Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Summary

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Abstract

Er zijn vele biologische stimuli die gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie beïnvloeden kunnen. Benaderingen van de cultuur van de algemene cel, is afhankelijk van oplosbare factoren binnen de middellange tot controle cel gedrag. Echter oplosbaar toevoegingen kunnen niet na te bootsen bepaalde signalering van motieven, zoals matrix-gebonden groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijke biochemische signalen, die gemeenschappelijke invloeden op de cellen. Bovendien, biofysische eigenschappen van de matrix, zoals substraat stijfheid, spelen een belangrijke rol in het lot van de cel, die is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van conventionele cel culturing praktijken. In deze methode beschrijven we een eenvoudig protocol om gedessineerde bioactieve eiwitten op synthetische polyethyleenglycol (PEG) hydrogels Fotochemie gebruiken. Dit platform zorgt voor de onafhankelijke controle van substraat stijfheid en ruimtelijke biochemische signalen. Deze hydrogels kunnen een groot aantal fysiologisch relevante stijfheid waarden bereiken. Bovendien, kunnen het oppervlak van deze hydrogels photopatterned met bioactieve peptiden of eiwitten via thiol-een klik op scheikunde reacties. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden van eiwitfunctie na oppervlakte immobilisatie. Dit is een veelzijdige protocol dat kan worden toegepast op elke proteïne of peptide van belang zijn voor het maken van een verscheidenheid aan patronen. Ten slotte kunnen cellen uitgezaaid op het oppervlak van deze bioactieve hydrogels na verloop van tijd worden gecontroleerd als ze op ruimtelijk specifieke signalen reageren.

Introduction

Er zijn vele prikkels die cel gedrag beïnvloedt. In het algemeen, typische cel kweken technieken afhankelijk van oplosbare factoren te ontlokken cellulaire reacties; Er zijn echter beperkingen aan deze benadering. Deze methoden zijn niet juist weergegeven in alle signalering motieven voorkomende in vivo. Dergelijke signalering mechanismen zijn afgezonderd groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijk-specifieke biochemische signalen. Bovendien, substraat stijfheid kan spelen een belangrijke rol in gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie en is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van gemeenschappelijke cel kweken praktijken^1,2. Biomaterial benaderingen bieden een nieuw platform om te beginnen met het verkennen van deze signalering mechanismen. In het bijzonder, zijn hydrogels uitstekende kandidaten voor het afstemmen van substraat stijfheid^3,4, immobilizing eiwitten en peptiden^5,6, en creëren van ruimtelijk specifieke patronen^{7, 8}.

Hydrogels worden vaak gebruikt als steigers in weefselengineering vanwege hun biofysische en biochemische raakvlakken met de extracellulaire matrix (ECM)^9,10. Natuurlijke polymeren zijn gemeenschappelijke keuzen voor steigers, zoals ze biocompatibel zijn en zich in vele weefsels van het lichaam bevinden. De beperking van het gebruik van natuurlijke polymeren als substraten is dat zij niet gemakkelijk gemanipuleerd chemische wordt voor bioconjugation. Aan de andere kant, zijn synthetische hydrogels, zo zoals PEG, uitstekende platforms voor gerichte oplossingen^11,12. Bovendien, PEG hydrogels niet doen uitlokken een cellulaire reactie en daarom als inerte backbones voor het maken van bioactieve steigers worden gebruikt.

To create bioactieve hydrogels, click zowel photopolymerization als thiol-een scheikunde reacties werkzaam zijn. Deze photoreactions vereisen een photoinitiator en een UV-lichtbron. Wanneer photoinitiators worden ingevoerd voor UV-licht, breken obligaties aan formulier radicalen. Scripties radicalen zijn nodig voor het initiëren van de reactie maar kunnen een negatieve invloed hebben op eiwit topicale^12,13. Daarom is het cruciaal om photoinitiator en UV blootstelling tijden om eiwit topicale te optimaliseren.

Bij deze methode worden de hydrogels gesynthetiseerd door acrylaat-acrylaat keten groei photopolymerization. PEG-diacrylate (PEGDA) monomeren reageren met elkaar om te vormen van vertakte polymeer netwerken die verantwoordelijk zijn voor de structuur van de hydrogel. De concentratie van PEGDA monomeren binnen de gel voorloper oplossing zullen beheersen de stijfheid van het substraat. Als gevolg van de kleine porie grootte de hydrogel, ECM eiwitten zoals fibronectine kunnen gemakkelijk worden opgenomen binnen de hydrogel ten behoeve van de bijlage van de cel. Ten slotte, deze hydrogels kan oppervlak-patroon met bioactieve peptiden of eiwitten via thiol-een klik op scheikunde reacties. Hier, zal spoorverontreiniging gratis acrylaten binnen de hydrogel systeem reageren met gratis thiolen gelegen op de proteïne of peptide wanneer blootgesteld aan UV-licht. Nadat de proteïnen of de peptiden zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak van de hydrogel, kan de hydrogel worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken zonder verlies van topicale. Dit biedt gemak, flexibele experimentele planning en de mogelijkheid voor samenwerking tussen laboratoria. Globaal, dit platform biedt biomechanische en ruimtelijke biochemische controle, onafhankelijk van elkaar, voor de gelegenheid om de cellulaire gedrag beïnvloedt.

Protocol

1. voorbereiding van de materialen voor Hydrogel synthese

1. voorbereiden voorraadoplossingen van PEGDA, lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) en fibronectine onder steriele omstandigheden en op basis van berekeningen (tabel 1A).
   1. Weeg en ontbinden van verbindingen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Meestal houden PEGDA oplossing concentraties tussen 50 en 200 mg/mL (5-20% gewicht/volume) werken. Pipetteer van de PEGDA oplossing door een filter van 0.22-µm spuit voor sterilisatie.
      Opmerking: Houd de oplossingen van de PEGDA bedekt met een folie verpakken om hen te beschermen tegen licht. Bereid een verse oplossing van PEGDA (aanbevolen) voor elk experiment.
   2. Reconstrueren fibronectine eiwit poeder op basis van de fabrikant ' s aanbeveling. Handhaven van de stockoplossing van fibronectine bij 1 mg/mL, aliquoot in 60 tot 100 µL aliquots, en hen bewaren bij-20 ° C tot gebruik. Ontdooi de aliquots bij 4 ° C voor enkele uren of 's nachts voordat gebruiken. Als eiwit voorraad niet al wordt geleverd onder steriele omstandigheden, een 0,22 µm spuit filter gebruiken voor sterilisatie.
      Opmerking: Fibronectine wordt gebruikt voor bevestiging van de cel. Andere ECM-eiwitten kunnen worden vervangen.
   3. Weeg schoot voor de stockoplossing en ontbinden in PBS; een typische voorraad concentratie is 25 mg/mL. Bewerk ultrasone trillingen ten als er geen problemen met de ontbinding. Laat de oplossing door een 0,22 µm filter voor sterilisatie. Betrekking hebben op de schoot met een folie verpakking en houd het bij 4 ° C voor tot enkele maanden.
      Opmerking: Ronde is de photoinitiator gebruikt voor de fotochemie.
2. Steriele glazen dia mallen voorbereiden hydrogel vorming.
   1. Autoclaaf een polyester blad; één voor elke gel mal nodig is. Geniet van twee glazen dia's en drie plastic spacers (0,5 mm dik) voor elke gel schimmel in 70% ethanol voor ten minste 2 uur, maar over het algemeen laten 's nachts weken. Geniet van vijf bindmiddel clips voor elke gel schimmel in 70% ethanol voor 10 min vóór gebruik.
   2. De glazen dia's, spacers en bindmiddel clips op een kleine gesteriliseerde met autoclaaf vel plaatsen in de cel cultuur kap te laten in de lucht droog urenlang.
   3. Voorbereiden hydrogel mallen door het plaatsen van kunststof afstandhouders rond de rand van een glasplaatje. Plaats de tweede glasplaatje op bovenkant. Veilig de spacers strak naast elkaar met bindmiddel clips, twee aan elke lange zijde en een bovenop.
      Opmerking: Als dit is niet goed gemonteerd, de gel-oplossing zal uitlekken.
   4. Oppervlak-steriliseren de mal met celkweek hood UV-licht voor 30 min vóór gebruik. Halverwege, flip de mal om beide oppervlakken bloot.

2. Wijzigen van eiwitten met een gratis Thiol

1. bereiden van stamoplossingen berekeningen uit het werkblad gebruiken voor het omzetten van amine in thiol op eiwitten (tabel 1A).
   1. Te maken van de buffer van de reactie, de PBS pH 8 aanpassen en toevoegen van 5 mM EDTA. Pipetteer reactie buffer in een 0,22 µm spuit filter voor sterilisatie.
      Opmerking: EDTA is belangrijk, aangezien het thiolen beschermt tegen vormen van disulfide bindingen. Thiol-groepen moeten blijven in hun gereduceerde vorm voor de reactie optreden.
   Weeg
   2. 2-iminothiolane (Traut ' s reagens) en los het op in reactie buffer voor een concentratie van de stockoplossing van 2 mg/mL (14 mM). Laat de oplossing door een filter van 0.22-µm spuit voor sterilisatie. Opslaan van de stockoplossing bij 4 ° C voor tot enkele maanden.
      Opmerking: 2-iminothiolane is de molecule die reageert met gratis amines oplosmiddel-blootgesteld op de eiwitten en omgezet in vrije thiolen.
   3. Reconstrueren de proteïne in reactie buffer bij een concentratie tussen 0,1 en 1 mg/mL. Tenzij eerder steriele, Pipetteer van deze oplossing door een filter van 0.22-µm spuit voor sterilisatie.
      Opmerking: Dit eiwit is de biochemische signaal dat patroon zal worden op het oppervlak van de hydrogel. Ook, terwijl eiwit concentraties variëren kunnen, hogere concentraties zijn ideaal voor sterkere eiwit patronen.
2. Reageren het eiwit met 2-iminothiolane door het mengen van beide stamoplossingen samen; tabel 1B gebruiken voor het berekenen van de juiste volumeverhouding. Normaal gesproken gebruikt een molaire verhouding van 8:1 2-iminothiolane aan proteïne.
   Opmerking: Voor grotere proteïnen of meer concentraties Verdun, een hogere molaire ratio van 2-iminothiolane gebruiken. Raadpleeg de fabrikant ' s protocol ¹⁵.
3. Laat de reactie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Demineralisatie spin micro-kolom gebruiken om het thiolated eiwit product van de resterende reactanten, na de fabrikant ' s protocol ¹⁶.
   Opmerking: De limiet van de uitsluiting van deze hars is 5 KDa.
4. Gebruik Ellman ' s Assay voor kwantitatief maatregel het aantal gratis thiolen per eiwit. Volg de fabrikant ' s-protocol voor de assay ¹⁷.

3. Hydrogel vorming

1. maken de gel voorloper oplossing gebaseerd op waarden berekend op basis van tabel 1 c. Meng de PEGDA, fibronectin en ronde volumes. Pipetteer de oplossing krachtig om te zorgen voor een homogene oplossing, maar voorkomen dat er bubbels. Bewaar deze oplossing beschermd tegen licht.
2. Pipetteer de gel voorloper oplossing zorgvuldig tussen de twee glazen dia's van de gel-schimmel. Typisch, het toevoegen van een volume tussen 800 en 1.000 µL aan de mal. Blootstellen van de gel-oplossing in de mal aan UV-licht (golflengte: 365 nm, vermogen: 3-4 mW/cm ²) gedurende 1-2 minuten te vormen van de hydrogel.
   Opmerking: Niet blootstellen aan de hydrogel aan langdurige UV-licht, als het de oppervlakte-proteïne patronen mogelijkheden zal beperken.
3. Opstijgen het bindmiddel clips en zachtjes verwijderen top glasplaatje door toepassing tegenover de druk op de twee zijden spacers.
4. Gebruik een gepaste afmetingen biopsy punch te knippen uit de hydrogel monsters. Punch uit meerdere hydrogels van de gel rechthoek monsters te dienen als replicatieonderzoeken.

4. Hydrogel stijfheid metingen

1. Punch out hydrogels met een 8 mm-diameter biopsy punch voor een 8 mm parallel plaat rheometer. Een hydrogel monster laden in de rheometer (Zie de Tabel van de materialen).
2. Lagere de parallelle plaat geometrie dat is 8 mm diameter tot maken contact met het oppervlak van de gel. Bewaar een afstand van de kloof van 0.5 mm voor een steekproef van 0.5 mm dik hydrogel.
3. Uitvoeren tijd veegt voor 5 min 0,1% stam, 0,1 Hz frequentie en 37 ° C. gemiddelde de G ' waarden in elke tijd sweep. Uitvoeren van onafhankelijke hydrogels voor replicatieonderzoeken van elke samenstelling.
   Opmerking: De G ' waarden moet stabiel over de tijd punten; Als zij niet, procent stam en frequentie veegt dient te worden uitgevoerd om te selecteren van de juiste waarden ¹⁴.

5. Eiwit patronen

1. voorbereiden het gewenste patroon voor de photomask met behulp van een computer aided design (CAD) programma. De photomask op een transparant vel met behulp van een hoge-resolutieprinter afdrukken. Geniet van de photomask in 70% ethanol voor 10 min vóór gebruik. De photomask aan de lucht drogen in een cel cultuur kap vóór gebruik toestaan.
2. De thiolated eiwit oplossing bereid in stap 2 aan de oppervlakte van de hydrogel voor oppervlakte patronen toevoegen. Pipetteer van 1-2 µL/cm ² van thiolated eiwit oplossing op het oppervlak van elke gestanste gel.
   Opmerking: Het is belangrijk om te minimaliseren van het volume van het eiwit; alleen toevoegen genoeg zijn om gelijkmatig bestrijken het gehele oppervlak van het monster hydrogel.
3. Zorgvuldig plaats de photomask op het oppervlak van de hydrogel. Laat geen luchtbellen tussen de photomask en het oppervlak van de hydrogel. Zachtjes druk naar beneden op het masker te verwijderen alle bubbels van dat formulier.
4. Bloot de hydrogel voor een tweede ronde van UV-licht (golflengte: 365 nm, vermogen: 3-4 mW/cm ²) voor 30-60 s.
   Opmerking: Het is belangrijk het patroon blootstelling aan voldoende UV-licht patroon te maken een sterke zonder het verlies van eiwitfunctie.
5. Wassen de hydrogels met PBS spoorverontreiniging soorten verwijderen en plaatsen van elke hydrogel binnen de goed plaat. Wees voorzichtig met het plaatsen van de gels in elk putje; Zorg ervoor dat het patroon oppervlak gezicht is. Wassen van de gels in PBS bij 4 ° C; gels zijn stabiel gedurende ten minste twee weken bij 4 ° C.

6. Hydrogels voorbereiden cel zaaien

1. broeden de gels in basale medium voor 5-10 minuten bij 37 ° C vóór het zaaien. Endotheliale cellen (HUVECs), gebruik voor menselijke navelstreng ader BAVA-2 medium zonder groeifactoren. Minimaliseren van de hoeveelheid medium toegevoegd aan elk goed om te voorkomen dat hydrogel zweven. Gebruik voor een 48-well plaat, een 250 µL volume medium.
2. Spin down de plaat duikt met 300 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat de hydrogels zich op de bodem van de put bevinden en niet drijven. Dit doen vóór cel zaaien.

7. Seeding op Hydrogels Cell

1. gebruik standaard steriele zoogdieren cel cultuur procedures voor cel zaaien en experimentele. HUVECs uit weefselkweek kolven met behulp van de protocollen van het detachement van de standaard cel verwijderen. Wassen van de weefselkweek schotel met steriel PBS en incubeer met trypsine gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
2. De trypsinized celsuspensie met overtollige cell medium of trypsine neutralisator oplossing quench.
3. Spin down de celsuspensie in de centrifuge op 300 x g voor 5 min. Verwijder voorzichtig het supernatant en het houden van de cel-pellet.
4. Resuspendeer de pellet cel in basale BAVA-2 met geen groeifactoren. Gebruik van een hemocytometer voor het tellen van de cel.
5. Toevoegen 75.000 cellen/cm ² aan elke hydrogel oppervlak door pipetteren langzaam in het midden van elk goed dus niet te verstoren de gels. Plaats de goed plaat in een cel cultuur incubator bij 37 ° C. Voor meerdere dagen, periodiek de schotel voor observatie verwijderen.

8. Evaluatie van topicale

1. cultuur, E. coli, overnachting in suspensie in de pond-Bouillon in een orbitale schorsing bij 37 ° C en 200 rpm. Spin down de E. coli-cultuur, decanteren en reconstrueren van de cel pellet in minimale volume van PBS. Weeg de lysozym en reconstrueren bij 1 mg/mL van de stockoplossing.
2. Pipetteer een klein volume (25 µL) van de stockoplossing lysozym in microcentrifuge buizen. Toevoegen van verschillende niveaus van ronde photoinitiator (0-12 mM) en bloot de monsters aan 1 min van UV-licht. In een aparte groep, dezelfde hoeveelheid LAP (2 mM) aan lysozym oplossing toevoegen en bloot monsters naar verschillende UV licht tijden (0-4 min). Opnemen van replicatieonderzoeken voor elke behandeling.
3. Toevoegen gelijke hoeveelheid geconcentreerde E. coli oplossing voor elk monster lysozym voor een definitieve lysozym eiwitconcentratie van 0,5 mg/mL. De gemengde oplossingen voor 4 uur bij kamertemperatuur incuberen.
   Opmerking: Dit geeft tijd voor functionele lysozym lyse van de celwand en introductie van eiwitten in de oplossing.
4. Gebruik van onbehandelde lysozym geïncubeerd met E. coli voor een positieve controle; beschouw dit als een 100% bioactieve meting. Gebruik lysozym oplossing geïncubeerd met PBS alleen als een negatieve controle.
5. Spin naar beneden de monsters te verwijderen cel puin en houden het supernatant. Uitvoeren van een analyse van Bradford om te kwantificeren van de totale concentratie van eiwitten binnen het supernatant voor het meten van de hoeveelheid bacteriële lysate.
6. Uitvoeren van een analyse van Bradford na de fabrikant ' s protocol ¹⁸. Bereken de vouw wijzigen in eiwitconcentratie in vergelijking met de negatieve controle.

Results

Het protocol bioactieve om patronen te creëren op het oppervlak van PEG hydrogels wordt geïllustreerd in Figuur 1. Een werkblad werd ontwikkeld voor het berekenen van het volume en de concentratie voor elke stockoplossing (tabel 1A). Eiwitten te worden geïmmobiliseerd op het oppervlak van de hydrogel worden gewijzigd met 2-iminothiolane (Figuur 1B). Deze reactie wordt uitgevoerd met behulp van de...

Discussion

Dit protocol biedt een methode voor het maken van bioactieve eiwitten patronen voor biologische toepassingen. Er zijn verschillende wijzigingen die kunnen worden gemaakt om te passen dit protocol voor verschillende experimenten. Ten eerste hangt cel koppelingseisen voor verschillende soorten cellen. Als arme cel gehechtheid aan de gels in eerste instantie wordt waargenomen, wordt verhoging van de concentratie van het ECM-eiwit binnen de voorloper oplossing geadviseerd. Andere ECM-eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Kan ook worden gesynthetiseerd of gekocht bij andere leveranciers. Er kunnen verschillende molecuulgewichten worden gebruikt.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)			Gesynthetiseerd in het laboratorium
Fibronectin	Corning	356008	Andere celhechtingsproteïnen kunnen worden gebruikt, zoals laminine, matrigel
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Fotomasker	FineLine Imaging	n/a	Aangepaste afdrukken op transparante vellen met hoge resolutie DPI.
Binderclips	Verschillende leveranciers
Compacte UV-lichtbron (365nm)	UVP	UVP-21	Andere UV-lichtbronnen kunnen worden gebruikt, kalibratie van vermogen is vereist.
2-iminothiolan (Pierce Traut’s Reagens)	Thermo Sci.	26101
Ellman’s Reagens: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoëzuur)	Thermo Sci.	22582
menselijke umbilicale vene endotheelcellen (HUVEC's)	Lonza		passagenummer tussen 6- 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 zonder groeifactoren werd gebruikt in experimenten. Volledig EGM-2-medium werd gebruikt voor celonderhoud
0,25% Trypsine EDTA	Life Tech	25200-056
Trypsine Neutralizer	Life Tech	R-002-100
Centrifuge	Verschillende verkopers
Hemocytometer	Hausser Sci. Bright-line
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22µm filter	Cell Treat	229743
1mL-spruit
Glazen microscoopglaasjes	Fisher Sci.	12-550C
Kunststofafstandsstukken	Verschillende leveranciers		0,5 mm dik
70% Ethanol	BICCA	2546.70-1
Bio-shield	Bio-shield	19-150-0010
Bradford Reagens	BIO-RAD
Ontzoutingshars - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Kolommen	Thermo Sci.	PI69725
AR-G2 rehometer	TA Instruments