of om de smaakstoffen uit te wisselen zonder de elektrode ²⁰ te vervangen. Een andere methode, de "zijwand" opname techniek, is ook gebruikt om de GRNs activiteit op te nemen. Hier wordt een opnamelektrode in de basis van een smaak sensillum ²⁴ ingevoegd en tastanten worden geleverd via een aparte glazen capillaire op de punt van het sensillum. Beide technieken beperken opname van GRN's naar een bepaald sensillum. Hier stellen wij een nieuwe techniek voor: opnemen van willekeurig geselecteerde GRN-axons uit verschillende sensilla's, terwijl u afzonderlijk sequenties van tastants levert aan de proboscis. Axon opnames worden bereikt door het plaatsen van scherpe glaselektroden of extracellulaire elektrodebundels (tetrodes) in de zenuw die axonen draagt ​​vanGRNs in de proboscis naar de SEZ ¹⁰ . In Manduca passeren deze axonen de maxillaire zenuw, die bekend is dat ze zuiver afferent zijn, waardoor de ondubbelzinnige opname van sensorische reacties ^{25 mogelijk wordt} . Deze methode van opname van axonen zorgt voor meer dan twee uur stabiele meting van GRN-reacties voor, tijdens en na een reeks tastante presentaties.

Hier beschrijven we een dissectie procedure voor het blootstellen van de maxillaire zenuwen samen met de SEZ, waarmee men tegelijkertijd de responsen van meerdere GRN's en neuronen in de SEZ ¹⁰ opneemt. We beschrijven ook het gebruik van extracellulaire opnames van GRN's met behulp van een op maat gemaakte 4-kanaals gedraaide draadtetrode die in combinatie met een spikesorteringsmethode de analyse van meerdere (in onze handen tot zes) GRN's tegelijkertijd toelaat. We vergelijken verder opnamen gemaakt met tetrodes op opnames gemaakt met scherpe intracellulaireelektroden. Tenslotte beschrijven we een nieuw apparaat voor het leveren van tastant stimuli. Aangepast aan apparatuur die veel onderzoekers gebruikt om geurstoffen te leveren in oliveringsstudies, biedt ons nieuwe apparaat voordelen voor het bestuderen van vergassingen. Verbetering op eerdere multichannel afleveringssysteem, zoals die ontwikkeld door Stürckow en collega's (zie referenties ^{26 , 27} ), bereikt ons apparaat precies Controle over het tijdstip van de levering van de smaak, terwijl u deze tijdsindicatie geeft; En het laat de snelle, opeenvolgende levering van meerdere tastant stimuli ^{10 toe} . Het apparaat badt de proboscis in een constante stroom van schoon water in welke gecontroleerde pulsen van smaakstof kunnen worden afgeleverd. Elke smaakpuls gaat over de proboscis en wordt dan weggewassen. Tastants bevatten een kleine hoeveelheid smakeloos voedselkleuren, waardoor een kleuren sensor met precieze timing, de passage van de smakende ovIs de proboscis.

Protocol

Let op: Fijne, poederachtige schalen die door Manduca worden vrijgegeven, kunnen allergisch zijn, dus het gebruik van laboratoriumveiligheidshandschoenen en een gezichtsmasker wordt aanbevolen.

1. Dissectie van Manduca Sexta om de Maxillaire Zenuwen en de SEZ te onthullen

1. Kies een passende mot van elk geslacht op basis van de volgende kenmerken: drie dagen na eclosie met een algemene gezonde uitstraling (de vleugels moeten volledig worden verlengd en de proboscis en antennes moeten intact zijn).
   1. Plaats de mot individueel in een plastic beker voor transport.
2. Plaats de mot in een polypropyleenbuis.
   Let op: we raden u aan om deze stap in een afzuigkap uit te voeren om te voorkomen dat de poederwaren van de mot verspreiden.
   1. De buis moet iets langer zijn dan het lichaam van de mot ( figuur 1A ). De buis kan worden gemaakt door een 15 ml polypropyleenbuis te snijden.
   2. Druk de mot tot het hoofd wordt blootgesteld en voeg het opgeblazen weefselpapier in het andere uiteinde van de buis om de mot onbeweeglijk te houden ( Figuur 1A ).
3. Verwijder het haar van de blootgestelde kop van de mot (ventraal en dorsaal) door de druklucht op te blazen.
   1. Een luchtstraal kan worden gemaakt door een spuit (1 ml met een naald, ID ongeveer 1,4 mm, met een scherpe punt verwijderd) aan te sluiten op een luchtbron.
      Opmerking: Na het verwijderen van het haar kunnen alle volgende stappen buiten de afzuigkap worden uitgevoerd.
4. Zodra het meeste van het haar verwijderd is, plaats de buis in een houderkamer met het dorsale deel van het hoofd naar boven gericht, zoals weergegeven in figuur 1B .
   1. Gebruik op een petri schotel gebruik van klei om een ​​driehoekige basis te bouwen ongeveer 7 cm lang, 2,5 cm hoog ( Figuur 1B ).

Figuur 1 : Bereiding van de Dissectiekamer voor Manduca . ( A ) Een mot is in een buis vastgehouden. Het hoofd is aan het ene uiteinde blootgesteld, terwijl het andere uiteinde is aangesloten op tissuepapier. ( B ) Een dissectiekamer gemaakt van een petrischaal en modelleerklei wordt getoond. Het dorsale deel van het hoofd is omhoog gericht. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bescherm de antennes en proboscis.
   1. Bereid 3 kleine buizen door een pipet tip (gele tips, 1-200 μL) met een scheermesje in 3 stuks van ongeveer 0,5 cm in lengte te snijden. De binnendiameter moet groot genoeg zijn zodat de antenne en de proboscis goed passen.
   2. Bereid een haak voorEen draad buigen (22 AWG, ongeveer 7 cm lang). Verleng de mot van de mot en steek het vervolgens in een van de kleine buizen door het met de draadhaak te trekken tot de buis het proximale deel van de proboscis bereikt.
   3. Bevestig de kleine buis met stevige batikwas (bijvoorbeeld bij gebruik van een tandwaxer om de wax te smelten en direct te geven) aan het dorsale deel van de hoofdkapsel van de mot (zie figuur 2A links).
   4. Plaats elke antenne in een buis en bevestig de buizen met batikwas zoals getoond in figuur 2A (links). Wees voorzichtig om de antennes niet te beschadigen met het warme wax.
6. Stabiliseer de hersenen tegen beweging door spieren die het voorste oppervlak van de hersenen bedekken ( dwz buccale compressorspier) te snijden.
   1. Onder de dissectiemicroscoop, gebruik een micro-dissectieschaar of een mini-bijl die is gemaakt van een razorchip gelijmd aan een tandenstoker om de hoofdcapsule door makkelijk te openenEen kleine knippen net onder de proboscis ( Figuur 2A , linker bovenste ingang).
   2. Gebruik micro-dissectieschaar om de buccale compressorspier te snijden (zie afbeelding ²⁵ voor illustraties). Aangezien de spier niet gemakkelijk zichtbaar is, wordt de volgende gedragstest aanbevolen om te bevestigen dat het gesneden is.
   3. Verdun sacharose in gedistilleerd water om een ​​1 M oplossing te verkrijgen.
   4. Gebruik een pipet om ongeveer 200 μl sucroseoplossing te leveren aan de distale 2/3 van de proboscis, en observeer de proboscis gedurende 5 minuten. Als de spier goed gesneden was, zou het insect niet in staat zijn om de proboscis uit te breiden of te verplaatsen.
   5. Breng een laag gesmolten batikwas aan om de opening in de hoofdcapsule te verzegelen.
7. Vouw het insect over zodat de ventrale zijde van de hoofdcapsule nu naar boven gericht is.
8. Om zoutoplossing te perfectioneren tijdens en na de dissectieprocedure, bouwt u een wokbeker rond de ventrale zijde van het hoofdG de elektrische waxer: onder een dissectiemicroscoop, begin met het bouwen van de beker door de eerste rij wax aan de voorkant van het hoofd toe te passen, naar de achterkant bewegen. Houd de proboscis en antenne buizen in de beker ( Figuur 2A rechts).
   1. Blijf de kopje naar buiten en naar boven bewegen tot het het niveau van de ogen bereikt.
9. Gebruik pincet om een ​​van de twee labiale palpen te nemen, plaats het dan aan de zijkant en bevestig het in de waskop door meer gesmolten was toe te voegen. Doe hetzelfde met de andere maxillary palp ( Figuur 2A rechts).
10. Zet eventuele openingen in de waskop en buizen.
    Opmerking: in deze stap wordt epoxy gebruikt, omdat het helpt om gaten in de was en de buizen gemakkelijk te verzegelen en voorkomt enige verwarrende schade aan de antennes en proboscis.
    1. Gebruik een tandenstoker om binaire epoxy te mengen in een plastic mengschotel. Houd de mengschotel vast.
    2. Gebruik de tandenstoker om een ​​dunne aan te brengenLaag epoxy aan de buitenkant en de binnenkant van de beker ( figuur 2B ).
    3. Vul de lege ruimte in de buizen die de proboscis en antennes met epoxy bevatten en vul het gedeelte van de polypropyleenbuis om de hals met voldoende epoxy om deze vast vast te houden ( figuur 2B ).
    4. Laat de epoxy ongeveer 20 minuten drogen. Om dit te controleren, test de resterende epoxy in de plastic mengschotel om ervoor te zorgen dat het stevig is en niet langer kleverig is.
    5. Vul de waskop met Manduca fysiologische zoutoplossing ²⁸ en wacht een paar minuten om er zeker van te zijn dat er geen lekken ontstaan. Als een lek zichtbaar is, probeer het te verzegelen door meer warme wassen en / of epoxy aan te brengen.

Figuur 2 : Voorbereiden van Manduca </ Em> voor Dissection. ( A ) Antenne en proboscis zijn beschermd in kleine buizen gemaakt van pipettappen gesneden in drie stukjes van ongeveer 0,5 cm in lengte. (Linker paneel, groot beeld) De buizen zijn bevestigd met gesmolten batikwas aangebracht rond het dorsale deel van het hoofd. (Linker paneel, inset) Om de buccale compressorspier te verwijderen, wordt de dorsale kant van de hoofdcapsule geopend door een kleine snede te maken zoals aangegeven door de stippellijn in het grote beeld. (Rechter paneel) Een wokbeker is gebouwd rond de ventrale kant van het hoofd als reservoir voor geperfineerde zoutoplossing tijdens de dissectieprocedure en opnameproeven. ( B ) Epoxy wordt gebruikt om gaten tussen de basis van de waskop en het dorsale deel van het hoofd (linker paneel) te verzegelen en tussen de wassen en de buizen die de antennes en proboscis bevatten, inclusief de openingen van de buizen (rechter paneel ). Klik hier tO Bekijk een grotere versie van deze figuur.

11. Onder de dissectiemicroscoop, gebruik een micro-dissectieschaar om de labiale palps af te snijden.
12. Gebruik een micro-dissectieschaar of een mini-bijl om de ventrale zijde van de hoofdcapsule te openen door vier snijpunten te maken: twee snijdingen langs de nagel die rondom elk oog van achter naar voren omringen, een snijband op de achterkant van de kop, En een snijband op de voorkant van het hoofd dicht bij de proboscis ( afbeelding 3A ).
13. Haal de cuticle voorzichtig weg met behulp van microdissectiepincet om de hersenen bloot te stellen.
14. Door twee scherpe microdissectiepennen te gebruiken, langzaam en zorgvuldig verwijderen vetweefsel en de trachea die de SEZ bedekken. Vermijd schade aan de hersenen of zenuwen (bijv. Maxillair zenuw, optische zenuw, cervicale connectieve). Spoel de hersenen door de zoutoplossing regelmatig te vervangen en stel het licht vaak aan voor een betere zichtbaarheid. Opmerking: dit kan het meest kritische deel van de di zijnssection; Het is gemakkelijk om per ongeluk de maxillaire zenuw te beschadigen door er aan te trekken of te verpletteren.
    Opmerking: op dit punt moet de SEZ en de maxillaire zenuwen duidelijk zichtbaar zijn ( figuur 3B -3C ). De hersenen en de maxillaire zenuwen zijn echter bedekt met een dunne schede.
15. Om de mantel te verwijderen, vervang de zoutoplossing in de waskop met 10% (w / v) collagenase / disperge opgelost in zoutoplossing en laat het gedurende 5 minuten op zijn plaats. Vervolgens, na het spoelen van de hersenen meerdere keren met zoutoplossing, verwijder de schede voorzichtig met superfijne microdissectiepennen door de schede uit de SEZ door de maxillaire zenuwen te trekken.
16. Begin de waskopje met verse zoutoplossing te perfectioneren. Leg de buis van een zoutoplossing in de waskopje en bevestig het met gesmolten was.

vijgUre 3 : Manduca Dissection Procedure. ( A ) De labiale palpen verwijderd, de hoofdcapsule wordt geopend door vier snijdingen te maken zoals aangegeven door de stippellijn. ( B ) Een vergrote afbeelding van de hersenen na het openen van de hoofdcapsule en het verwijderen van vetweefsel en trachea, waardoor visualisatie van de maxillaire zenuwen (MxNs) en de sub-oesofageale zone (SEZ, een term die betrekking heeft op het gebied van de hersenen onder de slokdarm). De maxillaire zenuwen dragen axonen van gustatoire receptorneuronen (GRN's) in de proboscis naar de SEZ. ( C ) Een schematische van een Manduca hersenen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Tastant Delivery System

1. Het smaakverzorgingssysteem bestaat uit vier hoofdelementen: de waterbron, het smakenmaker, de kleurenensor en de site die deProboscis, allen verbonden met een stijve kunststof buis ( Figuur 4A -4B ). Om dit systeem te bouwen, volg de stappen die in Figuur 4B zijn weergegeven . Gebruik een stijve kunststof buis ongeveer 6 cm lang (ID 0.3 cm).
2. Gebruik een soldeerbout om een ​​klein gat in de buis te maken waar de proboscis wordt geplaatst ( Figuur 4A -4B ).
3. Om ervoor te zorgen dat de proboscises van verschillende dieren altijd op dezelfde locatie worden geplaatst, bevestigt u plastic zeefmateriaal (maas, gatmaat van ongeveer 0,1 cm) in de buis ( Figuur 4A -4B ). Met een scheermesje of een roterend gereedschap snijd de stijve buis ongeveer 5 mm boven het proboscisgat. Plaats het gaas tussen de twee stukjes buis. Bevestig het gaas en verbind de buizen opnieuw door epoxy aan de buitenkant van de buizen toe te passen. Laat de epoxy ongeveer 20 minuten drogen.
4. Voor tastante levering gebruik een drukPerfusie-systeem met zo veel smakenbuizen als nodig, verbonden aan een verdeelstuk (zie hieronder). Gebruik het soldeerbout om een ​​klein gat in de stijve buis ongeveer 1 cm boven het gaas te maken. Plaats de uitvoerbuis van het perfusiesysteem (ID 0.86 mm) in de stijve buis en bevestig het daar door epoxy aan te brengen ( Figuur 4A -4B ).
5. Gebruik een peristaltische pomp om een ​​constante stroom te leveren (~ 40 ml / min) gedestilleerd water. Sluit het met siliconenbuis aan op de stijve buis ( Figuur 4A -4C ). Sluit de andere kant van de stijve buis aan op een andere siliconenbuis om de uitgang in een grote afvalcontainer te leiden ( Figuur 4A -4C ).
6. Om de proefpersoon af te leveren, injecteer perslucht in het manifold van het perfusiesysteem. Dit kan bijvoorbeeld worden bereikt door gebruik te maken van een pneumatische pomp (10 psi) die wordt geregeld door een tijdspanningspulsinvoer om gecomprimeerde lucht in de manifol te injecteren D buis die de gewenste smoorkleur bevat. Een 1s-puls uitstoot ongeveer 0,5 ml smaakstof.

3. Tastant Voorbereiding en Monitoring Tastant Delivery

1. Verdun smaakstof in gedistilleerd water tot de gewenste concentratie. Wees ervan bewust dat de smaakstof verder verdund wordt door de waterstroom. We hebben de eindconcentratie gemeten die de proboscis bereikte als 77% van de initiële concentratie (zie referenties ^{10 , 29} ).
2. Voeg een kunstmatige voedselverfstof toe aan elke smaakoplossing om de precieze timing te bepalen waarmee de smaakstof over de proboscis gaat. We vonden dat de groene kleurstof (zie Materiaallijst ) bij 0,05% w / v Manduca GRNs niet activeert.
3. Gebruik een kleurensensor (zie tabel 1) om de kleurstoffen in de smaakoplossingen te detecteren. Gebruik een soldeerbout om een ​​gat naast het gaas en 0,5 cm onder de uitvoerbuis van het perfusiesysteem te maken ( S = "xfig"> Figuur 4A -4B). Sluit de sensor aan op de stijve buis en bevestig het daarbij met behulp van epoxy aan de buitenkant.
   1. Noteer de kleurensensorspanning als analoge signaal, samen met fysiologische signalen (zie sectie 4). Het kleurensensorspanningssignaal kan worden versterkt met behulp van een gelijkstroomversterker die op de sensor is aangesloten ( figuur 4A ).
4. Zorg ervoor dat de kleurenensor werkt door de tastant te leveren en de spanningsuitgang van de sensor op te nemen. Het signaal dat door de kleurstof wordt opgewekt, moet het geluidsniveau overschrijden.
   1. Stel de constante waterstroom in om het signaal zo dicht mogelijk te maken.
      Opmerking: Bij het leveren van meerdere smaken in volgorde, let op de eerste proef met een nieuwe smaakstof bestaat uit een mix van de nieuwe en vorige smaken. Om deze reden hebben we deze eerste proeven niet geanalyseerd.

">
Figuur 4 : Tastant Delivery System. ( A ) Een schematische weergave van het apparaat dat wordt gebruikt voor het leveren en bewaken van getimede pulsen van tastanten aan de proboscis van het dier. De hoofdcomponenten van het systeem worden aangeduid met rode cijfers. Een constante stroom van gedistilleerd water wordt over de proboscis gehandhaafd door een peristaltische pomp verbonden met siliconenbuis aan de stijve kunststofbuis (1) waar de proboscis geplaatst moet worden (6). Tastants die een kleine hoeveelheid smaakvrije kleurstof bevatten, worden afgeleverd met behulp van een 16-kanaals perfusiesysteem onder druk. De reservoirs die de smaakstoffen bevatten, zijn verbonden met een verdeelstuk (2) die aan de stijve buis is bevestigd, boven het gat waar de proboscis geplaatst moet worden (5). Gecomprimeerde lucht vanuit een pneumatische pomp wordt geïnjecteerd in het perfusiesysteem om snel een tastant te leveren, met timing geregeld door aangepaste software. EENKleurensensor (3) wordt gebruikt om de levering van de smaakstoffen te controleren. De sensor is verbonden met de stevige buis grenzend aan de proboscis en onder de uitlaat van het smaakvolume-systeem. Het kleurensensorspanningssignaal wordt versterkt door een gelijkstroomversterker. Het rode spoor op het ingangen naast de versterker illustreert een kleurensignaal dat is opgenomen met behulp van aangepaste data-acquisitie software; De snelle toename en afname van het signaal weerspiegelen de aankomst en afwas van respectievelijk de tastant. De mot van de mot is geplaatst in een gat (5), net onder de kleurenensor. Een maas (4) wordt boven het gat geplaatst om ervoor te zorgen dat de proboscises van verschillende dieren altijd op dezelfde locatie worden gepositioneerd. De andere kant van de stijve buis is verbonden met een andere siliconenbuis om de uitvoer in een afvalcontainer (7) te leiden. ( B ) Afbeelding die de belangrijkste elementen van het leveringssysteem voor smaakstoffen toont die verbonden zijn met de stijve kunststof buis, die aangeduid worden met de rode cijfers zoals aangegeven in paneel A: het waterBron (6), de smaakventilatoruitvoerpijp (2), de kleurenensor (3), het gaas (4) en het gat waar de proboscis moet worden ingebracht (5) allemaal verbonden met een stijve kunststofbuis (1) . ( C ) De plaatsing van de Manduca voorbereiding in de set-up wordt getoond. De distale t2 / 3 van de moth's proboscis worden in het gat (5) in de stijve kunststof buis (1) ingevoerd. De proboscis is vastgezet met tandwax en epoxy, zoals aangegeven door de inzet. De wateringang naar de stijve buis en de uitvoer ervan naar een afvalcontainer worden aangeduid met respectievelijk de nummers 6 en 7. Het nummer 2 geeft de uitgangsslang van de smoorklep aan. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Extracellulaire Tetrode Opnemen bij Monitor Tastant-Evoked Activiteit van GRNs

1. Plaats motmot op een platform onder een stereomicroscoop op een trillingAtion-isolerende tafel ( figuur 4C ).
2. Zet de distale tweederde van de mot van de mot in de stevige buis van het smaakstroomsysteem ( Figuur 2B ). Om dit te doen, verleng de mot van de mot en steek het vervolgens in het gat van de stijve buis door het voorzichtig door te drukken met behulp van dressing tang. Zet de proboscis op zijn plaats met zachte tandwax en dan een laag epoxy om lekkages te vermijden ( Figuur 4C , inlaat).
3. Sluit de zoutoplossingslijn aan op de hoofdcapsule en zet de perfusiestroom op een constante snelheid van ongeveer 0,04 L / h.
4. Dompel een grondelektrode ( dwz een geoxideerde zilverdraad) in het zoutbad ( Figuur 5A ).
5. Gebruik een op maat gemaakt draaddraadtetrode die is gebouwd volgens de fabricageprocedure beschreven in ³⁰ (4 elektrodenkabels worden voorgesteld om goed geïsoleerde eenheden te bereiken en in te passen inde zenuw). Voordat u het experiment probeert, elektroplateer de elektrode volgens de stappen beschreven in ³⁰ .
6. Gebruik een handmatige micromanipulator om de tetrode dicht bij de maxillaire zenuw te plaatsen. Bevorder de tetrode tot het in de zenuw komt ( Figuur 5 ).
7. Wacht minstens 10 minuten na het plaatsen van de tetrode om het in de zenuw te stabiliseren voordat u opneemt.
8. Versterk het signaal (3000x) en gebruik een banddoorlaatfilter tussen 0,3-6 kHz. Verkrijg het signaal bij een sampling rate van 40 kHz met behulp van data acquisition software.
9. Na het afronden van het experiment plaats de motbereiding in de vriezer.

Figuur 5 : Tetrode opname van GRNs. ( A , groot beeld) Een micromanipulator wordt gebruikt om pKant de gedraaide draad tetrode in de maxillaire zenuw (MxN) om de activiteit van GRNs op te nemen. Een chloride zilver grond elektrode wordt geplaatst in het zoutbad zoals getoond. ( A , inset) Een vergrote afbeelding van de hersenen die de tetrode in de maxillaire zenuw toont. De subesofageale zone (SEZ) is ook aangegeven. ( B ) Een schematische van een Manduca hersenen georiënteerd zoals in A. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Results

De activiteit van GRN's kan worden geregistreerd met behulp van een extracellulaire tetrode-elektrode voor, tijdens en na de levering van de smaak ( Figuur 6A en 6C ). Figuur 6A (midden- en onderpanelen) toont gefilterde (300-6000 Hz) spanningssporen opgenomen door elk van de vier draden die in de maxillaire zenuw zijn geplaatst, waaraan signalen van verschillende amplituden die de actiepotentiaal (pijlen) weerspiegelen kunnen worden waargenomen. Een 1 s puls van tastant (1 M sucrose) werd 2s na het begin van het experiment afgeleverd; De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurenensor ( Figuur 6A , bovenste paneel). De tastgeïnduceerde spikes die in elk van de vier kanalen waargenomen kunnen worden ( Figuur 6A , middenpaneel). GRN's kunnen worden geïdentificeerd en onderscheiden van mechanische sensoren (geen hier weergegeven) wanneer ze reageren op sommige tastanten en niet anderen ^10.

Om enkele neuronresponsen uit de tetrode-opnamen te identificeren en te isoleren, hebben we off-line spikesortering uitgevoerd met behulp van een reeks aanpasbare functies op basis van Pouzat's ³¹ en Kleinfeld's ^{32 , 33} methoden (deze methoden zijn beschreven in deze citaten: ^{10 , 29} ). Figuur 6B toont een voorbeeld van spikesortering toegepast op de gegevens die zijn getoond in figuur 6A , waarin drie goed geïsoleerde eenheden werden gevonden.

Raster plots van Figuur 6C tonen reacties van de drie geïsoleerde eenheden in Figuur 6B aan zes verschillende tastanten (1 M sucrose, maltose en NaCl, 100 mM cafeïne en 10 mM berberine en lobeline) afgeleverd in volgorde (4 trialS / tastant worden getoond). Zoals getoond in Figuur 6C , hebben de opgenomen GRN's verschillende niveaus van basislijnactiviteit, variërend van stil (GRNs 1) tot laag of matig (GRN 2 en 3). Na tastende aanvang tonen GRNs diverse activiteitspatronen en tonen verschillende selectiviteit aan de smaakstoffen. Bijvoorbeeld, GRN 1 reageerde alleen op sucrose, terwijl GRN 2 reageerde op maltose en NaCl met spitsbrekers en lobeline met alleen spiking bij het begin van de stimulus. Daarnaast worden sommige reacties afgesloten met de timing van de stimulus ( bijv. GRN 1-respons op sucrose), terwijl andere responsen de duur van de stimulus overschrijden ( bijv. GRN 3-respons op berberine) of beide excitatoire en remmende componenten bevatten ( bijv. Figuur 7 GRN 2 reacties op NaCl en sucrose). Voor meer informatie over de diverse gevoeligheden en activiteitenpatronen van GRN's zie referentie ¹⁰ .

Voor het valideren van het gebruik van de tetrode- en spikesorteringstechnieken om GRN's van de maxillaire zenuw op te nemen, hebben we intracellulaire opnames van GRN-axons in andere dieren uitgevoerd door gebruik te maken van conventionele scherpe glaselektroden (weerstand van 80-120 MΩ). We vonden dat de activiteit patronen verkregen met behulp van intracellulaire opnames vergelijkbaar waren met reacties waargenomen door gebruik te maken van de tetrode techniek ( Figuur 7 ). De spanningsporen in de groene doos in Paneel A werden intracellulair geregistreerd van GRN 1 gedurende 5 opeenvolgende proeven van sucrose presentatie, en dezelfde reacties worden weergegeven als raster plots in paneel B. (Merk op dat dit soort reactie overeenkomt met dat verkregen met tetrodes en Getoond in figuur 6C .) GRN 2, opgenomen met scherpe intracellulaire elektroden, toont een bredere responspatroon.

Figuur 6: Representatieve resultaten van maxillaire zenuwopnamen met extracellulaire tetroden. ( A ) Gefilterde (300-6000 Hz) spanningssporen opgenomen door elk van de vier draden bij de maxillaire zenuw worden getoond (middenpaneel). Een 1 s puls van de smaakstof werd toegepast gedurende de door de rode schaduw aangegeven periode in het middenpaneel. De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurensensor zoals aangegeven door het rode spanningsspoor op het bovenpaneel en wordt aangeduid op het middenpaneel door het roodgekleurde gebied. De gestippelde horizontale lijnen wijzen op +50 (boven), 0 (midden) en -50 (onder) μV. Een vergroting van de rasspanningsporen die overeenkomt met het gebied in de verticale stippellijnen wordt getoond (onderpaneel). Voorbeelden van spikes worden aangegeven door de pijlen. ( B ) Een voorbeeld van spikesortering toegepast op de gegevens in paneel A. De golfvormen die zijn opgenomen bij elk van de vier extracellulaire draden (1-4) arE geïdentificeerd met drie verschillende GRNs (eenheden 1-3) die bijdragen aan de opgenomen signalen. Individuele gebeurtenissen (gekleurde dunne lijnen) en de gemiddelde (dikke zwarte lijn) worden getoond voor de drie eenheden. Een aantal statistische criteria moet worden beschouwd om onafhankelijke eenheden op betrouwbare wijze te identificeren met behulp van de spikesorteringsmethode (zie referenties ^{10 , 29} ). ( C ) Raster plots die reacties van de drie geïsoleerde eenheden vertegenwoordigen aan een reeks van zes verschillende tastanten (4 proeven / smaakstoffen worden getoond). De tijdsperiode van de levering van smaakstoffen (1 s) wordt aangegeven door het roodgekleurde gebied. De concentraties van tastanten waren ofwel 1 M (sucrose, maltose, NaCl), 100 mM (cafeïne) en 10 mM (berberine en lobeline). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figuur 7 : Intracellulaire opnamen van GRN Axons. ( A , groen doospaneel) Spanningssporen opgenomen uit een GRN met scherpe glas intracellulaire elektroden (weerstand van 80 - 120 MΩ) geplaatst in de maxillaire zenuw, opgewekt door 5 opeenvolgende stimulaties met 1 M sucrose (Suc). ( B ) Rasterbeelden van de reacties van twee GRN's, inclusief reacties in paneel A (groen vakpaneel), naar twee verschillende tastanten in volgorde (100 mM grijze lettertype kleur; 1 M zwarte lettertype kleur) opgenomen met scherpe glas intracellulaire elektroden Geplaatst in de maxillaire zenuw (7 proeven / tastant en 3 proeven / water worden getoond). Tastant levertijd wordt aangegeven door roodglazen gebieden in beide panelen. De aanvang en compensatie van de stimulus werd gecontroleerd door de kleurenensor, zoals aangegeven door de rode spanningssporen aan de onderkant van elk paneel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Discussion

De hier beschreven methoden maken het mogelijk om in vivo opnamen van een relatief eenvoudig dier, Manduca sexta , de activiteit van meerdere, willekeurig geselecteerde GRNs over lange duur (gedurende meer dan 2 uur) voor, tijdens en na de toevoer van de smaak te karakteriseren. Deze methoden staan ​​ook toe voor de snelle, opeenvolgende levering van meerdere tastant stimuli met nauwkeurige tijdelijke controle, voordelen die nuttig zijn voor het bestuderen van neurale mechanismen die onderliggende tastantrepresentatie liggen. Dit protocol is gebruikt om te bestuderen hoe de responsen van GRN's op proefpersonen worden getransformeerd wanneer ze worden overgedragen aan hun postsynaptische targetneuronen ( bijv. In de SEZ) tegelijkertijd met GRN's tegelijk met monosynaptisch verbonden interneuronen ^{10 worden} gecontroleerd. Bovendien kunnen deze methoden worden aangepast aan de behoeften van de experimentator, waardoor de uitvoering van complexe paradigma's fundamentele aspecten van gustatorische codering kan bestuderen.

Wanneer beginninG onze studies, een technisch probleem dat we soms moesten oplossen, was het onvermogen om spiking signalen te detecteren van de maxillaire zenuw met de tetrode draden. Mogelijke oorzaken hiervoor zijn uiteenlopend, aangezien het dissectieprotocol uitdagend is, en sommige oefening is nodig om een ​​goede voorbereiding te verkrijgen. Ten eerste zijn tijdens de motdissectie de maxillaire zenuwen gemakkelijk te beschadigen, vooral tijdens het verwijderen van de schede die het zenuwweefsel omringt. Ten tweede, als de schede niet volledig wordt verwijderd, kunnen de tetrode draden mogelijk niet toegang hebben tot de zenuw. In beide gevallen is het starten van een nieuwe voorbereiding vaak de makkelijkste manier om deze problemen op te lossen. Ten derde kan er een probleem zijn met de tetrode draden. Dit kan gecontroleerd worden door de impedantie van de draden te meten die ~ 1 kHz ~ 270 kΩ zouden moeten zijn. Als de impedantiewaarde hoger is dan ~ 300 kΩ, elektroden de draden met goud om de gewenste impedantie te bereiken (zie referentie ³⁰ ). Ten vierde kan een stuk materiaal worden verbrokenOf verkeerd handelen.

Een ander mogelijk probleem is dat spiking signalen worden opgenomen, maar de neuron (en) lijken niet te reageren op de smaakstoffen. Dit kan zijn omdat de opgenomen neuronen ongevoelig zijn voor de verzekerde reeks tastanten. Ook is belangrijk om in gedachten te houden dat naast de axonen van GRN's ook de maxillaire zenuw mechanische zenuwvezels draagt. Zo is het mogelijk om op te nemen van mechanosensorische neuronen in plaats van, of naast GRN's. Het tastingsleveringssysteem is echter ontworpen om een ​​constante mechanische invoer gedurende het experiment te leveren waardoor het onwaarschijnlijk is dat reacties op een proeverij zullen worden beschaamd door reacties op de mechanische component van de levering ervan. Neuronen die reageren op sommige maar niet andere smaken, of op verschillende manieren voor verschillende smaken, kunnen ondubbelzinnig worden ingedeeld als GRN's. Wij raden aan om verse verdunde smaakstoffen te gebruiken om variaties in de concentratie van de smaakstoffen of samenstelling te voorkomen als gevolg van samengestelde afbraak of verdampingVan het oplosmiddel. We raden u ook aan het systeem regelmatig te reinigen om te voorkomen dat de vervuiling van de buizen en / of belemmeringen voorkomt.

Een ander mogelijk technisch probleem is een nadeel signaal-ruisverhouding. Dit probleem kan vaak opgelost worden door rechloriding of aanpassing van de positie van de badgrondelektrode. Andere oplossingen kunnen afscherming vereisen en de lengte van elke elektrische aansluiting in het apparaat minimaliseren.

Tenslotte is het belangrijk om op te merken dat de juiste analyse van de gegevens die verkregen worden met behulp van tetrode-opnamen zorgvuldige spikesortering vereisen. We hebben geconstateerd dat volledig geautomatiseerde methoden over het algemeen onvoldoende zijn. Wij raden aan om vertrouwd te raken met de spik sorteerliteratuur voordat u tetrode data ^{10 , 29 , 31 , 32 , 33} analyseert.

Alternatieven voor onze dissectie proTocol kan worden gebruikt. Hier beschrijven we een dissectie door het ventrale deel van de motkop, die toegang biedt tot de maxillaire zenuwen en SEZ, maar het is ook mogelijk om deze structuren te openen door middel van dissectie door de dorsale kant. We vonden dat de dorsale kantvoorbereiding niet optimaal is om opnamen te maken van deze gustatorische structuren door hun diepe locatie, maar dit preparaat biedt het voordeel om opnamen van hogere orde structuren te maken, zoals het paddestoel lichaam, een gebied dat is geassocieerd met multi -sensoriële integratie, associatief leren en geheugenverwerking ³⁴ . We hebben zich geconcentreerd op het gebruik van tetrodeelektroden om vanaf de maxillaire zenuw te registreren, maar zoals geïllustreerd kunnen ook standaard intracellulaire scherpe elektroden voor dit doel worden gebruikt. Bovendien kunnen beide technieken gecombineerd worden om gelijktijdige opnamen uit meerdere hersengebieden ^{10 uit te voeren} . De literatuur van de neurowetenschappen biedt veel voorbeelden van iNvertebrate modellen die bewezen zijn krachtige hulpmiddelen voor het onthullen van fundamentele principes van sensorische verwerking, zoals olfactorische codering, die van toepassing zijn op zowel insecten als gewervelde dieren ^{35 , 36 , 37 , 38 , 39} . Wij hopen dat onze methoden leiden tot fundamentele nieuwe inzichten over gustatory codering.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon	Fisher Scientific	14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"	MONOJET	888200144	For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina	DickBlick	33268
Petri dish -100 x 15 mm	VWR International	89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL)	USA Scientific	1111-0806
Razor blade	Techni Edge	TE05-071
22 AWG standard hookup wire	AlphaWire	1551	For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax	Jacquard	7946000
Electric waxer	Almore International	66000
Stereo Myscroscope	Leica	MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)	World Precision Instruments	500335	For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)	World Precision Instruments	14096	For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine)	World Precision Instruments	500085	For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine)	World Precision Instruments	500086	For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001
Epoxy	Permatex	84101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator	B Braun Medical Inc.	V5200
IV administration set with Y injection site	B Braun Medical Inc.	V1402
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8"	Small Parts Inc.	B001JJT4SA	Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron	Circuit Specialists	ZD200BK
Rotary tool-Dremel	Dremel	4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)	Industrial Netting	XN5170	For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system	Bioscience Tools	PS-16H	For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050"	Becton, Dickinson & Co	427421	Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820	For controlling the output channel of the perfusion system.
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card	National Instruments	LabVIEW 2011	To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump	Sigma	P1366	For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8"	Cole-Parmer	WU-95802-02	To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor	Keyence	FS-V31M	For monitoring tastant delivery.
Color sensor-reflective fiber unit	Keyence	FU35-FZ	To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax	Henry-Schein Dental	6652151	To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers			To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF	Sigma	F7258
Dressing forceps 25.5 cm	WPI	500364	To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier	Brown-Lee	440
Lamp	Schott	Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator	Leica	micromanipulator	To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope	Leica	MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)	TMC	63-541
Oscilloscope	Tektronix	TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier	16 Channel MA-800 Amplifier System	B.E.S 2013
Computer	Dell	optiplex 780	The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card	National Instruments	LabVIEW 2011	To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tastants
KAc	Sigma-Aldrich	P5708
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650
NaCl	Sigma-Aldrich	73575
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097