De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zoektocht naar nieuwe histone deacetylase (HDAC) remmers wordt steeds belangstelling voor drugontdekking. Isovorm selectiviteit is in de spotlight sinds de goedkeuring van romidepsin, een klasse ik HDAC remmer voor kankertherapie, en het klinisch onderzoek van HDAC6-specifieke remmers voor multiple myeloma. De huidige methode wordt gebruikt om te bepalen van de inhiberende activiteit van de verbindingen van de test op HDAC1 en HDAC6 in cellen. De isovorm activiteit wordt gemeten met behulp van de ultra-high-performance vloeibare chromatografie-Spectrometrie van de massa (UHPLC-MS) analyse van specifieke substraten geïncubeerd met behandeld en onbehandeld HeLa cellen. De methode heeft het voordeel van de endogene activiteit van het HDAC binnen de cel-omgeving, in tegenstelling tot cel-vrije biochemische tests uitgevoerd op geïsoleerde isoforms weerspiegelt. Bovendien, omdat het is gebaseerd op het kwantificeren van synthetische substraten, de methode hoeft niet de erkenning van het antilichaam van endogene geacetyleerd eiwitten. Het is gemakkelijk aan te passen aan verschillende cellijnen en een geautomatiseerd proces. De methode is al nuttig zijn bij het vinden van HDAC6-selectieve verbindingen in neuroblasten gebleken. Representatieve resultaten worden hier weergegeven met het standaard HDAC remmers trichostatin een (niet-specifieke), MS275 (HDAC1-specifiek), en tubastatin een (HDAC6-specifiek) met behulp van HeLa cellen.
Inleiding
HDACs behoren tot een familie van enzymen kunnen deacetylate van histones binnen de structuur van de chromatine. Ook zij hebben andere substraten eiwit in het cytosol en bevinden zich in verschillende compartimenten van de cel. Een totaal van 18 HDAC isoforms tot nu toe hebben geïdentificeerd en verband met verschillende cel mechanismen, met inbegrip van de verordening van transcriptiefactoren genexpressie, alsmede cel signalering en vervoer van1,2,3,4,5,6,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. de celkweek
Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd in een standaard weefselkweek kap. Vertrouwdheid met steriele techniek wordt verwacht.
- Cultuur van HeLa cellen naar 80% confluentie in een maatkolf van T75 cel cultuur in MEM aangevuld met 10% foetale runderserum, penicilline G (100 U/mL), en streptomycine (100 mg/mL).
Opmerking: Cultuur, behandeling en stappen van lysis van de cel worden uitgevoerd onder laminaire flow, met stappen van cel incubatie bij 37 ° C uitgevoerd in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 onder steriele omstandigheden. - Wassen van de cellen tweemaal met 5 mL van de DPBS, de ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om aan te tonen van de toepassing van de methode voor het identificeren van niet-selectieve en selectieve remmers voor HDAC1 (klasse I) en HDAC6 (klasse IIb), HeLa cellen werden behandeld met bekende standaard verbindingen: trichostatin A (niet-selectieve tussen HDAC1 en HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selectieve remmer)19en tubastatin een (HDAC6-selectieve remmer)20. Met de huidige methode (Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
HDAC inhibition is een hot topic in de Geneesmiddelenontwikkeling, met een huidige focus op HDAC6-selectieve remmers voor kanker therapie21. HDAC selectiviteit wordt meestal beoordeeld door een reeks van high-throughput, cel-gratis tests, die voornemens zijn te bepalen van de remmende potentie naar individuele HDAC isoforms21. Echter de selectiviteit van een remmer moet bovendien bevestigd worden in levende cellen door de beoordeling van de status van de acetylation van end.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen kosten actie CM1406 (epigenetische chemische biologie). Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de Stichting Pierre Mercier.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synoniem: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC-kwaliteit | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formaldehyde, LC/MS-kwaliteit | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC-kwaliteit | gedistilleerd H2O gefilterd door een Milli-Q-zuiveringssysteem | ||
| HeLa-cellen | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell-dissociatiereagens TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cellcultuurkwaliteit | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetaal runderserum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicilline-Streptomycine | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA-buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast proteaseremmertabletten | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-wells platen, steriele, platte bodem, behandeld voor weefselkweek Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-wells platen, niet-steriele, V-bodem Corning | VWR | 29442-404 | gebruikt in de centrifugatiestap |
| 96-wells plaat, conische bodem, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatibel met het Acquity UHPLC-systeem |
| T75 cellcultuurflacons Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Afplakbare hittesluitfolie | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC-systeem | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integratiesoftware: MassLynx V4.1 | Waters | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalogusnummer niet beschikbaar |
Referenties
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
