Methodenartikel

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 oktober 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript wordt beschreven standaardprotocollen voor het meten van tau hyperphosphorylation, tau binding aan de microtubuli, en lokalisatie van intracellulaire tau drug behandelingen na te meten. Deze protocollen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van drugs of andere verbindingen die gericht zijn op tau hyperphosphorylation of microtubulus bindend.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De microtubulus-geassocieerde eiwit tau is een neuronale eiwit dat meestal in axonen lokaliseert. Over het algemeen is tau essentieel voor normale neuronale functioneren omdat het is betrokken bij microtubulus vergadering en stabilisatie. Naast neuronen, wordt tau uitgedrukt in de menselijke borst, prostaat, maag, colorectale, en alvleesklier kanker waar het toont bijna vergelijkbare structuur en soortgelijke functies uitoefent als de neuronale tau. Het bedrag van tau en haar fosforylatie kunt wijzigen van haar functie als stabilisator van microtubuli, en leiden tot de ontwikkeling van de gepaarde spiraalvormige gloeidraden in verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer. Vaststelling van de staat van de fosforylatie van tau en de microtubuli-bindende eigenschappen ervan is belangrijk. Daarnaast is onderzoekt de intracellulaire lokalisatie van tau belangrijk in verschillende ziekten. Dit manuscript details standaardprotocollen voor het meten van tau fosforylatie en tau binding aan microtubuli in colorectal kankercellen met of zonder curcumine en LiCl behandeling. Deze behandelingen kunnen worden gebruikt om kanker celproliferatie en ontwikkeling te stoppen. Intracellulaire lokalisatie van tau wordt onderzocht met behulp van immunohistochemistry en confocale microscopie tijdens het gebruik van lage hoeveelheid antilichamen. Deze testen kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor het screenen van verbindingen die tau hyperphosphorylation of microtubulus bindende beïnvloeden. Roman therapeutics gebruikt voor verschillende tauopathies of verwante anticancer agents kunnen mogelijk worden gekarakteriseerd met behulp van deze protocollen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een warmte-stable microtubulus-geassocieerde proteïne, dat mede gezuiverde met tubuline1 was. Tau wordt uitsluitend uitgedrukt in hogere eukaryoten2,-3,4. De belangrijkste functie van tau is controle microtubulus vergadering1,5,6. Het draagt ook bij aan de polymerisatie van microtubuli7axonale vervoer8, veranderingen in axonale diameter9, vorming van neuroma polariteit en neurodegeneratie10. Tau fungeert ook als een eiwit steiger om te controleren enkele signaalroutes. Rat hersenen studies suggereren dat tau is neuron-specifieke en dat het voornamelijk in axonen11 lokaliseert. Omdat tau essentieel voor microtubuli polymerisatie en neuronale ontwikkeling is, was tau hypothetische om te spelen een belangrijke rol in axonale ontwikkeling in het centrale zenuwstelsel; deze hypothese werd later gecontroleerd door in vitro en in vivo experimenten. Naast neuronen, wordt tau uitgedrukt in verschillende non-neuronale cellen, met inbegrip van lever, nieren en spieren cellen12,13. Tau komt ook tot uiting in de menselijke borst, prostaat, colorectale, maag, en alvleesklier kanker cel lijnen en weefsels14,15,16,17,18, 19. tau wordt ook gevonden in opname-lichaam myositis als gedraaide tubulofilaments in integratie organen20.

Tau kan verschillende posttranslationele modificaties uitvoeren. Van alle posttranslationele modificaties is fosforylatie de meest voorkomende. Verhoogde tau fosforylatie vermindert zijn affiniteit voor de microtubuli, ten slotte destabiliserende het cytoskelet. Vijfentachtig fosforylatie sites zijn beschreven in tau-eiwit geïsoleerd uit menselijke Alzheimerpatiënten hersenen weefsels. Deze sites vormen 53% slechts 6% tyrosine residuen21,22,23, serine en threonine van 41%. Tau fosforylatie van invloed is op de lokalisatie, functie, bindende, oplosbaarheid en haar gevoeligheid voor andere posttranslationele modificaties. Meer dan de normale omvang ook tau fosforylatie (of volledig verzadigd met fosfaat groepen) staat bekend als hyperphosphorylation die structurele en functionele kenmerken van de ziekte van Alzheimer24repliceert. Tau onderhoudt goede werking van de axonale microtubuli en zorgt voor een normale neuronale werking onder fysiologische omstandigheden. Hyperphosphorylated tau mislukt echter om een overzichtelijk microtubulus-binding, waardoor neuronale verlies vanwege microtubulus demontage. Normale niveaus van tau fosforylatie zijn vereist voor juiste tau werking, maar tau mislukt om normaal te functioneren als haar karakteristieke fosforylatie niveau wordt gewijzigd en als het hyperphosphorylated25. In de ziekte van Alzheimer en sommige andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen, tau wordt hyperphosphorylated en vormt de gepaarde spiraalvormige filamenten en neurofibrillary klitten26,27. Dus, de methoden voor de bepaling van tau fosforylatie en microtubulus bindend zijn belangrijk.

Colorectaal carcinoom, een vergrijzing-geassocieerde kanker, is dat de derde meest voorkomende diagnose kanker en de derde prominente dood veroorzaken kanker voor mannen én vrouwen28. Colorectal kanker is één van de belangrijkste dood-veroorzaakt kanker in de westerse wereld29. Omdat zowel colorectale kanker en de ziekte van Alzheimer geassocieerd met vergrijzing worden en beide voornamelijk in de ontwikkelde landen waar de mensen genieten van soortgelijke voedingsgewoonten gebeuren, kunnen de twee ziekten een of andere manier worden gecorreleerd. Daarnaast reageren tau-positieve en tau-negatieve kankercellen anders op chemotherapeutische agenten, bijvoorbeeld, paclitaxel16.

Curcumine is een van de belangrijkste derivaten van Curcuma longa, de Indische specerij kurkuma30. Eeuwenlang hebben de Zuid-Aziatische populaties kurkuma in hun dieet op een dagelijkse basis verbruikt. Curcumine is gebruikt voor de behandeling van verschillende ziekten, met inbegrip van colorectal kanker, de ziekte van Alzheimer, diabetes, cystic fibrosis, inflammatoire darmziekte, artritis, hyperlipidemie, atherosclerose en ischemische hartziekte31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan ook colorectal kankercellen doden of te voorkomen dat hun proliferatie39. Lithium kan ook worden gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer40 zoals het tau aggregatie vermindert en de hyperphosphorylation voorkomt zoals waargenomen in een transgene muis model41,42,43, 44.

Dit manuscript wil: 1) meet de totale tau en de phospho-tau expressie niveaus in de behandelde cellen; 2) beschrijven een fosfatase assay voor het meten van totale tau fosforylatie; 3) onderzoeken microtubuli-bindende voor tau; en 4) lokaliseren tau door confocale microscopie in colorectal kanker cellijnen behandeld met curcumine of LiCl. Resultaten blijkt dat de behandeling van de cel met curcumine, die een zogenaamd goede chemotherapeutische agent voor darmkanker is, en behandeling met LiCl uitdrukking van beide totale tau kan verminderen en phosphorylated tau in colorectal kanker cellijnen. Deze behandelingen kunnen ook leiden tot nucleaire translocatie van tau. Echter onverwacht, mislukt curcumine om de binding van tau tot microtubuli.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van reagentia

  1. toevoegen 10 µL van het (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluoride oplossing, 10 µL (1 x uit 100 x voorraad) van protease inhibitor cocktail oplossing, en 10 µL (1 x uit 100 x voorraad) van fosfatase remmer cocktail oplossing tot 1 mL van de 1 x radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer te bereiden de volledige lysis de buffer RIPA.
  2. Voorbereiden 10 x algemene tubuline buffer (PEM) buffer.
    1. Toevoegen 800 mM (6.0474 g) piperazine-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur, 10 mM (51 mg) MgCl 2 en 1.25 M (3 mL 10 M) NaOH in een tube van 50 mL , meng met 15 mL gedestilleerd water en los met behulp van een vortex. Controleer de pH (moet 6.9). Als pH > 6,9, negeren de buffer en de remake van verse alot.
      Opmerking: NaOH moet minder dan 1,25 M om ervoor te zorgen dat pH doet niet meer bedragen dan 6,9. Het is niet aangeraden om HCl gebruiken voor het aanpassen van de pH > 6,9.
    2. Toevoegen NaOH ontkleuring totdat pH 6,9. Voeg gedistilleerd water zodat maximaal 25 mL 10 X PEM buffer. Ten slotte, filteren met behulp van een spuit en een 0,2 µm spuit filter. Verdeel deze buffer in aliquots in 1,5 mL buizen en bewaren bij 4 ° C.
  3. Voorbereiden 5 x monster buffer met reductiemiddel en kleurstof.
    1. Mix 300 µL (60 mM) van 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 2,5 mL (25%), 50% glycerol, 1 mL (2%) 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1,2 mL gedestilleerd water te halen 5 mL 5 x SDS monster buffer. Bewaren bij − 20 ° C.
      Opmerking: Omdat glycerol visceuze, meten van 1,25 mL glycerol is moeilijk. Één mL 100% glycerol weegt 1.26 g. Dus weeg 1.575 g 100% glycerol (die gelijk is aan 1.25 mL voor 100% of 50% glycerol 2,5 mL) in een 15 mL tube eerst; Meng goed met de andere componenten.

2. Cel cultuur, behandeling met curcumine of LiCl behandeling en onderzoek van eiwit expressie

  1. toevoegen ~ 1 x 10 6 HCT 116 cellen in 100 mm weefselkweek gerechten met de Minimum essentiële Media (MEM) aangevuld met 10% foetale runderen serum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Na één dag kweken, cellen zal het bereiken van 60-70% samenvloeiing.
    Opmerking: Het aantal platen nodig is afhankelijk van het aantal behandelingen die hieronder worden beschreven.
  2. Wanneer cellen bereiken van ~ 65% samenvloeiing (benaderd met behulp van microscopie), verwijder het medium van MEM aangevuld en serumvrij MEM met 5 µM, 10 µM, 30 µM curcumine of 25 mM, 50 mM en 100 mM LiCl toevoegen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur in een bevochtigde sfeer met 5% CO 2.
  3. 24 h na de behandeling, wassen van de cellen met 1 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en de cellen met behulp van een cel schraper Schraap. Overdracht de geschraapt cellen 1,5 mL Centrifugeer buizen en Centrifugeer gedurende 4 minuten bij 1800 x g bij 4 ° C tot het verkrijgen van cel pellets.
  4. Lyse de cellen door schorsing van de pellets in 100 µL van volledige RIPA buffer bij 4 ° C gedurende 20 minuten terwijl het regelmatig te tikken op de buizen. Bewerk de monsters kort ultrasone trillingen ten.
  5. De homogenates van de cel in een benchtop centrifuge op 22,570 x g gedurende 20 minuten centrifugeren bij 4 ° C. het supernatant overbrengen naar andere gelabelde buizen met behulp van een precisiepipet.
  6. De eiwitconcentratie in het supernatant meten door de Bradford assay 45 werken met commerciële eiwit-assay kits.
  7. Voorbereiden monsters van gelijke eiwitconcentratie (10 µg eiwit/13 µL monster) van cel lysates met 4 X SDS gel-laden buffer. Bereid 4 x SDS gel-laden buffer vers met 400 mM dithiothreitol (DTT).
    Opmerking: In dit stadium monsters kunnen worden achtergelaten bij − 20 ° C indien nodig.
  8. Incubate de monsters op een warmte blok bij 100 ° C gedurende 5 min. Mix de monsters met behulp van een draaikolk en wacht te koelen ze ~ 10-15 min.
  9. Assemble een systeem van elektroforese.
    1. Belasting 10 µg eiwit (13 µL monster) per putje op een 10% SDS-polyacrylamide-gel voor elektroforese (SDS-pagina). Laden van de ladder van de moleculair-gewicht op de gel te een rijstrook.
      Opmerking: Aangezien elektroforese begint, de ladder eiwit Lost in eiwit bands van schijnbare molecuulgewicht. Gebruik van deze banden te schatten van het molecuulgewicht van het onbekende proteïne bands.
    2. Na het laden van de monsters, de positieve en negatieve elektroden van de Elektroforese van het systeem aansluiten op een voedingsbron te handhaven van een constante spanning. Aanvankelijk, beginnen bij 70 V voor 20 min naar de eiwitsteekproeven uit de stapelvolgorde gel het oplossen gel. Vervolgens, verhoging van de spanning tot 125 V voor ongeveer 70-120 min tot monsters en eiwit ladder het einde van de gel bereiken.
    3. Na voltooiing van elektroforese, overbrengen in de gel een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan met behulp van een natte electroblotting systeem. Transfer voor ~ 100 min bij 100 V. blok het membraan in de blokkeerbuffer 4% bovien serumalbumine (BSA) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur van rond de 25 ° C.
  10. Markeren de vlek door het snijden van het aan de kant met de moleculair-gewicht-ladder. Gebruik een transparante plastic folie en een scherpe schaar voor het knippen van de vlek. Bereiden van de oplossingen van de primaire-antilichaam (anti-tau op 1:5, 000; anti-phospho-tau op 1:4, 000) en de vlek in deze oplossing bij 4 ° C's nachts uit te broeden.
  11. Na een incubatieperiode van overnachting, de vlek voor 7 min viermaal in wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing-Tween-20 (PBST) oplossing.
  12. Bereiden de relevante secundaire-antilichaam-oplossingen (geit anti-konijn of anti-muis IgG bij 1:5, 000), en de vlek in deze oplossing gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur van ongeveer 25 ° C. Wash in PBST viermaal, 7 min elke uit te broeden.
  13. Ontwikkelen de vlek met behulp van een chemiluminescentie-kit volgens de fabrikant ' s aanbevelingen. Dekking van de vlek met behulp van een transparant plastic wrap. Verwerven van de beelden door een chemiluminescentie imaging systeem voor Chemoluminescentie met relevante software.

3. Fosfatase Assay

  1. de cel lysates (uit stap 2.5) met alkalische fosfatase behandelen in de buffer alkalische fosfatase.
    1. Voor zowel controle en behandelde monsters, bereiden 20 µL monsters met 20 µg totaal eiwit. Het volume van de cel lysates met 20 µg totaal eiwit, gevolgd door 2 µL alkalische fosfatase buffer en 10 µL alkalische fosfatase toevoegen. Voeg gedistilleerd water te halen 20 µL.
  2. De monsters bij 37 ° C te incuberen voor 1 h. Zet de reactie Stop door toevoeging van ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) aan een eindconcentratie van 50 mM, of door toevoeging van natrium orthovanadate (Na 3 VO 4) aan een eindconcentratie van 10 mM. De reactie kan ook worden gestopt door verwarming bij 75 ° C gedurende 5 min.
  3. Voordat de incubatie van monsters met fosfatase is voltooid, bereiden monsters van dezelfde concentratie zonder toevoeging van fosfatase voor vergelijking met monsters fosfatase-behandeld.
  4. Toevoegen de vers bereide 4 X SDS gel-laden buffer met 400 mM DTT.
  5. Broeden de monsters op een warmte blok bij 100 ° C gedurende 5 min. Mix de monsters met behulp van een vortex. Koel bij kamertemperatuur voor ~ 10-15 min.
  6. Monteren van een elektroforese systeem voor het uitvoeren van een 10%-polyacrylamidegel door SDS-PAGE.
    1. Belasting 10 µg eiwit (13 µL monster) per putje op een 10%-polyacrylamide gel. Laden van de moleculair-gewicht-ladder.
    2. Na het laden van het monster, de positieve en negatieve elektroden van de Elektroforese van het systeem aansluiten op een voedingsbron te handhaven van een constante spanning. Aanvankelijk, beginnen bij 70 V voor 20 min naar de eiwitsteekproeven uit de stapelvolgorde gel het oplossen gel. Vervolgens, verhoging van de spanning tot 125 V en de gel voor ongeveer 70-120 min lopen tot monsters en eiwit ladder het einde van de gel bereiken.
    3. Na voltooiing van elektroforese, overdracht van de gel op een PVDF-membraan met behulp van een natte electroblotting systeem. Transfer voor ~ 100 min bij 100 V.
    4. Markeren de vlek door het maken van een klein gesneden aan de kant van de moleculair-gewicht-ladder. Gebruik van een transparante plastic folie en een scherpe schaar voor het knippen van de vlek.
  7. Het membraan in 4% BSA blokkeerbuffer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur blokkeren.
  8. Broeden de vlek in primaire-antilichaam oplossing (anti-tau op 1:5, 000) bij 4 ° C's nachts. Wassen van de vlek in PBST viermaal, voor elke 7 min.
  9. Bereid de relevante secundaire-antilichaam-oplossing (geit-antimuis IgG bij 1:5, 000), en de vlek gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Wassen in PBST viermaal, voor elke 7 min.
  10. Ontwikkelen de vlek met behulp van een chemiluminescentie-kit volgens de fabrikant ' s aanbevelingen. Dekking van de vlek in een transparante plastic wrap. Verwerven van de beelden door een chemiluminescentie imaging systeem voor Chemoluminescentie met relevante software.

4. Microtubuli-bindende Assay

  1. voor de microtubuli-bindende assay, herhaal stap 2.1-2.6.
  2. Voorbereiden 1 X (2 mL) PEM buffer van 10 X PEM buffer opgeslagen bij 4 ° C door toevoeging van 20 µM (40 µL) paclitaxel en 1 mM (20 µL) GTP. Balans de microtubuli (MT) van − 80 ° C diepvries en de E. coli tau werken voorraad van − 20 ° C diepvriezer.
  3. Bereiden monsters volgens tabel 1.
  4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Ultracentrifuge bij 25 ° C gedurende 60 minuten op 100.000 x g.
  5. Transfer 120 µL van supernatant met unbound tau, schoon te maken en het label van buizen.
  6. Toevoegen 120 µL (hetzelfde volume als de bovendrijvende substantie) van 5 X genieten van buffer naar de pellet met afhankelijke tau en meng. Breng de oplossing om te reinigen van gelabelde buizen en meng zorgvuldig.
  7. Meten de eiwitconcentratie (zie stap 2.6).
    Nota: Terwijl de voorbereiding van monsters, het volume van de oplossing (stap 4.6) gebruikt voor de voorbereiding van zowel de pellet en supernatant monsters.
  8. Monsters van gelijkwaardige eiwitconcentratie bereiden en toevoegen van vers bereide 4 x SDS gel-laden buffer met DTT (400 mM).
    Opmerking: Monsters kunnen worden achtergelaten bij − 20 ° C in dit stadium.
  9. Herhaal stap 3.5-3.10.
< td colspan = " 2">
monster naam microtubulus nodig Main eiwit nodig PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-Control (6,21 μg/l) 2 l 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT 116-curcumine 10 μM (4.81 μg/l) 2 μl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-curcumine 20 μM (3,28 μg/µl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) 87.51 μl
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/l) 2 μl 18.42 μl (100 μg) 99.58 μl
5 E. coli tau 2 μl 1 μl tau-352 117 μl
6 MT alleen 2 μl X 118 μl
120 μl elke

tabel 1: Sample voorbereiding voor microtubuli-bindende assay.

5. lokalisatie en expressie van Tau na behandeling van cellen met curcumine

  1. een dekglaasje aan met behulp van 70% ethanol schoon en droog zijn met behulp van een laboratorium weefsel. Plaats een interne dekglaasje aan in elk putje van de plaat van een gelabelde 6-well-weefselkweek. Plaats de plaat op een biologische veiligheid kabinet en overschakelen op een UV-licht voor ten minste 3 h.
  2. Subcultuur de cellen en zaad ze in de relevante putjes van de plaat 6-well op 2.5 x 10 5 cellen/well aanbevolen kweekmedium.
  3. Na ~ 24 h, onderzoeken de cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop met behulp van zowel de 10 X en 40 X doelstellingen om te controleren voor cellulaire morfologische veranderingen. Foto's opnemen indien nodig.
  4. Spoel de cellen tweemaal met PBS. Bevestigen van de cellen in 3,7% formaldehyde in een incubator 37 ° C in het donker.
    Opmerking: Fixatie door formaldehyde bij kamertemperatuur werkt goed, ook. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen bij hantering van formaldehyde.
  5. Wassen de cellen in PBS. Repareren van cellen in ijskoude methanol op − 20 ° C gedurende 15 min. Permeabilize de cellen door ze aan het broeden in 3% BSA en 0,1% wassen Triton X-100 in PBS op ijs voor 10 min. de cellen met PBS.
  6. Incubeer de cellen in de blokkeerbuffer (3% BSA en 0,1% Tween-20 in PBS oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Incubatie gedurende 2 uur bij 4 ° C werkt goed, ook.
  7. Bereid de oplossing van de primaire-antilichaam (anti-tau op 1:200) in 3% BSA en 0,1% Tween-20 in PBS (b.v., 2 µL tau-13 antilichaam in 0.4 mL buffer).
  8. Knippen van kleine stukjes van een PVDF membraan zodat de stukjes passen goed binnen elk putje van de plaat 6-well; geniet ze in water gedurende 5 min. plaats de cut PVDF in elk putje.
  9. Toevoegen 60 µL van primair antilichaam oplossing naar de cut PVDF stukken in elk putje. Plaats de coverslips zodanig dat de cellen kunnen het aanraken van de primaire-antilichaam-oplossing. Bij 4 ° C in een donkere, vochtige kamer na een nacht bebroeden. Wassen in PBS viermaal.
  10. Bereid de middelbare-antilichaam-oplossing (fluoresceïne-geconjugeerde 594-antimuis IgG op 1:400) in 3% BSA en 0,1% Tween-20 in PBS.
  11. Knippen van kleine stukjes van een membraan PVDF, zodat de stukken behoorlijk binnen elk putje van de plaat 6-well passen, en hen te in water gedurende 5 minuten plaats de cut PVDF in elk putje weken.
  12. Toevoegen 80 µL van de middelbare-antilichaam-oplossing aan elk van de PVDF stukken in de 6-well-plaat. Plaats het dekglaasje aan zodat de cellen de middelbare-antilichaam-oplossing raken kunnen. Incubeer in een donkere, vochtige ruimte bij kamertemperatuur voor 2 h. wassen met PBS viermaal.
  13. Monteren van monsters in het medium van de montage met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en bevestig de coverslips op glas dia.
    1. Toevoegen een daling van het medium van de montage met DAPI op glas dia's. Verwijder de coverslips uit elk putje en leg ze op de glazen dia's met de montage medium met DAPI. Zorg ervoor dat het oppervlak van elke dekglaasje aan met gekleurde cellen de moun aanraaktting medium op de overeenkomstige glasplaatje.
    2. Toepassen nagel Pools rondom elke dekglaasje aan zegel en deze oplossen luchtdicht op de dia's van glas. Indien nodig doen deze stap tweemaal.
  14. Incubate gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur in een donkere kamer.
  15. Onderzoeken van de dia's met behulp van een confocal microscoop door gebruik van immersie-olie op het dekglaasje aan in een donkere kamer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitdrukking van totale tau en phospho-tau werd onderzocht na behandeling van de cellen met verschillende concentraties curcumine of LiCl (Figuur 1). Behandeling van de cellen met de drie verschillende concentraties curcumine daalde tau expressie niveaus; phospho-tau expressie steeg op een behandeling met lage concentratie van curcumine maar daalde op het behandelen van cellen met hogere concentraties curcumine. Anti-phospho-tau (Ser396) werd gebruikt voor de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript opgericht verschillende procedurele voorwaarden voor het opsporen van totale tau en phosphorylated tau in colorectal kankercellen behandeld met curcumine en LiCl. Om te beoordelen van de algehele status van de fosforylatie van tau in EiwitSteekproeven, werd een fosfatase assay beschreven. Deze test kan potentieel te onderzoeken van de status van de fosforylatie van een eiwit worden gebruikt.

Deze test is gebaseerd op het beginsel dat phosphorylated eiwit beweegt trager dan de ni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij niets hebben te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd uitgevoerd als onderdeel van het project getiteld 'Ontwikkeling en industrialisatie van hoge waarde cosmetische grondstoffen uit mariene microalgen', gefinancierd door het ministerie van oceanen en visserij, Korea, en werd gesteund door een intramurale grant (2Z04930) van KIST Gangneung Instituut van natuurlijke producten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Bewaar bij -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Opslagtemperatuur 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Opslagtemperatuur 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Opslagtemperatuur 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Bewaar bij 4 °C (uitgedroogd)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Bewaar bij 4 °C in het donker
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Bewaar bij -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Bewaar bij 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Bewaar bij kamertemperatuur
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Bewaar bij -20 °C
PMSFSigmaP7626Bewaar bij kamertemperatuur
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Bewaar bij 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Bewaar bij 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Opslagtemperatuur 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Bewaar bij -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Bewaar bij ongeveer 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Bewaar bij 4 °C in het donker
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Bewaar bij 4 °C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tau fosforyleringTau lokalisatieconfocale microscopieWestern blotfosfatasestestimmunohistochemiebehandeling met curcuminelithiumchloride

Gerelateerde artikelen