Combinatie van Raman Imaging en Multivariate Analysis om Lignine, Cellulose en Hemicellulose in de Plant Cell Wall te visualiseren

Summary

Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.

Abstract

De toepassing van Raman imaging op plantaardige biomassa neemt toe omdat het ruimtelijke en compositie-informatie over waterige oplossingen kan bieden. De analyse vereist gewoonlijk niet uitgebreide monstervoorbereiding; Structurele en chemische informatie kan worden verkregen zonder etikettering. Echter, elke Raman-afbeelding bevat duizenden spectra; Dit leidt tot problemen bij het opnemen van verborgen informatie, vooral voor componenten met vergelijkbare chemische structuren. Dit werk introduceert een multivariate analyse om dit probleem aan te pakken. Het protocol stelt een algemene methode in voor het visualiseren van de hoofdcomponenten, waaronder lignine, cellulose en hemicellulose binnen de plantencelwand. In dit protocol worden procedures voor steekproefbereiding, spectrale aanschaf en dataverwerking beschreven. Het is sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator bij het voorbereiden van de monster- en data-analyse. Met behulp van deze aanpak kan een Raman-onderzoek worden uitgevoerd door een niet-gespecialiseerde gebruiker om hig te verwervenH-kwaliteitsdata en zinvolle resultaten voor plantencelwandanalyse.

Introduction

Plantenbiomassa is de meest voorkomende hernieuwbare bron op Aarde; bestaat voornamelijk uit lignine, cellulose en hemicellulose; en wordt beschouwd als een aantrekkelijke bron van bio-energie en op biologische basis gebaseerde chemicaliën¹. Helaas kan het degradatie weerstaan en hydrolytische stabiliteit of structurele robuustheid aan de plantencelmuur geven. Deze weerstand is toe te schrijven aan de beschikbare oppervlakte, grootte van de biomassadeeltjes, mate van polymerisatie, cellulosekristalliniteit en beschermend lignine². Een grondig begrip van de structurele en chemische aard van de plantencelmuur is dus belangrijk vanuit het oogpunt van plantenbiologie en -chemie, evenals vanuit het oogpunt van commercieel gebruik. Gewoonlijk gebruikte natte chemische analyses, zoals chromatografie, massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie, leveren alleen gemiddelde samenstellingsgegevens van het gemeten monster. Verder zijn deze methoden invasief en vernietigen ze de oorspronkelijke structuur van het plantenweefsel³.

De Raman-beeldvormingstechniek is een krachtig hulpmiddel voor de niet-destructieve visualisatie van ruimtelijk opgeloste chemische informatie⁴. Het gebruikt een laserlicht om een niet-elastische verstrooiing met een foton te veroorzaken en is gebaseerd op veranderingen in polariseerbaarheid die voortvloeien uit de moleculaire vibraties. In dit geval veroorzaakt water zwakke Raman-verstrooiing, wat deze benadering geschikt maakt voor in situ onderzoek van biologische monsters⁵. De toepassing van de Raman-beeldvormingstechniek op de plantencelmuur kan de structuur en samenstelling van plantencelwanden in hun oorspronkelijke toestand verduidelijken, met de resolutie op de schaal van een enkele cel en zelfs van de celwandlagen⁶. Een typische Raman-beeldvormingsanalyse van een plantencelmuur bestaat over het algemeen uit drie stappen: 1) monstervoorbereiding, 2) spectraal verkrijgen en 3) gegevensverwerking.

Hoewel een van de grote voordelen van Raman-beeldvorming de mogelijkheid is om label-vrije en niet-destructieve spectra te bereiken met minimale monstervoorbereiding, is fysiek monsterbemonstering nog steeds noodzakelijk om het oppervlak van belang bloot te leggen. Dit proces moet zorgvuldig worden uitgevoerd om een vlak oppervlak te verkrijgen, aangezien de techniek afhankelijk is van het behoud van de optische focus⁷. Spectraal verkrijgen vereist een evenwicht tussen beeldkwaliteit en uitgebreide verkrijgingstijden⁸. Gegevensverwerking is erop gericht om de chemische informatie effectief uit de beeldgegevens te extraheren, vooral voor de componenten met vergelijkbare chemische structuren, zoals cellulose en hemicellulose. Vanwege de sterke spectrale overlap zijn de exacte spectra moeilijk te onderscheiden. In dit geval is multivariate analyse een eenvoudige benadering om de verborgen structurele en chemische informatie effectief te onthullen⁹. Dit werk presenteert een algemeen protocol dat het gebruik van Raman-beeldvorming beschrijft om de belangrijkste componenten in plantencelwanden te visualiseren, inclusief lignine, cellulose en hemicellulose.

Protocol

1. Voorbeeld Bereiding

1. Knip een klein weefselblok (ongeveer 3 mm x 3 mm x 5 mm) van het plantenmonster af ( bijvoorbeeld een populierstam).
2. Dompel het weefsel gedurende 30 minuten in kokend gedeïoniseerd water. Breng het onmiddellijk naar gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten. Herhaal deze stap totdat het weefsel zinkt naar de bodem van de container, wat aangeeft dat de lucht in weefsel is verwijderd en dat het weefsel is verzacht.
   Opmerking: Voor de monsters die voor deze stap zinken, moet u deze cyclus 3-5 keer herhalen.
3. Bereid 20, 50, 70, 90% (v / v) porties polyethyleenglycol (PEG) in gedeïoniseerd water, evenals pure PEG, en houd de oplossingen bij 65 ° C.
4. Incubeer het weefsel in een reeks gegradeerde PEG-baden om het water te verplaatsen en de PEG te laten infiltreren.
   Opmerking: Typisch wordt PEG met een molecuulgewicht 2000 (PEG2000) gebruikt voor inbedding.
   1. Verwerk het weefsel met gPEG in een droogoven als volgt: (a) 20% PEG gedurende 1 uur, (b) 50% PEG gedurende 1,5 uur, (c) 70% PEG gedurende 2 uur, (d) 90% PEG gedurende 2 uur en (E) 100% PEG gedurende 10 uur.
5. Verwarm een ​​cassette bij 65 ° C in een oven. Giet de PEG die het blok bevat in de cassette en plaats het weefselblok op een gewenste plaats met behulp van voorverwarmde pincet of naalden.
6. Koel de cassette langzaam af en hou het weefsel bij kamertemperatuur op tot het gebruik.
7. Dissecteer het PEG-blok dat het doelweefsel bevat in een klein blokje (ongeveer 1 cm x 1 cm x 2 cm) met een scherp scheermesje en bevestig het op de microtome.
8. Snijd dunne delen van het PEG-blok (typisch 3-10 μm).
9. Spoel het gedeelte met gedeioniseerd water 10 keer in een kijkglas om de PEG uit het weefsel te verwijderen.
10. Dompel de deeltjes met tolueen / ethanol (2: 1, v / v) gedurende 6 uur om de extracties te verwijderen. Bereid de reactievloeistof door het mengen van 65 ml gedeïoniseerd water, 0,5 ml azijnzuur en 0,6 g natriumchloRite in een beker. Voeg een sectie en 3 ml reactievloeistof toe aan een 5 ml injectieflacon. Schroef de bovenkant van de injectieflacon aan.
11. Verhit de flesje in waterbad bij 75 ° C gedurende 2 uur om de lignine van het weefsel te verwijderen. Spoel de sectie met gedeïoniseerd water 10 keer in een kijkglas.
12. Breng de onbehandelde / gedeignificeerde sectie over op een glasmicroscoopschuif. Vouw het gedeelte voorzichtig uit met behulp van borstels of naalden. Verwijder het extra gedeioniseerde water met tissuepapier.
13. Dompel het gedeelte in D ₂ O. Bedek het monster met een glazen afdekplaat. Verzegel de deklaag met nagellak om de verdamping van de D ₂ O te voorkomen.

2. Spectrale Acquisitie

1. Open de instrumentbedieningssoftware van de confocal Raman-microscoop. Zet de laser aan (golflengte = 532 nm), focus op het oppervlak van het kristallijne silicium met een 100x microscoopdoelstelling en klik op de kalibratieknop om het instrument te kalibreren.
2. Schakel het instrument inNaar de optische microscoopmodus en zet de microscooplamp aan. Monteer de microscoopschuif op het podium, met de afdekplaat naar het object gericht.
3. Bekijk het monster met een 20x-microscoopdoelstelling en zoek het gebied van belang. Breng onderdompelingsolie aan op de deklaag en schakel over naar de immersionmicroscoopdoelstelling (60X, numerieke diafragma NA = 1.35). Focus op het oppervlak van het monster.
4. Schakel het instrument in de testmodus Raman en zet de microscooplamp uit.
5. Kies een kaartgebied door gebruik te maken van een rechthoekig gereedschap. Verander de stapgrootte om het aantal verkregen spectra te bepalen.
   Opmerking: Let op de stapgrootte (meestal groter dan de plaatsdiameter berekend door de numerieke diafragma van het doel, theoretisch 1.22λ / NA). Maten onder dit zullen resulteren in oversampling.
6. Stel de optimale spectrale parameters in om de beste signaal-ruisverhouding (SNR) en spectrale kwaliteit te verkrijgen in een geschikte aanschafstijd (in het algemeen <8 uur), depeNding op de geschiktheid van het monster. Typ in het algemeen de beeldparameters in de instrumentsoftware als volgt: laser (532 nm), filter (100%), gat (300), spleet (100), spectrometer (1,840 cm ^-1 ), groeven (1200t), objectief 60X olie), en verwervingstijd (2 s).
7. Bewaar de spectrale data voor gegevensverwerking en omzetten naar een universeel formaat ( bijv. TXT-bestanden).

3. Gegevensanalyse

1. Laad de spectrale data (TXT-bestanden) in de data-analyse software ( bijv. Matlab). Breng een geluidsreductie techniek aan op de dataset om de SNR te verbeteren (bijvoorbeeld het Savitzsky-Golay-algoritme of het waveletalgoritme)
2. Gebruik onbehandelde monsters om de afbeeldingen van lignine en polysacchariden te produceren. Voor lignin imaging, beschouw de spectrale piek rond 1.600 cm ^-1 door de aromatische ring symmetrische stretching vibratie. Voor polysaccharide imaging (inclusief cellulose en hemicellulose), gebruik de spectrale piek aRond 2,889 cm ^-1 door de CH en CH ₂ strekken.
3. Gebruik afgekeurde monsters om de afbeeldingen van cellulose en hemicellulose te genereren. Voer zelfmodellerende curve resolutie (SMCR) uit op de verworven spectra om de spectra van cellulose en hemicellulose te onderscheiden en om hun verdelingen te zien.
4. Voer hoofdcomponentanalyse (PCA) en clusteringanalyse uit op de verworven data om de Raman-spectra van verschillende celwandlagen te onderscheiden.

Results

Figuur 1 geeft een overzicht van een typisch micro-Raman systeem voor de Raman beeldvorming van een plantencelwand. Bijvoorbeeld, de oorspronkelijke Raman spectra van populier ( Populus nigra L.) hebben significante baseline drijvingen en spikes ( Figuur 2a ). Na het uitvoeren van de automatische voorverwerkingsmethode voor Raman imaging dataset (APRI) worden deze twee spectrale verontreinigingen succesvol verwijderd ( ...

Discussion

De plantencelmuur is een samengesteld materiaal dat in verschillende lagen is georganiseerd, inclusief celhoek (CC), secundaire muur (SW, met de S1, S2 en S3 lagen), en samengestelde midden lamella (CML, midden lamella plus de aangrenzende primaire Muur), waardoor het moeilijk is om een ​​platte oppervlakte te verkrijgen tijdens de monstervoorbereiding. Zo moeten plantmonsters, in het bijzonder gras, die een ingewikkelder structuur hebben dan hout, vaak worden gestolven om fijne snede te kunnen maken. PEG is een ideale ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtoom	Thermo Scientific	Microm HM430
Confocal Raman microscoop	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040