Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

11.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Samenvatting

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een van de methoden van keuze om verrijkte populaties van zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Momenteel staat het voor de discriminatie van maximaal 9 muizenkiemcelpopulaties met een hoge opbrengst en zuiverheid. Deze hoge resolutie in discriminatie en zuivering is mogelijk door unieke veranderingen in de chromatinstructuur en de hoeveelheid door middel van spermatogenese. Deze patronen kunnen worden gevangen door stromingscytometrie van mannelijke kiemcellen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen, zoals Hoechst-33342 (Hoechst). Hierin is een gedetailleerde beschrijving van een recent ontwikkeld protocol om zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Kortom, enkelvoudige cel suspensies worden gegenereerd uit testiculair weefsel door mechanische dissociatie, dubbel gekleurd met Hoechst en propidiumjodide (PI) en verwerkt door flowcytometrie. Een seriële gate strategie, inclusief de selectie van levende cellen (PI negatief) met verschillende DNA-inhoud (Hoechst intensiteit), iS gebruikt tijdens het sorteren van FACS om maximaal 5 soorten kiemcel te onderscheiden. Deze omvatten, met bijbehorende gemiddelde zuiverheden (bepaald door microscopie-evaluatie): spermatogonia (66%), primaire (71%) en secundaire (85%) spermatocyten, en spermatiden (90%), verder gescheiden in ronde (93%) en verlenging (87%) subpopulaties. Uitvoering van de gehele workflow is eenvoudig, het is mogelijk om tegelijkertijd 4 cellen te isoleren met de betreffende FACS-machine en kan binnen 2 uur uitgevoerd worden. Aangezien verminderde verwerkingstijd cruciaal is om de fysiologie van ex vivo cellen te behouden, is deze methode ideaal voor downstream high-throughput studies van mannelijke kiemcelbiologie. Bovendien elimineert een gestandaardiseerd protocol voor het zuiveren van zoogdierkiemcellen door middel van multispecies methodologische bronnen van variabelen en maakt het mogelijk om een ​​enkele reeks reagentia te gebruiken voor verschillende diermodellen.

Inleiding

Gezien het gebrek aan een in vitro systeem dat representatief is voor de progressie van spermatogenese en de aanwezigheid van grote cellulaire heterogeniteit in testis, vereist studies van mannelijke kiemcelbiologie robuuste technieken om verrijkte populaties van specifieke celsoorten te isoleren. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is algemeen gebruikt voor dit doel 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , omdat het hoge opbrengst en zuiverheid levert en andere isolatiemethoden overschrijdt in het aantal soorten kiemcellen die het kan identificeren en Selecteer 6 , 7 , 8 . Het principe van flow cytometry analyse is gebaseerd op de detectie van differentiële lichtpatronen na laserstraal excitatie van enkele cellen. Als een cel door de laser gaat, weerspiegelt / verspreidt het lichtIn alle hoeken, evenredig met de celgrootte (forward scatter; FSC) en intracellulaire complexiteit (side scatter; SSC). Zie Ormerod 9 voor gedetailleerde informatie over flowcytometrie.

Mannelijke kiemcellen ondergaan specifieke modificaties in DNA-inhoud, chromatinstructuur, grootte en vorm gedurende verschillende fases van spermatogenese. Dergelijke afzonderlijke celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd en gescheiden door het combineren van lichtverstrooiing en DNA-kleuring met fluorescerende kleurstoffen 10 , 11 . Verschillende kleurstoffen kunnen hiervoor worden gebruikt (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), zoals Hoechst-33342 (Hoechst), die in de loop van het decennium 1 , 2 , 4 , 10 vaak gebruikt is in de flowcytometrie analyse van testiculaire cellen. , 12 . upoN excitatie met UV-licht, geeft Hoechst blauwe fluorescentie die evenredig is aan het cellulaire DNA-gehalte, terwijl de verre rode fluorescentie de variabiliteit in chromatinstructuur en verdichting 1 , 13 , 14 weerspiegelt. Als gevolg hiervan vertoont mannelijke kiemcellen in verschillende stadia van differentiatie specifieke patronen tijdens FACS van Hoechst-gekleurde enkele cel suspensies (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant is dat de intensiteit van Hoechst-blauwe fluorescentie niet in verhouding staat tot het chromatinegehalte in deze cellen, doordat het een effectieve kleurstofuitvloeisel is die alleen actief is tijdens het spermatogonale stadium, en ze clusteren als zijpopulatie tijdens Ho-FACS 15 . Bovendien combineert het combineren van Hoechst-kleuring met het niet-permeante kleurstofpropidiumjodide (PI) gebruikers de mogelijkheid om live (PI-negatief) te onderscheiden van dode (PI positieve) cellen tijdens FACS 1 , 2 , 10 , 12 . Deze strategie is eerder gebruikt in flowcytometrische analyses van testische kiemcellen en is uitgebreid geoptimaliseerd in de muis om maximaal 9 kiemcellen te onderscheiden, waaronder cellen in 4 verschillende stadia van meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Voor dit werk heeft Hoechst-kleuring drie voornaamste voordelen. Ten eerste is Ho-FACS succesvol toegepast op de isolatie van mannelijke kiemcellen in het muismodel 1 , 2 , 12 en andere knaagdieren zoals rat en cavia 17 , 18 , 19 . Ten tweede, Hoechst is een celdoorlatende kleurstof en vereist geen membraanpermeabilisatie, zodat het zich voordoetVes celintegriteit. Tenslotte is geen RNase-behandeling nodig, aangezien Hoechst bij voorkeur aan poly (d [AT]) DNA-sequenties 1 , 20 bindt, wat betekent dat RNA bewaard blijft en naast DNA en eiwitten kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse moleculaire studies van kiem Celdifferentiatie.

Ondanks de gelijkenis in DNA-ploïdie en / of vlekkelijkheid waargenomen in flowcytometrie-analyses van zoogdiersoorten (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), is er een grote mate van variabiliteit in de protocollen beschreven voor mannelijke kiemcelisolatie door flowcytometrie. Verschillende studies hebben specifieke protocols toegepast voor weefseldissociatie, en gebruikten afzonderlijke DNA-bindende kleurstoffen (alleen of in combinatie) en FACS-gatingstrategieën in verschillende modelorganismen, vooral de muis, de rat en de cavia. Bijgevolg kan directe vergelijking van gegevens verzameld voor verschillende soorten worden beïnvloed door unaccoUnted technische artefacten die voortvloeien uit variabiliteit tussen methodologieën. Belangrijk is dat het opvallende behoud van chromatin dynamiek door middel van zoogdierspermatogenese (2N-4N-2N-1N) suggereert dat een gestandaardiseerd protocol transversaal toegepast kan worden op een verscheidenheid aan zoogdieren.

Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een enkele workflow die van toepassing is op verschillende zoogdieren, door het combineren en aanpassen van eerder gepubliceerde technieken 2 , 20 . Standaardisatie van een werkwijze voor weefselverwerking werd bereikt door mechanische dissociatie te verrichten om de behoefte aan speciesspecifieke aanpassingen die nodig zijn voor enzymatische vertering 5 te overwinnen. Het is opmerkelijk dat mechanische dissociatie van knaagdiertesticulaire weefsels is aangetoond dat ze beter presteren dan enzymatisch weefselvertering 20 en Ho-FACS van enkelcelsuspensies die worden gegenereerd door beide methodenHet vergelijkbare resultaat 5 . Als principieel bewijs beschrijft dit protocol de instellingen die worden gebruikt om tot 5 kiemcelpopulaties te isoleren: spermatogonia (SPG); Primaire (SPC I) en secundaire spermatocyten (SPC II) en spermatiden (SPD) - ronde (rSPD) en verlenging (eSPD). Belangrijk is dat het gemakkelijk in het laboratorium kan worden geïmplementeerd, waarbij de belangrijkste vereisten het systeem zijn voor weefseldissociatie en toegang tot een celsoort uitgerust met een UV-laser. Deze workflow ( Figuur 1 ) is snel en eenvoudig en maakt het mogelijk dat 4 kiemcellenpopulaties tegelijkertijd uit vers testikelweefsel in minder dan 2 uur worden verwijderd. De verminderde verwerkingstijd is van cruciaal belang om de cellulaire integriteit te behouden voor verdere downstream procedures. Bovendien suggereert de succesvolle prestatie in 5 verschillende soorten dat het in het zoogdierklauw in grote mate kan worden toegepast, waardoor het de ideale methode is om kiemcellen te isoleren voor vergelijkende studies van zoogdieren mannelijke voortplantingsbiolgie.

Dit protocol bestaat uit drie hoofdafdelingen, afgezien van voorbereidende stappen: (1) de mechanische dissociatie van testicularweefsel en (2) kleuring van testiculaire cellen met Hoechst en PI, gevolgd door (3) FACS-sortering van relevante spermatogene cellen. Eenmaal verzameld, kunnen deze verrijkte bevolkingen van verschillende zoogdier testulaire kiemcellen gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen. Dit protocol beschrijft een dissociatiemethode met een grootte van één maat, om mannelijke kiemcellen van veel verschillende zoogdieren te zuiveren. Afhankelijk van het type studie dat gebruikers met de geïsoleerde kiemcellen willen uitvoeren, kunnen andere media of buffers worden gebruikt. De volgende protocol stappen zijn voor het opwekken van enkel-cel suspensies van één hele murine testis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures die hieronder beschreven zijn, zijn in overeenstemming met de voorschriften van het Comité voor dierstudies aan de Universiteit van Washington in St. Louis.

1. Voorbereidingen voor mechanisch dissociatieprotocol

  1. Pre-nat een 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge voor dissociatie van een hele muizen testis.
    OPMERKING: Deze disposable weefsel disaggregatie cartridge bevat microbladen ontworpen voor het snijden van weefsels en een onbeweeglijk staal gaas met ongeveer 100 zeshoekige gaten. Verschillende maten van mesh voor weefsel disaggregatie cartridge zijn beschikbaar om dit protocol aan te passen op basis van soorten en gewenste celtypes. 50 μm cartridges werden gebruikt voor alle zoogdieren die in dit document genoemd worden.
    1. Laad 1 ml ijskoude fenol roodvrij 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) op de 50 μm disposable tissue disaggregation cartridge.
      OPMERKING: Fenol rood kan interfereren met detectie van rode fluorenCence tijdens FACS.
    2. Aspireren 1x DMEM uit de weefsel disaggregatie cartridge met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort.
  2. Schakel het weefselafscheidingssysteem in door op "ON" te drukken. Dit systeem vereist geen "opwarmen" tijd.
  3. Voor-nat drie 40 μm wegwerpfilters met ijskoud 1x DMEM. Plaats elk 40 μm wegwerpfilter op een 50 ml conische buis. Pipetteer 1 ml 1x DMEM en laat de vloeistof doorgaan.
  4. Bereid een 100 mm x 15 mm Petri schotel voor het verzamelen van testicularweefsels. Pipet 500 μL van 1x DMEM op de Petri-schotel.

2. Bereiding van testicularweefsel voor mechanisch dissociatieprotocol

  1. Dissecteer een mannelijke muis om verse gehele testes of testikelfragmenten voorzichtig te verwijderen (bij het omgaan met andere zoogdieren) met chirurgische scharen en pincetjes.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat weefsels vrij zijn van vet en necrose. fr Esh testiculaire weefsels produceren superieure single-cell suspensie kwaliteit dan bevroren weefsels.
    1. Verzamel verzamelde testes / fragmenten naar de voorbereide 100 mm x 15 mm Petri schotel die 500 μL 1x DMEM bevat.
    2. Spoel het weefsel voorzichtig in 1x DMEM om rode bloedcellen te verwijderen (indien aanwezig).
  2. Trek de tunica albuginea voorzichtig uit. De dikte van tunica albuginea zal variëren in verschillende soorten.
    1. Pak een uiteinde van testis met tang.
    2. Puncteer het andere uiteinde van testis met een scalpel terwijl u het ene uiteinde van de testis nog steeds vasthoudt met een tang van de vorige stap.
    3. Scrape testicular tubules met behulp van een scalpel terwijl nog het ene uiteinde van testis met tang van stap 2.2.1.
  3. Knip testicularbuisjes in stukken van 2-3 mm 3 met een scalpel.

3. Verkrijgen van eencelsuspensies door mechanische dissociatie van testicularweefsel

Ontent "> OPMERKING: De dissociatiestappen die hieronder worden beschreven, zijn voor een volwassen muis testis. Volumes testicularweefsels van jonge muizen of niet-muizen soorten moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Juveniele dieren mogen niet alle stadia van kiemcellen bevatten. Sommige zoogdiersoorten hebben Testiculaire weefselsamenstelling verandert tijdens de broeizoenen in vergelijking met het niet-parende seizoen.

  1. Breng de kleine testikelbuisjes over naar de voorvervette 50 μm weefselafbraakpatroon met behulp van tang en voeg 1 ml 1x DMEM toe.
  2. Laad de weefselafbraakpatroon in weefselafscheidingssysteem en verwerk deze gedurende 5 minuten door de knop van stand-by naar de "run" -modus te draaien.
  3. Verwijder de weefselafbraakpatroon uit het weefselsistaggregatiesysteem en aspireer de cel suspensie met een 3 ml naaldloze injectiespuit uit de spuitpoort.
    1. Aspireer een paar keer om alle vloeistof te verwijderen uit weefsel disaggregatie cartridge. NietAlle 1 ml kan worden hersteld uit de weefsel disaggregatie cartridge.
  4. Pass de gesuspendeerde cel suspensie door twee wegwerpvaste 40 μm filters. Filter tweemaal om eventuele celaggregaten te verwijderen.
    1. Plaats een voorverstoken 40 μm filter in een 50 ml conische buis. Voeg aspirated cellen direct in de spuit op het 40 μm filter. Pipet-door-eenzijdige suspensie met een wegwerppipet.
    2. Verwijder het gebruikte voorgelaste 40 μm filter en plaats een ander voorverstoken 40 μm filter in de 50 ml conische buis. Pipet de verzamelde enkelcelsuspensie op het schone 40 μm filter.
    3. Verzamel gefilterde enkelcelsuspensie met een schone wegwerppipet.
  5. Pipette gefilterde cel suspensie terug naar de 50 μm weefsel disaggregatie patroon en proces gedurende nog eens 5 minuten in een weefsel disaggregatie systeem.
  6. Herstel alle vloeistof uit de weefsel disaggregatieOp de cartridge.

4. Verven met Hoechst en Propidiumjodide (PI)

  1. Overdracht herstelde cel suspensie van de 50 μm weefsel disaggregatie cartridge naar een schone 1,5 ml buis. Ongeveer 1-1,5 ml single-cell suspensie wordt hersteld.
  2. Verdeel de herstelde enkelcelsuspensie in vier 1,5 ml of 5 ml buizen.
    1. Voor de eerste drie buizen, pipette 150 μL single-cell suspensie en pipette rest van een-cel suspensie in de laatste van de vier buizen (ongeveer 550 μL single-cell suspensie).
      OPMERKING: Het bedrag van eencelsuspensie in de laatste buis kan variëren op basis van de efficiëntie van celsuspensieherstel bij stap 3.6.
  3. Zet de eerste buis van de vier buizen als een onbedekte controle voor de FACS-sessie.
  4. Bereid enkele kleurstofkleuren (PI of Hoechst) cel suspensies als controles op. Voeg 2,5 μL Hoechst of 1 μl PI aan elke buis toe (tweede en third).
  5. Maak een dubbelkleurige buis klaar. Dit wordt gebruikt voor het verzamelen van kiezelcel subpopulaties. Voeg 2,5 μL Hoechst en 1 μl PI toe aan de laatste buis.
    OPMERKING: Hoechst heeft een houdbaarheid van 2-3 maanden. Het gebruik van oudere voorraden kleurstof zorgt voor significante veranderingen tijdens de FACS-sessie.
  6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Plaats monsters in een buisrotator of draai de 1,5 ml buizen om om de 5-10 minuten.
  7. Filtercelsuspensie met een voorvochtige 40 μm filter en hou de gefilterde oplossing op ijs en in het donker tot de FACS sessie.
    OPMERKING: De filtratiestap is nodig om celcellen voor FACS te voorkomen. Daarnaast kan de behandeling met DNase (zie Figuur 1 ) of 2-Naphthol-6,8-disulfonzuur-dikaliumzout (NDA 20 ) worden gebruikt om celklontering te beperken. Langdurige wachttijden zullen invloed hebben op het fluorescerende signaal dat gedetecteerd wordt tijdens FACS en kan leiden tot een verhoogde celdood.

5. Fluorescentie Geactiveerde Cell Sorting (FACS) Setup en Zuivering van Testiculaire Cellen

  1. Bereid FACS-buizen op.
    1. Bedek 5 ml polypropyleen ronde bodembuizen of 1,5 ml buizen met 400 μL FBS voor celverzameling. Decant overtollig FBS na coating.
    2. Voeg FACS verzamelmedium (1x DMEM + 10% Fetale Bovine Serum, FBS) toe aan de buizen: 1 ml voor 5 ml buizen of 100 μl voor 1,5 ml buizen.
  2. Stel de juiste sorteringsomstandigheden in cel sorteren en software op.
    OPMERKING: Andere celsorteringsmachines en analysesoftware kunnen worden gebruikt bij de hieronder beschreven vergelijkbare setup- en gateway-strategieën. De hier beschreven omstandigheden werden aangepast uit Gaysinskaya en Bortvin 2 , Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 en Getun, et al. 4
    1. Laad een ultraviolette laser met 463/25 nm bandpasfilter om Hoechst blauw en 680 nm LP-bandfilter te detecteren om Hoechst rood te detecteren en PI te detecteren.
    2. Gebruik een 555DLP dichroische spiegel om blauw te onderscheiden van rode fluorescentie.
    3. Gebruik een 70 μm spuitmond en sorteer cellen met een snelheid van 1000-2000 cellen / seconde.
      OPMERKING: Sorteringsefficiëntie wordt direct beïnvloed door de stromingssnelheid. Hoge stromingssnelheden (> 3500 gebeurtenissen / s) verhogen de snelheid van sorteren, maar resulteren in vervuiling van populaties. Zie referentie 12 voor verdere informatie.
  3. Zet poorten met controle monsters.
    1. Laad en run onbeschadigd monster.
    2. Exclusief celresten op basis van FSC vs SSC plot patroon. Cell puin komt in het linker linker kwadrant van het plot op. Stel de drempel voor celresten willekeurig door de gebruiker of de cel sorteren technicus.
    3. Poort op enkele cellen door de drempel voor FSC en pulsbreedte aan te passen. Verschillende celsorterers hebben verschillende manieren om te onderscheidenGuish singlets. Aangezien de pulsbreedte de tijdscellen weerspiegelt om de laser over te gaan, hebben enkele cellen lagere waarden in vergelijking met multicellulaire aggregaten. Het instellen van drempel op een plot voor FSC versus pulsbreedte kan gebruikt worden voor singlets.
    4. Stel optimale fotomultiplierbuis (PMT) spanningen in.
    5. Gebruik zowel onbeschadigde als enkelkleuren gekleurde cellen om de drempel van PI of Hoechst fluorescentiesignaal vast te stellen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de basislijn PTM spanningen te optimaliseren voor de cellen van belang om het juiste fluorescentiebereik voor elke kleurstof te bepalen. Dit is cruciaal voor optimale signaaldetectie en gevoeligheid. De onbeschadigde en enkelgekleurde controlecellen worden gebruikt om een ​​reeks van negatief en positief gekleurde cellen te bepalen met PI- en / of Hoechst-kleurstoffen en minimaliseert ruis in signalen. Voor nadere uitleg over de optimalisatie van PMT-spanning met behulp van controlecellen, verwijzen wij u naar Gaysinskaya en Bortvin 2
    6. Poort op levende celS gebaseerd op PI-kleuring (PI-negatief) en FSC-plot. Dode cellen zullen positief zijn voor PI-fluorescentie.
    7. Stel de DNA-inhoudshek in door een histogram van celtellingen te berekenen op basis van Hoechst Blue Fluorescence. 3 pieken met toenemende concentraties Hoechst blauwe fluorescentie zouden moeten verschijnen, die haploïde (1C), diploïde (2C) en tetraploïde (4C) cellen vertegenwoordigen. Stel 3 poorten in, één voor elke piek.
    8. Let op minstens 500.000 gebeurtenissen op FSC vs SSC plot voordat u verder gaat naar de kiemcelpopulaties.
  4. Poort verschillende kiemcel populaties.
    1. Laad Hoechst / PI bevlekte monster.
    2. Stel de eerste 3 ouderpoorten vast die gemeenschappelijk zijn voor alle populaties.
      1. Exclusief celresten op basis van de FSC vs SSC plot. Selecteer singlets op basis van de FSC vs pulsbreedte plot. Selecteer levende cellen door PI negatieve cellen te geven.
    3. Definieer spermatogonia gate.
    4. Plot PI negatieve cellen op basis van Hoechst blauwe en rode fluorescentieintensiteiten. Spermatogonia verschijnt als een zijpopulatie (zie figuur 1 ).
    5. Definieer poorten voor de overgebleven kiemcelpopulaties. OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 en aanvullende figuur 2 voor visuele details.
    6. Plot PI negatieve cellen in de DNA-inhoudshek.
      1. Voor spermatiden poort de piek met de laagste Hoechst fluorescentie (1C).
      2. Voor spermatocyten II, poort de piek met intermediaire Hoechst fluorescentie (2C).
      3. Voor spermatocyten ga ik de piek met hoogste Hoechst fluorescentie (4C).
    7. Plot Hoechst blauwe en rode fluorescentie-intensiteit om spermatocyten en spermatidenpopulaties uit DNA-inhoudshekken te verfijnen.
  5. Verzamel de geselecteerde subpopulatie poorten in de eerder verzamelde collectiebuizen. Elke testis zal gemiddeld 45 minuten tot 1,5 uur nemen om ongeveer 0,5-6,0 x 10 6 cellen te verzamelen voor elke subpopulatie.
    OPMERKING: Langdurige celblootstelling bij Hoechst maY verplaats de locatie van de populaties met de tijd iets. Vernieuw de instellingen na 20-30 minuten FACS. Maximale opbrengst voor elke subpopulatie zal afhankelijk zijn van de efficiëntie van dissociatiestap.

6. Microscopische evaluatie van gezuiverde cellen

  1. Spin verzamelde cellen bij 500-600 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  2. Cel-pellet opnieuw opschorten met 1 ml ijskoude 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) of 1x DMEM.
    OPMERKING: Het re-suspension volume kan worden aangepast aan het aantal gesorteerd cellen en de gewenste eindconcentratie.
  3. Pipetteer 40 μl gewassen cellen op een schone glijschuif en plaats een deksel.
  4. Bevestig de resterende cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) en zet vast cellen bij 4 ° C in het donker voor toekomstige verwijzing.
    1. Pipet 100 μL 4% PFA direct in de verzamelbuizen.
    2. Vortex de buizen of pipet kortstondig om ervoor te zorgen dat de cel suspensie goed gemengd wordt.
  5. Visualiseer de voorbereide dia's in een microscoop uitgerust met een UV-lamp om Hoechst-fluorescentie te detecteren onder een 63X-doelstelling. Raadpleeg de sectie Resultaten - Morfologische evaluatie van gesorteerde kiemcellenpopulaties - voor meer informatie over het identificeren van specifieke kiemceltypes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Enkelvoudige cel suspensies van mechanische dissociatie van testiculair weefsel

Figuur 2 vergelijkt enkele cel suspensies verkregen door mechanische dissociatie van muis testicular weefsel onder verschillende omstandigheden. Monsters verkregen door het verwerken van vers weefsel, onbeschadigd ( Figuur 2A ) of gekleurd met Hoechst ( Figuur 2B...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gezien de sterk geconserveerde chromatin dynamiek tijdens spermatogenese bij zoogdieren, was het doel van dit werk een protocol te ontwikkelen om mannelijke kiemcellen in afzonderlijke stadia van differentiatie van verschillende zoogdier testulaire weefsels te isoleren ( Figuur 1 ). Een van de belangrijkste obstakels bij het toepassen van een enkele workflow op verschillende diermodellen is de behoefte aan soortspecifieke aanpassingen, met name wat betreft weefseldissociatieprotocollen. Hui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken het Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) voor hondentestes; Jason Arand en Dr. Ted Cicero's lab aan de Washington University in St. Louis (WashU) voor het leveren van rat testes en Brianne Tabers voor het assisteren van de collectie; Jared Hartsock en Dr. Salt's Lab bij WashU voor de proefkonijnen; En Dr. Michael Talcott bij de afdeling Comparatieve Geneeskunde bij WashU voor de miniatuur varkens testis. De auteurs erkennen ook het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine en Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, voor het gebruik van de Siteman Flow Cytometry Core, die een door de personeelsleden georganiseerde celsorteringsdienst leverde. Het Siteman Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.

Dit onderzoek werd gefinancierd door een FCT-doctorale gemeenschap [SFRH / BD / 51695/2011 naar ACL], subsidies van de Verenigde Staten National Institutes of Health [R01HD078641 en R01MH101810 naar DFC] en een FCT onderzoeksovereenkomst [IF / 01262/2014 naar AML].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% paraformaldehydeVWR#157104% PFA, Voor het fixeren van gesorteerd cellen
MedimachineBD Biosciences#340588;Systeem voor testis dissociatie
1X Dulbecco gemodificeerd Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, voor testis dissociatie
MediconBD Biosciences#340591Disaggregatie cartridge voor testis dissociatie
Fetaal bovien serumThermo Scientific#10082139FBS, voor FACS verzameling
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoechst, Voor FACS kleuring
40 µm cel strainerGREINER BIO-ONE#89508-342Voor testis dissociatie
100x 15 mm petrischaalFalcon#351029Voor testis dissectie
5 mL polypropyleen buisjes met ronde bodemFalcon#352063Voor FACS verzameling
1,5 mL Eppendorf buisjesVWR#20170-650Voor FACS verzameling
3 mL naaldloze spuitBD Biosciences#309657Voor testis dissociatie
50 mL conische buisMIDSCI#C50RVoor testis dissociatie
Propidium JodideInvitrogen#L7011PI, Voor FACS kleuring
MoFlo Legacy cell sorterBeckman Coulter#ML99030Voor FACS
Summit Cell Sorting softwareBeckman Coulter#ML99030Voor FACS
Fosfaat gebufferde salineThermo Scientific#AM9625PBS, Voor microscopie
Microscopische glazen plaatFisher Scientific#12-544-4Voor microscopie
Glazen dekglasFisher Scientific#12-548-87Voor microscopie
Weggeef pipet (3 mL)Samco Scientific#225Voor testis dissociatie
DNase IRoche#10104159001Voor testis dissociatie
Koolstofstaal chirurgisch mesMiltex#4-111Voor testis dissectie
Countess geautomatiseerde celtellerInvitrogen#C10227Voor automatische celtelling
Trypan blauw oplossing (0,4%)Sigma#T8154Voor levensvatbaarheidskleuring

Referenties

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hoechst kleuringpropidiumjodidefluorescence activated cell sortingisolatie van spermatogoniaanalyse van spermatocytenscheiding van spermatiden
Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.