Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Summary

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Abstract

Er zijn vele biologische stimuli die gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie beïnvloeden kunnen. Benaderingen van de cultuur van de algemene cel, is afhankelijk van oplosbare factoren binnen de middellange tot controle cel gedrag. Echter oplosbaar toevoegingen kunnen niet na te bootsen bepaalde signalering van motieven, zoals matrix-gebonden groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijke biochemische signalen, die gemeenschappelijke invloeden op de cellen. Bovendien, biofysische eigenschappen van de matrix, zoals substraat stijfheid, spelen een belangrijke rol in het lot van de cel, die is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van conventionele cel culturing praktijken. In deze methode beschrijven we een eenvoudig protocol om gedessineerde bioactieve eiwitten op synthetische polyethyleenglycol (PEG) hydrogels Fotochemie gebruiken. Dit platform zorgt voor de onafhankelijke controle van substraat stijfheid en ruimtelijke biochemische signalen. Deze hydrogels kunnen een groot aantal fysiologisch relevante stijfheid waarden bereiken. Bovendien, kunnen het oppervlak van deze hydrogels photopatterned met bioactieve peptiden of eiwitten via thiol-een klik op scheikunde reacties. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden van eiwitfunctie na oppervlakte immobilisatie. Dit is een veelzijdige protocol dat kan worden toegepast op elke proteïne of peptide van belang zijn voor het maken van een verscheidenheid aan patronen. Ten slotte kunnen cellen uitgezaaid op het oppervlak van deze bioactieve hydrogels na verloop van tijd worden gecontroleerd als ze op ruimtelijk specifieke signalen reageren.

Introduction

Er zijn vele prikkels die cel gedrag beïnvloedt. In het algemeen, typische cel kweken technieken afhankelijk van oplosbare factoren te ontlokken cellulaire reacties; Er zijn echter beperkingen aan deze benadering. Deze methoden zijn niet juist weergegeven in alle signalering motieven voorkomende in vivo. Dergelijke signalering mechanismen zijn afgezonderd groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijk-specifieke biochemische signalen. Bovendien, substraat stijfheid kan spelen een belangrijke rol in gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie en is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van gemeenschappelijke cel kweken praktijken¹

Protocol

1. voorbereiding van de materialen voor Hydrogel synthese

1. voorbereiden voorraadoplossingen van PEGDA, lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) en fibronectine onder steriele omstandigheden en op basis van berekeningen (tabel 1A).
   1. Weeg en ontbinden van verbindingen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Meestal houden PEGDA oplossing concentraties tussen 50 en 200 mg/mL (5-20% gewicht/volume) werken. Pipetteer van de PEGDA oplossing door een filter van 0.22-µm spuit voor sterilisatie.
      Opmerking: Houd de oplossingen van de PEGDA bedekt met een folie verpakken om hen te beschermen tegen licht. Bereid e....

Results

Het protocol bioactieve om patronen te creëren op het oppervlak van PEG hydrogels wordt geïllustreerd in Figuur 1. Een werkblad werd ontwikkeld voor het berekenen van het volume en de concentratie voor elke stockoplossing (tabel 1A). Eiwitten te worden geïmmobiliseerd op het oppervlak van de hydrogel worden gewijzigd met 2-iminothiolane (Figuur 1B). Deze reactie wordt uitgevoerd met behulp van de.......

Discussion

Dit protocol biedt een methode voor het maken van bioactieve eiwitten patronen voor biologische toepassingen. Er zijn verschillende wijzigingen die kunnen worden gemaakt om te passen dit protocol voor verschillende experimenten. Ten eerste hangt cel koppelingseisen voor verschillende soorten cellen. Als arme cel gehechtheid aan de gels in eerste instantie wordt waargenomen, wordt verhoging van de concentratie van het ECM-eiwit binnen de voorloper oplossing geadviseerd. Andere ECM-eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)			Synthesized in lab
Fibronectin	Corning	356008	Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.
Binder Clips	Various Vendors
Compact UV Light Source (365nm)	UVP	UVP-21	Other UV light sources can be used, calibration of power is required.
2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent)	Thermo Sci.	26101
Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Sci.	22582
human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Lonza		passage number between 6- 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance
0.25% Trypsin EDTA	Life Tech	25200-056
Trypsin Neutralizer	Life Tech	R-002-100
Centrifuge	Various Venders
Hemocytometer	Hausser Sci. Bright-line
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22µm filter	Cell Treat	229743
1mL Syringe
Glass Microscope Slides	Fisher Sci.	12-550C
Plastic spacers	Various Venders		0.5mm thickness
70% Ethanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
Desalting Resin - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Columns	Thermo Sci.	PI69725
AR-G2 rehometer	TA Instruments