Methodenartikel

Gelijktijdige meting van HDAC1 en HDAC6 activiteit in HeLa cellen met behulp van UHPLC-MS

DOI:

10.3791/55878

⸱

10 augustus 2017

 ,  ,  , 
1Section des Sciences Pharmaceutiques, Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zoektocht naar nieuwe histone deacetylase (HDAC) remmers wordt steeds belangstelling voor drugontdekking. Isovorm selectiviteit is in de spotlight sinds de goedkeuring van romidepsin, een klasse ik HDAC remmer voor kankertherapie, en het klinisch onderzoek van HDAC6-specifieke remmers voor multiple myeloma. De huidige methode wordt gebruikt om te bepalen van de inhiberende activiteit van de verbindingen van de test op HDAC1 en HDAC6 in cellen. De isovorm activiteit wordt gemeten met behulp van de ultra-high-performance vloeibare chromatografie-Spectrometrie van de massa (UHPLC-MS) analyse van specifieke substraten geïncubeerd met behandeld en onbehandeld HeLa cellen. De methode heeft het voordeel van de endogene activiteit van het HDAC binnen de cel-omgeving, in tegenstelling tot cel-vrije biochemische tests uitgevoerd op geïsoleerde isoforms weerspiegelt. Bovendien, omdat het is gebaseerd op het kwantificeren van synthetische substraten, de methode hoeft niet de erkenning van het antilichaam van endogene geacetyleerd eiwitten. Het is gemakkelijk aan te passen aan verschillende cellijnen en een geautomatiseerd proces. De methode is al nuttig zijn bij het vinden van HDAC6-selectieve verbindingen in neuroblasten gebleken. Representatieve resultaten worden hier weergegeven met het standaard HDAC remmers trichostatin een (niet-specifieke), MS275 (HDAC1-specifiek), en tubastatin een (HDAC6-specifiek) met behulp van HeLa cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDACs behoren tot een familie van enzymen kunnen deacetylate van histones binnen de structuur van de chromatine. Ook zij hebben andere substraten eiwit in het cytosol en bevinden zich in verschillende compartimenten van de cel. Een totaal van 18 HDAC isoforms tot nu toe hebben geïdentificeerd en verband met verschillende cel mechanismen, met inbegrip van de verordening van transcriptiefactoren genexpressie, alsmede cel signalering en vervoer van1,2,3,4,5,6,7. HDAC katalytische remmers opgedoken als potentiële therapeutische geneesmiddelen voor kankertherapie. Meeste HDAC remmers momenteel goedgekeurd door de FDA zijn voor de behandeling van T-cel lymfoom en multiple myeloma en zijn niet-specifieke HDAC remmers, zoals vorinostat (SAHA), belinostat en panobinostat8,9. Echter een aantal bijwerkingen zijn geassocieerd met pan-remmers, en het zoeken naar isovorm-specifieke kleine moleculen is een hot topic in medicinale chemie en drug discovery. Dienovereenkomstig, de klasse ik (HDAC1-3 en HDAC8) selectieve remmer romidepsin is een reeds goedgekeurde drug10, terwijl HDAC6-specifieke remmers momenteel onder klinische proeven, met verhoogde therapeutisch potentieel in multiple myeloma11,12,13,14,15 zijn.

Screening tests karakteriseren HDAC zijn remmers gebaseerd op de incubatie van een HDAC substraat met een enzymatische bron (één isovorm, nucleaire extract of cel lysate). Het substraat is meestal een kleine peptide-reeks met een acetyl lysine residu gekoppeld aan een cleavable fluorophore (bijvoorbeeld coumarine), zoals N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Om deze te onderscheiden isovorm-specifieke activiteiten, afzonderlijke cel-gratis testen waarbij elke isovorm zijn noodzakelijk en mogelijk niet overeen met de echte isovorm activiteit in levende cellen. Isovorm-specifieke substraten zijn commercieel verkrijgbaar, zoals benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 specifieke substraat) en (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic zuur tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 specifieke substraat) (figuur 1B). Echter toestaat een meer-substraat-mengsel dat MAL bevat, MOCPAC en BATCP gegeven aan levende cellen niet de detectie van de afzonderlijke deacetylated producten door fluorimetrische meting, gezien het feit dat zij de zelfde cleavable fluorophore dragen.

De hier beschreven methode zorgt voor de detectie en kwantificering van de relatieve van elk substraat en haar deacetylated product in HeLa cellen met behulp van een meer-substraat assay gevolgd door UHPLC-ESI-MS/MS analyse17. Een HDAC-test is uitgevoerd op HeLa cellen om de directe identificatie van HDAC inhiberende activiteit en van de specificiteit van de test verbindingen op endogene HDACs. Er is een focus op HDAC1 en HDAC6, die gelijktijdig worden geëvalueerd. Om te bereiken deze enzymatische metingen in een enkele incubatie assay, wordt een mengsel van niet-specifieke en specifieke HDAC substraten toegevoegd aan behandeld en onbehandeld HeLa cellen verguld op een 96-wells-plaat. Na een incubatie stap, zijn cellen lysed de substraten en hun respectieve reactieproducten, die worden gescheiden en ontdekt een UHPLC-MS methode (Figuur 1 c) vrij te laten. De deacetylated producten van de MAL, MOCPAC en BATCP substraten zijn de deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) en deacetylated BATCP (dBATCP), respectievelijk. Dosis / respons-curven kunnen worden gebouwd met actieve verbindingen.

figure-introduction-1
Figuur 1: algemene regeling voor de cel-gebaseerde HDAC assay te identificeren van HDAC1 - en HDAC6-specifieke remmers door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. (A) schema van een typische 96-wells-plaat met behandeld (test verbindingen) onbehandeld (control) HeLa cellen, alsmede cel-vrij leeg. (B) chemische structuur van substraten toegevoegd als een mengsel (elke 21 µM) door endogene HDACs worden deacetylated. (C) UHPLC-MS (normaal) chromatografische tonen de pieken van de toegevoegde substraten (MAL, MOCPAC en BATCP) en hun deacetylated producten (dMAL, dMOCPAC, en dBACTP, respectievelijk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de celkweek

Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd in een standaard weefselkweek kap. Vertrouwdheid met steriele techniek wordt verwacht.

  1. Cultuur van HeLa cellen naar 80% confluentie in een maatkolf van T75 cel cultuur in MEM aangevuld met 10% foetale runderserum, penicilline G (100 U/mL), en streptomycine (100 mg/mL).
    Opmerking: Cultuur, behandeling en stappen van lysis van de cel worden uitgevoerd onder laminaire flow, met stappen van cel incubatie bij 37 ° C uitgevoerd in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 onder steriele omstandigheden.
  2. Wassen van de cellen tweemaal met 5 mL van de DPBS, de DPBS gecombineerd en voeg 1 mL cel dissociatie reagens. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen los te maken.
  3. Voeg 9 mL MEM kweekmedium grondig resuspendeer de celsuspensie en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
  4. Aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie tot 6 x 104 cellen/mL in MEM.
  5. Voeg 100 µL celsuspensie aan controle en test van de putten van een steriele flat-bodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat (figuur 1A).
  6. Breng 100 µL cultuurmedium MEM in lege putjes van de 96-wells-plaat (figuur 1A).
  7. Incubeer de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur.
    Opmerking: Een 24u incubatie is een geschikte tijd om te testen voor de endogene activiteit van HDAC in HeLa cellen. Verschillende soorten cellen met onbekende HDAC activiteit wellicht een evaluatie van de timecourse van cellen.

2. cel behandeling met Test verbindingen en HDAC substraten

  1. Het medium van de putjes van de 96-wells-plaat gecombineerd.
  2. Voeg 25 µL van 2 x test verbindingen (bijvoorbeeld, trichostatin A, MS275, en tubastatin A) in MEM voor het testen van putten. Voeg toe 25 µL van MEM aan controle en lege wells.
    Opmerking: De concentratie aan test verbindingen is worden aangepast om te zorgen voor een scala van ten minste 5 laatste testconcentraties (één concentratie per putje). De uiteindelijke concentratie van DMSO in de teststof mag niet hoger zijn dan 0,5% en moet hetzelfde zijn in elk putje, met inbegrip van spaties en besturingselementen. De definitieve incubatie volumewaarde bedraagt 50 µL per putje. Trichostatin A is getest bij 5 concentraties variërend van 500 tot 1.95 nM (in de verdunning 1:4). MS275 en tubastatin A worden getest bij 5 concentraties variërend van 8.000 tot 6.17 nM (in de verdunning 1:6). De gewenste uiteindelijke testconcentratie voor elke teststof moet worden bepaald door elke individuele gebruiker door het creëren van een dosis-responscurve.
  3. Voeg toe 25 µL van het mengsel van substraat (42 µM van MAL, 42 µM van MOCPAC en 42 µM van BATCP in MEM) aan controle en test putjes. Voeg toe 25 µL van MEM aan lege putjes.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elk substraat is 21 µM. MOCPAC en BATCP onderscheid maken tussen HDAC1 en HDAC6 activiteit, respectievelijk (figuur 1B). Wanneer geen activiteit wordt waargenomen met deze substraten, kan het gebruik van de MAL leiden tot de identificatie van activiteit tegen een ander HDAC isovorm.
  4. Incubeer de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 8 uur in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
    Opmerking: Deze incubatietijd is geschikt voor HeLa cellen en laat de endogene HDAC om te interageren met de synthetische substraten. Verschillende cellijnen kunnen aanpassingen in incubatie tijd en/of substraat concentratie vereisen.

3. cel Lysis en bereiding van de monsters voor UHPLC-ESI-MS/MS

Let op: Gebruik de sample voorbereiding stappen organische chemische stoffen, die zeer brandbaar en giftig bij inslikken of inhalatie zijn. Draag passende persoonlijke bescherming, zoals handschoenen en veiligheidsbril.

  1. Voeg 10 µL van 6 x RIPA buffer (verdund uit 10 x RIPA buffer) aangevuld met proteaseinhibitor aan elk putje van de 96-wells-plaat.
  2. Zet de reactie stop door 160 µL van koude acetonitril toe te voegen aan elk putje en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
    Opmerking: Houd de acetonitril bij-20 ° C vóór deze stap.
  3. Plaats de plaat in een vriezer-80 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Verwijderen de plaat uit de vriezer en 220 µL van de inhoud van elk putje overbrengen in een niet-steriele, conische bodem (V-bodem) 96-wells-plaat. Centrifugeer de plaat duikt met 5.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Deze stap is gericht op het wegnemen van eiwitten en zouten. Indien nodig, kunnen de oplossingen worden overgebracht naar afzonderlijke conische centrifuge buizen vóór centrifugeren of gefilterd door middel van een set van 96-Wells, 0.65 µm PVDF filter platen. Het succesvol verwijderen van de neerslag is vereist vóór de UHPLC analyse.
  5. Breng 200 µL van supernatant (of filtraat) in een compatibel met de UHPLC-systeem 96-wells-plaat en verzegel het met gelamineerde, heat-sealing folie, met behulp van een plaat sealer.
    Opmerking: Vermijd de pellets pipetteren bij het verwijderen van het supernatant. Als de UHPLC-analyse kan niet onmiddellijk worden uitgevoerd, kan de plaat bij 4 ° C voor een maximum van 24 uur tot analyse worden opgeslagen.

4. UHPLC/MS-MS-analyse

  1. Bereid de UHPLC-systeem door het te vullen met het systeem van de mobiele fase (95% A:5% B):
    A: H2O, HPLC-kwaliteit, met 0,1% mierenzuur (bereiden 1 L)
    B: acetonitril, HPLC-kwaliteit, met 0,1% mierenzuur (bereiden 1 L).
    Let op: De mobiele fase bevat organische chemische stoffen, die zeer brandbaar en giftig bij inslikken of inhalatie zijn. Draag passende persoonlijke bescherming, zoals handschoenen en veiligheidsbril.
  2. De 96-wells-plaat in de manager van de steekproef met een plaat houder plaatsen. Voer de monsters volgens de voorwaarden van de UHPLC-ESI-MS/MS in tabel 1gegeven.
    Opmerking: Voor elke kolom van de analytische 96-wells-plaat moet één besturingselement goed en één lege goed (zoals afgebeeld in het schema van de plaat van de figuur 1A). Besturingselementen zijn representatief voor 100% enzymatische activiteit in de geteste cellijn, terwijl blanks er zijn om te controleren of de bron van MS is het verstrekken van consistente achtergrond. Ongewone MS pieken gedetecteerd in een bepaalde leeg moeten worden onderzocht om MS gevoeligheid wijzigingen te voorkomen.

5. de gegevensanalyse

  1. Integreer de piekoppervlakte van elk substraat en haar deacetylated product met een juiste UHPLC integratie software.
    Opmerking: Automatische integratie parameters gebruiken met een vloeiend methode (gemiddelde venstergrootte 3 en aantal glad 2, bijvoorbeeld). Met behulp van de in tabel 1vastgestelde chromatografische voorwaarden, is de volgorde van de elutie dMAL (5.8 min), dBATCP (6.0 min), dMOCPAC (6.2 min), MAL (7.6 min), MOCPAC (8.9 min) en BATCP (9,8 min), zoals afgebeeld in Figuur 1 c.
  2. Voor elke ondergrond, berekenen de piek gebied ratio (deacetylated/geacetyleerd) in elke chromatografische (test- en monsters).
  3. Bereken het percentage HDAC remming van elk monster:
    figure-protocol-1
    Opmerking: Inhibitie van de HDAC1 wordt berekend met behulp van de piek gebied verhouding van dMOCPAC/MOCPAC; Inhibitie van de HDAC6 wordt berekend met dBATCP/BATCP. De verhouding dMAL/MAL kan worden gebruikt om algemene HDAC inhibition express.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om aan te tonen van de toepassing van de methode voor het identificeren van niet-selectieve en selectieve remmers voor HDAC1 (klasse I) en HDAC6 (klasse IIb), HeLa cellen werden behandeld met bekende standaard verbindingen: trichostatin A (niet-selectieve tussen HDAC1 en HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selectieve remmer)19en tubastatin een (HDAC6-selectieve remmer)20. Met de huidige methode (Figuur 1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDAC inhibition is een hot topic in de Geneesmiddelenontwikkeling, met een huidige focus op HDAC6-selectieve remmers voor kanker therapie21. HDAC selectiviteit wordt meestal beoordeeld door een reeks van high-throughput, cel-gratis tests, die voornemens zijn te bepalen van de remmende potentie naar individuele HDAC isoforms21. Echter de selectiviteit van een remmer moet bovendien bevestigd worden in levende cellen door de beoordeling van de status van de acetylation van end...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen kosten actie CM1406 (epigenetische chemische biologie). Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de Stichting Pierre Mercier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BATCPSigma-AldrichB4061
MALSigma-AldrichSCP0168Synoniem: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPACSigma-AldrichM2195
MS275Sigma-AldrichEPS002
Trichostatin ASigma-AldrichT8552
Tubastatin ASigma-AldrichSML0044
Acetonitrile, HPLC-kwaliteitFisher Scientific10660131
Formaldehyde, LC/MS-kwaliteitFisher Scientific10596814
H2O, HPLC-kwaliteitgedistilleerd H2O gefilterd door een Milli-Q-zuiveringssysteem
HeLa-cellenATCCATCC CRM-CCL-2
Cell-dissociatiereagens TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013
DMSO, cellcultuurkwaliteitApplichem146463
DPBSThermoFisher Scientific14190144
Fetaal runderserumBiowestS1810
MEMThermoFisher Scientific22561021
Penicilline-StreptomycineBioconcept4-01F00-H
10x RIPA-bufferAbcamab156034
SigmaFast proteaseremmertablettenSigma-AldrichS8820
96-wells platen, steriele, platte bodem, behandeld voor weefselkweek CorningVWR29442-058
96-wells platen, niet-steriele, V-bodem CorningVWR29442-404gebruikt in de centrifugatiestap
96-wells plaat, conische bodem, NuncThermoFisher Scientific249944compatibel met het Acquity UHPLC-systeem
T75 cellcultuurflacons CorningSigma-AldrichCLS430641
Afplakbare hittesluitfolieWaters186002789
Acquity UPLC-systeemWaters
Eppendorf Centrifuge 5810 RFisher Scientific05-413-323
Integratiesoftware: MassLynx V4.1WatersCatalogusnummer niet beschikbaar
Combi thermo-sealer SP-0669/240WatersCatalogusnummer niet beschikbaar
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWatersCatalogusnummer niet beschikbaar

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
  2. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
  3. Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
  4. Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
  5. Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
  6. Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
  7. Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
  8. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
  9. Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
  10. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
  11. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
  12. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
  13. U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
  14. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
  15. Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
  16. Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).
  17. Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
  18. Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
  19. Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
  20. Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
  21. Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
  22. Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
  23. Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
  24. Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
  25. Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
  26. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HDAC1 en HDAC6 activiteitUHPLC MS analyseselectiviteit van HDAC remmerssubstraatdeacetylatie assaycellyseprotocoltrichostatine A MS275specificiteit van tubastatine AMOCPAC BATCP detectiescreening voor geneesmiddelenontwikkeling

Gerelateerde artikelen