Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

Summary

Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.

Abstract

Het segment patch-clamp techniek is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van leren-geïnduceerde Neurale plasticiteit in specifieke hersengebieden. We getraind om te analyseren motor-leren geïnduceerde plasticiteit, ratten met behulp van een versnelde rotor staaf taak. Ratten uitgevoerd de taak 10 keer met tussenpozen van 30-s 1 of 2 dagen. Prestaties is aanzienlijk verbeterd op de trainingsdagen in vergelijking met het eerste proces. Wij bereid dan acute hersenen segmenten van de primaire motorische cortex (M1) bij ongetrainde en opgeleide ratten. Current-clamp analyse toonde dynamische veranderingen in de rust van de membraanpotentiaal, spike drempel, nahyperpolarsatietijd en membraan weerstand in laag II/III piramidale neuronen. Huidige injectie veroorzaakte veel meer pieken in de 2-daagse opgeleide ratten dan in ongetrainde besturingselementen.

We getraind om te analyseren contextuele-learning geïnduceerde plasticiteit, ratten gebruikend de taak van een remmende vermijden (IA). Na het ervaren van voet-schok in de donkere kant van een doos, leerde de ratten te vermijden, blijven in de brandende zijde. Wij bereid acute hippocampal segmenten van ongetrainde, IA-opgeleid, ongepaarde en walk-through ratten. Spanning-clamp analyse werd gebruikt om opeenvolgend opnemen miniatuur excitatory en remmende postsynaptisch stromingen (mEPSCs en mIPSCs) van de dezelfde CA1 neuron. We vonden verschillende gemiddelde mEPSC en mIPSC amplitudes in elke CA1-neuron, wat erop wees dat elk neuron had verschillende postsynaptisch sterktes zijn excitatory en inhiberende synapsen. Bovendien hadden in vergelijking met ongetrainde besturingselementen, IA-opgeleid ratten hogere mEPSC en mIPSC amplitudes, met grote diversiteit. Deze resultaten voorgesteld dat contextuele leren postsynaptisch diversiteit in zowel excitatory en inhiberende synapsen op elke CA1 neuron creëert.

AMPA of GABA_A -receptoren leek te bemiddelen de postsynaptisch stromingen, sinds bad behandeling met CNQX of bicuculline de mEPSC of mIPSC gebeurtenissen, respectievelijk geblokkeerd. Deze techniek kan worden gebruikt om het bestuderen van verschillende soorten leren in andere gebieden, zoals de sensorische cortex en de amygdala.

Introduction

De patch-clamp techniek, ontwikkeld door Neher en Sakmann, wijd gebruikt voor elektrofysiologische experimenten¹. De geheel-cel patch-clamp techniek² kan worden gebruikt om intracellulaire stroom en spanning met behulp van het zegel van de gigaohm van de celmembraan. De current-clamp techniek kan we analyseren van de verschillen in de eigenschappen van de membraan zoals potentieel, weerstand en capaciteit³rusten. De voltage-clamp techniek kan we analyseren van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit op zowel excitatory en inhiberende synapsen.

De primaire motorische cortex (M1) is een centrale regio die cruciaal is voor het maken van geschoolde vrijwillige bewegingen. Vorige elektrofysiologische studies aangetoond dat de ontwikkeling van lange termijn potentiëring (LTP)-graag plasticiteit in laag II/III excitatory af na geschoolde motor opleiding⁴. Bovendien, in vivo imaging studies verder aangetoond het remodelleren van M1 dendritische spines na een geschoolde bereiken taak^5,6. Leren-geïnduceerde synaptic en intrinsieke plasticiteit is echter niet aangetoond in M1 neuronen.

We hebben onlangs gemeld dat een taak van de staaf rotor bevorderd dynamische veranderingen in glutamaterge en GABAergic synapses en de intrinsieke plasticiteit in M1 laag II/III neuronen⁷gewijzigd. Hier wordt het segment patch-clamp techniek gebruikt om te leren-geïnduceerde plasticiteit onderzoeken. Deze techniek kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van andere soorten ervaring-afhankelijke plasticiteit in andere hersengebieden. Bijvoorbeeld, sensorische input in de cortex vat AMPA receptor-gemedieerde excitatory inbreng laag II/III neuronen⁸kan versterken, en gecued vreesconditionering versterkt de excitatory-ingangen op de laterale amygdala neuronen, die is vereist voor angst geheugen⁹. Bovendien schept de contextuele leren diversiteit in termen van excitatory en remmende synaptic inbreng hippocampal CA1 neuronen^10,11.

Protocol

alle dierverblijven en chirurgische procedures werden overeenkomstig de richtsnoeren voor dier experimenten van Yamaguchi University School of Medicine en zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Yamaguchi Universiteit.

1. dieren

1. gebruik van 4 naar 5-week-oude mannelijke Sprague-Dawley ratten (postnatale 28 tot en met 31 dagen oud).
2. Huis de ratten in individuele plastic kooien (40 cm × 25 cm × 25 cm) op een constante temperatuur (23 ° C ± 1 ° C) gehouden onder een 12-h licht/donker cyclus. Ratten ad libitum toegang tot water en voedsel geven.

2. Rotor staaf test

1. te onderzoeken van motorische vaardigheden leren, elke rat onderworpen aan de rotor staaf test (rod diameter 7 cm, breedte van de rijstrook 8,9 cm; valhoogte 26.7 cm) voor 1 of 2 opeenvolgende dagen ( figuur 1A in Kida et al., 2016 < sup Class = "xref" > 7). De taak uitvoeren in een rustige, temperatuurgevoelig kamer (23 ± 1 ° C). Niet storen of omgaan met ratten voorafgaand aan de test
2. Instellen van de staaf van de rotor naar versnellingsmodus uit te schakelen, die lineair van 4 rotaties/min 40 rotaties/min (8 π/min naar 80 π/min) in 5 min. stijgt
3. Zet de rat op de rust roterende staaf. Bevestigen dat alle ledematen op stang.
4. Meten van de latentie te vallen van de roterende staaf om motor prestaties te evalueren.
5. Kunnen elke rat 10 pogingen (proeven) met 30-s intervallen.
6. Als de rat van de roterende staaf valt, zet deze dan op de staaf weer na een 10-20 s interval.
7. Offeren de rat met een overdosis van pentobarbital (400 mg/kg) 30 min na het laatste proces. Injecteren van ongetrainde controle ratten met de dezelfde dosis van verdoving in hun huis kooien.

3. Remmende vermijden test

1. te onderzoeken contextuele leren, onderwerp ratten aan een remmende vermijden (IA) test ( Figuur 1 d in Mitsushima et al., 2011, 2013 ^{10 , 11}) Vermijd elke episodische ervaringen op de dag van het experiment zoals contact met anderen, kooi wijzigingen of reinigen van schijven. Uitvoeren van de taak in een rustige, temperatuurgevoelig kamer (23 ± 1 ° C).
   Opmerking: Het apparaat van de opleiding IA is een twee-chambered acryl box (lengte 33 cm, breedte 58 cm, hoogte 33 cm). Het heeft een verlichte veilige kant en een donkere schok kant die worden gescheiden door een valdeur ( Figuur 1 d).
2. Plaatst de rat in de veilige (verlichte) zijde van de verlichte vak. De rat zachtjes zonder stress omgaan.
3. Wacht een korte periode (10 tot 20 s) om te acclimatiseren van de rat voor het milieu.
4. Openen van de schuifdeur zodat de rat in te voeren van de donkere kast bij zal.
5. Meten de latentie (s) voordat de rat de nieuwe donkere kant van het vak treedt. De latentie van het eerste proces vertegenwoordigt de rat ' s prestaties vóór opleiding.
6. Na de inwerkingtreding van de donkere kant, sluit de deur en een gecodeerde elektrische voet schokken (2 s, 1.6 mA) via elektrische stalen stangen instellen in de vloer van het vak. Toestaan walk-through ratten te verkennen van de apparatuur van de opleiding voor 1 min zonder geschokt. Huis ongepaarde ratten in een kooi van de verlichte schok voor verschillende geven dagen en plotseling de schok zonder episodische ervaringen. Voorzichtig behandelen zonder stress in alle groepen.
7. Laat elke rat in het donkere vak voor 10 s voordat u het terugkeert naar de kooi.
8. Op 30 min na de schok van de voet, plaats opnieuw de rat in de brandende zijde van het vak. Meten van de latentie Voer de schaduwzijde.
9. De rat terugkomen in hun kooi.
10. Op 60 min na de schok, offeren de rat met een overdosis van pentobarbital (400 mg/kg). De rat zachtjes behandelen en inspuiten van de verdoving intraperitoneally. In ongetrainde controle ratten, injecteert de narcose in hun huis kooien zonder de hierboven beschreven ervaring.

4. Dissectie buffer

1. ontbinding van de kristallen van 0,195 g NaH ₂ PO ₄-2 H ₂ O 0.188 g KCl, 0.074 g CaCl ₂, 1.423 g MgCl ₂-6 H ₂ O en 12.579 g Cholinechloride in ultrazuiver water (900 mL tot 950 mL) . Zie tabel 1.
2. Ontbinding van de kristallen van 2.340 g ascorbinezuur, 0.342 g pyrodruivenzuur natriumzout, 2.100 g NaHCO ₃ en 4.500 g glucose.
3. Toevoegen van water tot 1000 mL. Het bereik van de osmolaliteit zullen 290 mOsm/L à 300 mOsm/L. aanpassen osmolaliteit door toevoeging van ultrazuiver water, als het over het bereik.
4. De oplossing met 5% CO ₂ bubble / 95% O ₂ gas mengsel bij ijskoude temperaturen gedurende 5 minuten vóór gebruik.

5. Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF)

1. los kristallen van 0.186 g 6.700 g NaCl, KCl, en 0.156 g NaH ₂ PO ₄-2 H ₂ O in ultrazuiver water (900 mL tot 950 mL). Zie tabel 2.
2. Bubble met het gasmengsel voor 5 min.
3. Los kristallen van 1.800 g glucose en 2.184 g NaHCO ₃ en voeg vervolgens 4 mL MgCl ₂ en 4 mL CaCl ₂ van 1 M voorraad oplossingen.
4. Toevoegen van water tot 1000 mL. Het bereik van de osmolaliteit zullen tussen 290 mOsm/L en 295 mOsm/L. aanpassen osmolaliteit door toevoeging van ultrazuiver water, als het over het bereik.
5. Bubble met de gas mengsel vóór gebruik.

6. Intracellulaire oplossingen

1. For current-clamp opnamen (tabel 3), Los 0.0746 g KCl, 6.089 g K-gluconaat, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA en 500 µL MgCl ₂ van 1 M stockoplossing in 180 mL ultrazuiver water (Breng de pH op 7,2 met KOH).
   1. 0.4408 g nb ₂ - ATP, 0.0418 g Na ₃ - GTP en 0.510 g nb-phosphocreatine toevoegen. Voeg water toe tot 200 mL en breng de pH op 7,35 met KOH.
   2. Aanpassen de osmolaliteit tot ongeveer 290 mOsm/L door toevoeging van ultrazuiver water.
   3. Winkel als 1-mL aliquots in de diepvries (-30 ° C).
2. Voor spanning-clamp opnamen (tabel 4), los 5.244 g CsMeSO ₃, 0.672 g CsCl, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA en 500 µL MgCl ₂ van 1 M oplossingen in 180 mL ultrazuiver water op voorraad. Breng de pH op 7,2 met CsOH. Voor mEPSP en mIPSP-opnamen, kunt gewijzigde concentratie van 5.814 CsMeSO ₃ en 0.252 g CsCl aanpassen van het potentieel van de omkering van de GABA _A receptor antwoord ¹¹.
   1. 0.4408 g nb ₂ - ATP, 0.0418 g Na ₃ - GTP en 0.510 g nb-phosphocreatine toevoegen. Voeg water toe tot 200 mL en breng de pH op 7,35 met CsOH.
   2. Aanpassen de osmolaliteit tot ongeveer 290 mOsm/L door toevoeging van ultrazuiver water.
   3. Winkel als 1-mL aliquots in de diepvries (-30 ° C).

7. Snijd voorbereiding

1. Prior te offeren, cool-down alle dissectie tools met crushed ijs ( figuur 2A). Voeg ongeveer 500 mL koud water in de container gemalen ijs toe het contact oppervlak. Deze procedure werd beschreven eerder ^{10 , 11 , 12}.
   Opmerking: De tools zijn: grote schaar, iris schaar, een spatel, een micro spatel, pincet, pincet, een 200 mL-bekerglas van roestvrij staal, een mes voor hersenen trimmen, een 120 mL cardiale perfusie spuit gevuld met dissectie buffer behandeld met het mengsel van koolwaterstofgassen, een Siliconen slang (20 cm) aangesloten op een afgevlakte 18-gauge naald, een RVS hersendissectie stadium (dikte = 3 mm, ϕ = 12 cm), en een montage-podium voor de vibratome (ϕ = 5 cm).
2. Offeren de rat 30 min na het voltooien van de gedragsmatige paradigma door het anesthetizing met een overdosis van pentobarbital (400 mg/kg lichaamsgewicht). Het uitvoeren van de voorbereiding van de segment snel om ervoor te zorgen dat de segmenten zo gezond als mogelijke ^{10 , 11 , 12 zijn}. De hersenen extractie protocol voldoet aan alle veterinaire normen voor onze universiteit.
3. Vulling een 120 mL injectiespuit met ijskoude dissectie buffer (tabel 1) borrelen met een 5% CO ₂ / 95% O ₂ gas mengsel. Verwijder eventuele luchtbellen vóór perfusie.
4. Na het hart bloot, plaats de naald in het achterste gedeelte van het linkerventrikel.
5. Uitvoeren transcardial perfusie van de hersenen handmatig met behulp van de spuit. Grotere ratten vereisen meer dissectie buffer voor perfusie. Onderdompelen van de hersenen met ijskoude dissectie buffer voor 5 min. Bubble de buffer voortdurend tijdens de onderdompeling.
6. Trim de posterieure zijde van de hersenen op een hoek parallel aan de dendritische oriëntatie van de corticale regio van doel, met behulp van een mes. Aangezien de hersenen is staan op het podium van de dissectie met de gesneden einde bodem, bepaalt de initiële hoek de hoek van alle segmenten van de latere hersenen. Deze stap is cruciaal belang ( figuur 2B). Een onjuiste hoek kan doorsnijden de doelgroep piramidale neuronen.
   Opmerking: De tools zijn: een mes voor hersenen trimmen, een filtreerpapier (ϕ = 10 cm), een RVS hersendissectie stadium (dikte = 3 mm, ϕ = 12 cm), een spatel, secondelijm, een druppelaar en een montage-podium voor de vibratome (ϕ = 5 cm).
7. Knippen 350-µm dik coronale hersenen segmenten met behulp van een vibratome. Vul de dissectie kamer met ijskoude buffer met een 5% CO _{2 borrelen} / 95% O ₂ gas mengsel ( figuur 2C). De buffer voortdurend tijdens de hersenen segment bubble.
8. Bijsnijden van de rand van het doelgebied met behulp van iris schaar.
9. Wassen de bijgesneden segmenten zachtjes in kamertemperatuur aCSF met 5% CO ₂ / 95 borrelen % O ₂ (tabel 2).
10. Behouden de bijgesneden segmenten in een zaal van de interface tot de opname is uitgevoerd ( figuur 2D- en E). Incubatie gedurende 1 uur in de zaal verbetert de conditie van de cellen, maar de fenotypes veranderen als de segmenten worden gedurende meer dan 10 uur geïncubeerd. Sluit het deksel van de kamer om te omsluiten de gassen en de kleine vloeistof druppels aCSF.

8. Geheel-cel patch klem

Opmerking: geheel-cel opnames vereisen een versterker en een low-pass filter dat is ingesteld op een cutoff frequentie van 5 kHz. De signalen zijn gedigitaliseerd en opgeslagen in een PC. De opgeslagen gegevens worden geanalyseerd off line ( figuur 3A).

1. Maken glas elektroden met behulp van een horizontale trekker. Vul de elektroden met een passende oplossing (tabellen 3 en 4) met behulp van een regelmatige polyethyleen 1 mL spuit gekoppeld aan een fijne glazen buis en een 0.22-µm filter.
2. Voorafgaand aan het contact met de cel, positieve druk blijven uitoefenen en aanpassen van de huidige nul pipet.
3. Na de vorming van een gigaohm zegel, toepassing onderdruk te scheuren van de celmembraan (geheel-cel configuratie in figuur 3F).

9. Current-clamp analyse

1. Eigenschappen van de celmembraan
   1. vullen de patch opname pipetten met de intracellulaire oplossing voor current-clamp opnamen (tabel 3). De weerstand van de Pipet is tussen 4 MΩ en 7 MΩ in de aCSF.
   2. Nadat het membraan breuken, houden de spanning membraan -60 mV in V-CLAMP modus. Vervolgens overschakelen van " bad " modus " cel " modus in de test van de membraan met behulp van software voor het meten van de intrinsieke Celeigenschappen zoals capaciteit van de membraan, weerstand en tijdconstante.
2. Huidige injectie studie
   1. na het opnemen van de intrinsieke Celeigenschappen, schakelt de modus uit V-CLAMP naar TRACK (ik = 0) /I-CLAMP NORMAL voor de huidige injectie. Merk op dat de vloeibare kruising potentieel niet gecorrigeerde ^{10 moet}.
   2. Invoeren in de cel voor 300 ms. huidige wijzigen de intensiteit van de stapsgewijze van huidige − 100 pA aan +550 pA met 50-pA verhogingen. Het aantal pieken (actie potentials) ontlokte door de huidige injecties.
   3. De minimale spanning nodig voor het opwekken van een actiepotentiaal (dit is de drempel spanning) meten.
   4. De nahyperpolarsatietijd amplitude berekenen als het verschil tussen de spanning aan spike initiatie en de laagste spanning bereikt tijdens nahyperpolarsatietijd ⁷.

10. Spanning-clamp analyse

1. de AMPA/NMDA verhouding
   Opmerking: The AMPA/NMDA verhouding is een conventionele manier te evalueren postsynaptisch plasticiteit op glutamaterge excitatory synapsen ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}. er echter rekening mee dat de daarmee gepaard gaande stijging van de beide componenten niet de verhouding ¹³ kunnen veranderen.
   1. Perfuse de kamer van de opname met fysiologische oplossing borrelen met het gasmengsel en handhaving van de temperaturen bij 22 ° C tot 25 ° C. toevoegen 0.1 mM picrotoxin aan de oplossing voor het blokkeren van de GABA-_A - gemedieerde reactie en voeg 4 µM 2- chloroadenosine te stabiliseren de evoked neurale reactie ¹⁴.
   2. Vullen de patch opname pipetten met de intracellulaire oplossing voor spanning-clamp opnamen (tabel 4). Controleer de weerstand van de Pipet van de opname in de aCSF. De weerstand is tussen 4 MΩ en 7 MΩ.
   3. Voor opname in de laag II/III piramidale neuronen in de M1, plaatst u een bipolaire wolfraam elektrode 200 µm tot 300 µm lateral aan de cellen die moeten worden opgenomen, onder het pial oppervlak in de regio van de voorpoot vertegenwoordiging stimuleren (2-mm lateral aan de middellijn) ^{15 , 16 , 17}.
   4. Voor opname in een piramidevormige neuron CA1, plaatst u de stimulerende elektrode 200 µm tot 300 µm laterale (Schaffer collateral fiber) of mediaal (temporoammonic weg) naar de cellen die zal worden geregistreerd ( figuur 3B).
   5. Verhogen van de intensiteit van de prikkel tot de synaptische reactie > 10 pA.
   6. Berekenen de AMPA/NMDA-ratio als de verhouding van de piekstroom gemeten bij − 60 mV naar het huidige gemeten bij + 40 mV bij 150 msec na het begin van de stimulus. Merk op dat 50 tot 100 sporen gemiddeld moeten worden voor de berekening van de verhouding.
2. Miniatuur postsynaptisch huidige opnamen
   Opmerking: miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs) worden verondersteld om te corresponderen met de reacties ontlokte door de presynaptische introductie van een enkele blaasje van glutamaat ¹⁸ . In tegenstelling, worden miniatuur remmende postsynaptisch stromingen (mIPSCs) verondersteld overeen moeten komen met de reacties ontlokte door de presynaptische introductie van een enkele blaasje van GABA ¹⁸. Stijgingen van de amplitudes van mEPSCs en mIPSCs weerspiegelt postsynaptisch transmissie te versterken, terwijl toeneemt in het geval van frequentie weerspiegelen de stijging van het aantal functionele synapsen of de waarschijnlijkheid van de presynaptische introductie ¹¹ .
   1. Vullen de patch opname pipet met gemodificeerde intracellulaire oplossing (tabel 4) aan te passen van het potentieel van de omkering van de GABA _A receptor-gemedieerde huidige tot -60 mV.
   2. Toevoegen 0,5 µM tetrodotoxine om het bad te blokkeren van spontane actie potentials.
   3. Houden de spanning aan -60 mV naar rECORD de mEPSC gebeurtenissen voor 5 min.
   4. Verandering hetbedrijf potentiële op 0 mV op record mIPSC gebeurtenissen gedurende 5 minuten. Omdat M1 neuronen Toon iets hoger omkering potentieel voor AMPA receptor-gemedieerde stromingen, de mIPSCs van M1 neuronen zijn opgenomen in de + 15 mV met 0,1 mM APV.
   5. Wacht een paar minuten voor de huidige te stabiliseren.
   6. De gebeurtenissen van de mIPSC voor 5 min. opnemen
   7. Detecteert de miniatuur gebeurtenissen met behulp van de software en gebeurtenissen boven 10 pA gebruiken voor de analyse. Het aantal mEPSCs of mIPSCs evenementen gedurende 5 minuten om te bepalen van de frequentie. Gemiddelde van de amplitudes van de gebeurtenissen te verkrijgen van de gemiddelde amplitude.
   8. Bevestigen of bad behandeling met 10 µM CNQX of met 10 µM bicuculline methiodide de gebeurtenissen mEPSCs en mIPSCs respectievelijk blokkeert.
3. Analyse van de gepaarde-pulse
   Opmerking: presynaptische plasticiteit kan worden geanalyseerd met behulp van de gepaarde-pulse analyse. Een toename in de snelheid gekoppeld-pulse suggereert een daling in de presynaptische glutamaat of GABA vrijgeven waarschijnlijkheid ^{7 , 10 , 11}.
   1. Excitatory synapsen analyseren, het toevoegen van 0.1 mM picrotoxin en het opnemen van de reactie op -60 mV. Hoewel we 4 µM 2-chloroadenosine toegevoegd aan het bad, we moeten Houd er rekening mee dat de drug van invloed is op de presynaptische introductie kans ¹⁴.
   2. Voor het analyseren van de inhiberende synapsen, 0.1 mM APV en 4 µM 2-chloroadenosine toevoegen aan het bad en de reactie op 0 opnemen mV. Opnemen in M1 neuronen, de reactie op + 15 mV.
   3. Gepaarde pulsen met een onderlinge stimulans interval van 100 ms of 200 ms. van toepassing
   4. 50-100 sequentiële sporen bij elk bedrijf potentiële opnemen en de gemiddelden.
   5. Berekenen de gepaarde pulse-ratio als de verhouding van de tweede piek aan het eerste hoogtepunt van de huidige postsynaptisch.

Results

Zoals we onlangs⁷, geïnduceerde rotor staaf opleiding (figuur 1A) dynamische veranderingen in de intrinsieke plasticiteit van de M1 laag II/III piramidale neuronen. Meten van de latentie totdat de rats van de roterende staaf vallen stelt ons in staat om te schatten van de prestaties van de geschoolde leren van de rat. Langere latentie geeft betere prestaties van de motor. Op de dag 1 van opleiding verbeterde de rats hun rotor staaf prestaties tot het einde van het proces. Op dag 2, de ratten bereikt bijna asymptotische niveaus in het gemiddelde sessie scoort (figuur 1B). In vergelijking met de vertraging bij de eerste proef, post-hoc analyse toonde significante verbeteringen op de definitieve proeven op de trainingsdagen (Figuur 1 c).

Figuur 4A ziet u een voorbeeld van current-clamp analyse waarin de neuronale eigenschappen gewijzigd na het motorische vaardigheid leren. Injecties van 400 pA en 500 pA stromingen waren nodig voor het opwekken van de actie potentieel in de ongetrainde groep en bij de 1-daagse opgeleide ratten, respectievelijk. Daarentegen was injectie van slechts een 150 pA huidige voldoende om de actie potentieel in de 2-daagse opgeleide rats uitlokken. De relatie tussen de stroomsterkte en de aantal actie potentieel is afgebeeld in figuur 4B. Zo weinig als 50 pA huidige volstond om te ontlokken van pieken in de 2-daagse opgeleide ratten; daarentegen 1-daagse opgeleide ratten met minder actie potentieel dan ongetrainde ratten gereageerd op 350 pA en hogere stromingen. Bovendien cijfer 4C toont aan dat 1 dag opgeleide ratten toonde lager rust potentiële, hoger spike drempel en diepere nahyperpolarsatietijd, overwegende dat de 2-daagse opgeleide ratten toonde hogere rustpotentiaal (figuur 4C) en (weerstand) membraan Figuur 4 d).

Zoals eerder we^{11 beschreven}, geïnduceerde IA opleiding (Figuur 1 d) postsynaptisch plasticiteit op excitatory en inhiberende synapsen van de neuronen CA1 hippocampal. Door het meten van de latentie in de lichtbak, schatten we kunnen de prestaties van de contextuele leren van de rat. Figuur 1E toont de resultaten van de IA-taak. Na de gepaarde elektrische schok leren de ratten te voorkomen van de donkere kant van het vak en verblijf in de brandende zijde, die meestal ze liever niet. De neiging om te voorkomen dat de donkere kant geeft dus aan de verwerving van contextuele herinneringen.

Figuur 5 ziet u een voorbeeld van spanning-clamp analyse in welke miniatuur postsynaptisch stromingen werden drastisch veranderd na het contextueel leren. Om te onderzoeken leren-geïnduceerde plasticiteit, spontane AMPA-gemedieerde mEPSCs en GABA_A-gemedieerde mIPSCs sequentieel werden opgenomen in het bijzijn van 0,5 µM tetrodotoxine (figuur 5A en B). Zoals u op tweedimensionale percelen (figuur 5C), hadden elk neuron CA1 verschillende gemiddelde amplitudes voor mEPSCs en mIPSCs. Hoewel de amplitudes laag waren en toonde een smalle verspreidingsgebied in ongetrainde, ongepaarde, en walk-through ratten, die waren divers in IA-opgeleid ratten (tabel 5). ANOVA gevolgd door post-hoc analyse toonde een aanzienlijke stijging van de gemiddelde amplitudes van mEPSC en mIPSC in IA-opgeleid ratten (figuur 5E), suggereren leren-geïnduceerde postsynaptisch plasticiteit in de CA1 neuronen.

Bovendien, elke CA1 neuron tentoongesteld verschillende mEPSC en mIPSC frequenties (figuur 5D). Hoewel de frequenties laag waren en toonde een smalle verspreidingsgebied in ongetrainde, ongepaarde, en walk-through ratten, die waren divers in IA-opgeleid ratten (tabel 6). ANOVA gevolgd door post-hoc analyse toonde een aanzienlijke stijging in de frequenties van de gebeurtenissen van het mEPSC en mIPSC bij IA-opgeleid ratten (figuur 5F). Er zijn twee mogelijke interpretaties van deze resultaten. De eerste is dat contextuele leren verhoogd het aantal functionele synapsen van de neuronen. De andere is dat contextuele leren verhoogd de kans op presynaptische introductie van glutamaat en GABA.

Om verder te onderzoeken presynaptische plasticiteit, we leidee gekoppeld-pulse stimulaties, zoals gemeld eerder^10,11.

Figuur 1 : Leren van prestaties na de training.
A: de proefopzet toont de rotor staaf opleiding en coronale hersenen segment. B: de gemiddelde latentie te vallen uit de versnellende rotor staaf vat. C: de gemiddelde latentie te vallen op de staaf op de eerste en de laatste proeven op training dagen 1 en 2-⁷. P< 0,01 vs. eerste proef. D: Schema van de remmende vermijden (IA) taak en coronale hersenen segment. E: de gemiddelde latentie in te voeren van het donkere vak vóór en na de IA opleiding¹¹. P< 0,01 vs. voor IA opleiding. De nummers op de coronale secties geven de afstand anterior to de bregma in mm. Het aantal dieren wordt weergegeven aan de onderkant van de bars. Foutbalken geven SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Snijd procedures.
A: foto's tonen de voorbereiding van acute hersenen segmenten. De hulpmiddelen van de dissectie waren afgekoeld in crushed ijs vóór gebruik. B: Brain dissectie en trimmen. Merk op dat de hoek van trimmen op de posterieure zijde parallel met de dendritische richting moet worden georiënteerd. C: snijden van de hersenen in een vibratome kamer. De hersenen is badend in dissectie buffer en voortdurend te borrelen met een gasmengsel van 5% CO₂/95% O₂ . D: een kamer interface gemaakt van twee kunststof voedselcontainers en een Siliconen slang. De zaal was gevuld met kunstmatige CSF en borrelen voortdurend met het gasmengsel. E: hersenen segmenten werden geplaatst op vochtig filterpapier in de zaal.Bar = 5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Patch klem procedures.
A: het patch-clamp-systeem gebruikt voor de registratie van de elektrische signalen van een neuron. De locatie van het stimuleren en elektroden opname in de laag II/III neuronen staan in de motorschors rat. B: om te analyseren de Schaffer synapsen van een piramidale neuron CA1, werd een stimulerende elektrode geplaatst op de stratum radiatum. Om te analyseren temporoammonic synapsen, werd een stimulerende elektrode geplaatst op de stratum moleculare. Vertegenwoordiger sporen van evoked AMPA en NMDA receptor-gemedieerde excitatory postsynaptisch stromingen in de dezelfde CA1 neuron worden weergegeven. C: een segment anker werd gebruikt voor het stabiliseren van het segment in de zaal van de opname. D: een kaart van de vertegenwoordiging in de motorschors, gebaseerd op de gepubliceerde documenten^15,16,17. ML = middellijn. E: IR-DIC microfoto van M1 laag II/III neuronen voordat (bovenste) en tijdens de opname (lagere). Bar = 10 µm. F: veranderingen in de pipet huidige voor aanraking (top) en bij breuk (onderkant) van de membraan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Representatieve resultaten van current-clamp analyse⁷ .
A: vertegenwoordiger sporen van de actie potentieel afgelezen na inductie met huidige injecties. B: relaties tussen de gemiddelde huidige ingang (pA) vs. actiepotentiaal output (aantal spikes) in hersenen plakjes ongetrainde (open balken), 1-daagse opleiding (grijze balken) en 2-daagse opgeleide ratten (gevulde balken). C: rust potentieel, drempel, en nahyperpolarsatietijd van de laag II/III neuronen. D: membraan weerstand en de weerstand van de reeks van de neuronen. 9-10 ratten gebruikten we in elke groep. Het aantal cellen wordt binnen elke balk weergegeven. Foutbalken geven de SEM. *P< 0,05, **P< 0,01 vs. ongetrainde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Representatieve resultaten van de spanning-clamp analyse¹¹ .
Representatieve sporen van miniatuur excitatory en remmende postsynaptisch stromingen (mEPSCs en mIPSCs) in ongetrainde (A) en remmende vermijden (IA)-opgeleid ratten (B). mEPSCs-60 mV en mIPSCs op 0 mV sequentieel werden gemeten in de dezelfde CA1 piramidale neuron in aanwezigheid van tetrodotoxine (0,5 µM). Verticale balk = 20 pA, rekstok = 200 msec. C: tweedimensionale percelen van het gemiddelde mE (I) PSC amplitudes in ongetrainde, IA-opgeleid, ongepaarde, en walk-through ratten. D: tweedimensionale percelen van de mE (I) PSC frequenties in de 4 groepen. Opmerking dat elk neuron CA1 tentoongesteld verschillende betekenen mE (I) PSC amplitudes en frequenties. IA opleiding versterkt niet alleen de gemiddelde amplitudes (E) maar ook verhoogde de frequenties van de mE (I) PSC evenementen (F). We gebruikten 4-6 ratten in elke groep. Het aantal cellen wordt weergegeven aan de onderkant van de bars. Rode plustekens (C, D) en bars met verticale lijnen (E, F) geven de gemiddelde ± SEM. **P< 0,01 vs. ongetrainde ratten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Dissectie buffer (totaal 1L)
NaH2PO4 • 2 H2O	0,195 g	1,25 mmol/L
KCl	0.188 g	2,5 mmol/L
CaCl2	0.074 g	0.5 mmol/L
MgCl2 • 6 H2O	1.423 g	7,0 mmol/L
Cholinechloride	12.579 g	90 mmol/L
Ascorbinezuur	2.340 g	11.6 mmol/L
Pyrodruivenzuur	0.342 g	3.1 mmol/L
NaHCO3	2.100 g	25 mmol/L
Glucose	4.500 g	25 mmol/L

Tabel 1: Een recept voor dissectie buffer

Kunstmatige CB (totaal 1L)
KCl	0.186 g	2,5 mmol/L
NaCl	6.700 g	114.6 mmol/L
NaH2PO4 •2H2O	0.156 g	1 mmol/L
Glucose	1.800 g	10 mmol/L
NaHCO3	2.184 g	26 mmol/L
1M MgCl2	4 mL	4 mmol/L
1M CaCl2	4 mL	4 mmol/L

Tabel 2: Een recept voor kunstmatige cerebrospinale vloeistof (CSF)

Intracellulaire oplossing voor huidige klem (totale 200 mL)
KCl	0.0746 g	5 mmol/L
K-gluconaat	6.089 g	130 mmol/L
HEPES	0.476 g	10 mmol/L
EGTA	0.0456 g	0,6 mmol/L
1M MgCl2	500 ΜL	2,5 mmol/L
NB2 ATP	0.4408 g	4 mmol/L
Na3 GTP	0.0418 g	0.4 mmol/L
NB phosphocreatine	0.510 g	10 mmol/L

Tabel 3: Een recept voor een intracellulair oplossing voor huidige klem opnemen

Intracellulaire oplossing voor spanning klem (totale 200 mL)
CsMeSO3	5

.244 g (5.814) ^* 115 mmol/L (127,5) ^* CsCl 0.672 g (0.252) ^* 20 mmol/L (7.5) ^* HEPES 0.476 g 10 mmol/L EGTA 0.0456 g 0,6 mmol/L 1M MgCl₂ 500 ΜL 2,5 mmol/L NB₂ ATP 0.4408 g 4 mmol/L Na₃ GTP 0.0418 g 0.4 mmol/L NB phosphocreatine 0.510 g 10 mmol/L * lage Cl^- -concentratie voor miniatuur opnamen

Tabel 4: Een recept voor een intracellulair oplossing voor spanning klem opnemen

Parameters		ongetraind	IA opgeleid	ongepaarde	Maak een wandeling door
mEPSC amplitude	Variantie	5.8	32.1	4.7	5.9
	Standaarddeviatie	2.4	5.7	2.2	2.4
	Variatiecoëfficiënt	0.189	0.326	0,177	0.190
mIPSC amplitude	Variantie	17.1	56,7	31,8	20,7
	Standaarddeviatie	4.1	7.5	5.6	4.5
	Variatiecoëfficiënt	0.279	0.387	0.367	0.286

Tabel 5: De diversiteit van miniatuur excitatory en remmende postsynaptisch huidige (mEPSC en mIPSC) amplitudes bij remmende vermijden (IA)-opgeleid ratten

Parameters		ongetraind	IA opgeleid	ongepaarde	Maak een wandeling door
mEPSC frequentie	Variantie	278	2195	188	195
	Standaarddeviatie	17	47	14	14
	Variatiecoëfficiënt	0.902	1.198	0.893	0.874
mIPSC frequentie	Variantie	3282	27212	1385	5135
	Standaarddeviatie	57	165	37	72
	Variatiecoëfficiënt	1.195	1.006	0.955	0.836

Tabel 6: De diversiteit van miniatuur excitatory en remmende postsynaptisch huidige (mEPSC en mIPSC) frequenties bij remmende vermijden (IA)-opgeleid ratten

Discussion

De belangrijkste beperking van de segment patch-clamp techniek is de opname in segment preparaat, die mogelijk niet overeen met wat er gebeurt in vivo. Hoewel in vivo de analyse van de huidige-clamp meer betrouwbaar is, is het technisch uitdagend om voldoende gegevens van bewuste dieren. Aangezien elke piramidale neuron verschillende cellulaire eigenschappen heeft, is een voldoende aantal cellen nodig om goed analyseren verschillen in neuronen na de training. Bovendien vereist de analyse van de spanning-clamp continu medicamenteuze behandeling met CNQX, APV of bicuculline om te bepalen van de aard van het postsynaptisch reacties. Voor het analyseren van de antwoorden van de miniatuur geïnduceerd door een enkele blaasje of GABA en glutamaat, is continue behandeling met tetrodotoxine nodig om het blokkeren van spontane actie potentieel. Hoewel de onlangs ontwikkelde multi photon imaging techniek krachtig is voor het analyseren van de morfologische veranderingen op excitatory synapsen¹⁹, is een gecombineerde patch-clamp techniek nodig om het analyseren van de functie van synapsen in vivo. Het is op dit moment heel moeilijk om te analyseren van morfologische veranderingen op inhiberende synapsen, aangezien meest inhiberende synapsen geen stekels vormen. Op dit moment zou het segment patch klem de meest geschikte techniek voor het analyseren van de Celeigenschappen of de functies van excitatory/inhiberende synapsen in getrainde dieren.

Met behulp van current-clamp analyse (Figuur 4), hebben we onlangs gemeld motor leren-geïnduceerde intrinsieke plasticiteit in laag II/III neuronen. In het bijzonder de 1-daagse opgeleide ratten toonden een significante afname van de membraanpotentiaal en een verhoging van de drempel van de spike rusten. De 2-daagse opgeleide ratten toonde een aanzienlijke stijging in de rust van de membraanpotentiaal die hebben geleid tot verhoogde prikkelbaarheid. Deze resultaten voorgesteld die er werden dynamische wijzigingen in de intrinsieke plasticiteit van M1 laag II/III neuronen bij getrainde ratten. Extra spanning-clamp analyse toonde een toename van de ratio van de gepaarde-pulse in 1 dag getraind ratten, wat suggereert dat er een voorbijgaande daling in de presynaptische GABA release kans^{7 was}. Het is dus mogelijk dat disinhibitie van GABA in de laag II/III af zou kunnen leiden tot de resulterende leren-geïnduceerde plasticiteit in het M1. Ter ondersteuning van dit vereist segment voorbereiding van de M1 bad behandeling met een GABA_A receptor blocker voor het opwekken van LTP²⁰.

Analyse van miniatuur postsynaptisch potentieel is een krachtige manier om het detecteren van synaptische plasticiteit in IA getrainde dieren. Sequentiële optekening van mEPSCs en mIPSCs in één CA1 neuron kan de analyse van de synaptische excitatory/remmende kracht van elke afzonderlijke neuron. Sinds een honkslag mE (I) PSC reactie wordt toegeschreven aan een enkele blaasje van glutamaat of GABA, een toename in de mE (I) PSC amplitude suggereert postsynaptisch versterking. Met behulp van mE (I) PSC analyse, vonden we individuele verschillen in de kracht van excitatory/remmende inbreng elke CA1 neuron (figuur 5C). IA opleiding duidelijk bevorderd diversiteit in synaptic kracht, maar dit werd niet waargenomen in andere groepen (tabel 5).

Synaptic diversiteit leren-geïnduceerde kan wiskundig worden geanalyseerd. Door het berekenen van de kans van de verschijning van elk punt, kan gegevens uit elke neuron worden geconverteerd naar zelf-entropy (bit) met behulp van de informatietheorie van Claude E. Shannon²¹. Een punt met hoge uiterlijk waarschijnlijkheid (rond het gemiddelde niveau) geeft lage zelf-entropy, terwijl een punt met een zeer zeldzame kans (een afwijkende punt) hoge self-entropy aangeeft. Vergeleken met ongetrainde ratten, de zelf-entropy per neuron was duidelijk verhoogd bij ratten IA-opgeleid, maar niet in ongepaarde of walk-through ratten²². Deze analyse doet vermoeden dat er een toename van de intra-CA1 informatie na de contextuele leren.

Het segment patch-clamp techniek kan ook worden gebruikt voor gecued angst conditionering studies van het laterale amygdala⁹ en voor zintuiglijke ervaring studies in het vat cortex⁸. Bovendien, deze techniek kan worden gebruikt met verschillende andere technieken voor verder onderzoek. Bijvoorbeeld, het virus-gemedieerde groen fluorescente proteïne (GFP)-tagged gene levering techniek kan gecombineerd worden met de patch klem techniek voor het analyseren van de functie van de specifieke moleculen. Daarnaast kan de focal microinjection van een retrograde tracer te visualiseren specifieke neuronen dat project naar een specifiek gebied worden gebruikt. Vervolgens kunnen met behulp van de current-clamp techniek, cel-specifieke eigenschappen worden geanalyseerd in de gevisualiseerde neuronen²³. Verder, combineren twee-foton laser scanning microscopie met twee-foton laser uncaging van glutamaat is gebruikt om aan te tonen van de wervelkolom-specifieke groei en de reactie van de EPSC in muis corticale laag II/III piramidale neuronen¹⁹. Dus, het segment patch-clamp techniek wordt verbeterd door het te combineren met nieuwe chemische stoffen, gene levering en foto manipulatie technieken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod Treadmills	Med Associates Inc.	ENV577
inhibitory avoidance box	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Cardiac perfusion syringe	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Vibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Horizontal puller	Sutter Instrument	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0.22 µm filter	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier	Axon Instruments
Digidata 1440 AD board	Axon Instruments
pCLAMP 10 software	Axon Instruments
Upright Microscope	Olympus	BX51WI
CCD camera	Olympus	U-CMAD3
Camera controller	Hamamatsu Photonics K.K.	C2741
Stimulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Isolator	Nihon Kohden	SS-104J
Motorized manipulator	Sutter Instrument	MP-285
Micromanipulator	Narishige	NMN-21
Peristaltic Pump	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Glass capillary	Narishige	GD-1.5
Ag/AgCl electrode	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Stimulus electrode	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Dissection buffer/ artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Choline chloride	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Ascorbic acid	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Pyruvic acid Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glucose	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na phosphocreatine	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Picrotoxin	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoxin	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	A5282