Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Samenvatting

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Samenvatting

De optimale chromosomale stand(en) van een bepaald DNA element was/waren vastbesloten door transposon-gemedieerde willekeurige opneming gevolgd door fitness selectie. Bij bacteriën kunnen de gevolgen van de genetische context op de functie van een genetische element moeilijk te beoordelen zijn. Verschillende mechanismen, met inbegrip van topologische effecten, transcriptionele storing door naburige genen, en/of Replicatie-geassocieerde gene dosering, kunnen invloed hebben op de functie van een bepaalde genetische element. Hier beschrijven we een methode waarmee de willekeurige integratie van een DNA-element in het chromosoom van Escherichia coli en selecteer de meest gunstige locaties met behulp van een eenvoudige groei competitie experimenteren. De methode maakt gebruik van een goed beschreven transposon gebaseerde systeem van willekeurige toevoeging, in combinatie met een selectie van de sterkste clone(s) door groei voordeel, een procedure die is gemakkelijk instelbaar tot experimentele behoeften. De aard van de sterkste clone(s) kan worden bepaald door geheel-genoom sequentiebepaling van een complexe multi klonale populatie of door eenvoudig gen lopen voor de snelle identificatie van geselecteerde klonen. Hier, werd de niet-coderende DNA regio DARS2, die controles van de inleiding van chromosoom replicatie in E. coli, gebruikt als een voorbeeld. De functie van DARS2 is bekend worden beïnvloed door replicatie-geassocieerde gene dosering; de dichter DARS2 krijgt naar de oorsprong van DNA replicatie, Hoe actiever wordt. DARS2 was willekeurig ingevoegd op het chromosoom van een DARS2-stam verwijderd. De resulterende klonen met individuele invoegingen werden gebundeld en streden tegen elkaar voor honderden generaties. Ten slotte waren de sterkste klonen gekenmerkt en blijken te bevatten DARS2 ingevoegd in de nabijheid van de locatie van de oorspronkelijke DARS2 .

Inleiding

De functie van een genetische element kan worden beïnvloed door de locatie in het genoom. In bacteriën resulteert dit voornamelijk van inmenging door de transcriptie van naburige genen, de lokale DNA topologie, en/of de replicatie-geassocieerde gene dosering. In het bijzonder de processen van DNA-replicatie en segregatie worden gecontroleerd, ten minste gedeeltelijk, door niet-coderende chromosomale regio¹, en de werking van deze regio's hangt af van genomic locatie/context. In E.coli, voorbeelden zijn de dif -site, vereist voor zuster chromosoom resolutie²; KOPS sequenties, vereist voor³van de segregatie van chromosomen; en gegevens, DARS1en DARS2 regio's, nodig zijn voor de controle van de juiste chromosomale replicatie (hieronder; ⁴). presenteren we een methode waardoor de willekeurige bedrijfsverplaatsingen, selectie en bepaling van de optimale genetische context van een bepaalde genetische element, hier wordt geïllustreerd door de studie van de DARS2 niet-coderende regio.

In E. coli, DnaA is de initiatiefnemer eiwit verantwoordelijk voor opening om de interne replicatie oorsprongoriCbundel van DNA, en voor de aanwerving van de helicase DnaB^5,6,7. DnaA behoort tot de AAA⁺ (dat wil zeggen, ATPasen die is gekoppeld aan diverse activiteiten) eiwitten en zowel ATP en ADP kunt binden met een vergelijkbaar hoge affiniteiten⁵. Het niveau van DnaA^ATP pieken op inleiding⁸, waar DnaA^ATP vormt een multimer op oriC dat DNA dubbelzijdig opening⁹triggers. Na de inleiding, oriC tijdelijk niet beschikbaar voor opnieuw starten als gevolg van de sekwestratie is gemaakt door een mechanisme waarbij de binding van het eiwit SeqA te hemimethylated oriC^10,11. Tijdens sekwester, het niveau van DnaA^ATP wordt verminderd met ten minste twee mechanismen: de regelgevende inactivering van DnaA (RIDA)^12,13 en gegevens-afhankelijke DnaA^ATP hydrolyse (DDAH)^{14 ,15}. Zowel RIDA en DDAH bevordering van de omschakeling van DnaA^ATP te DnaA^ADP. Voorafgaand aan een nieuwe ronde van inleiding, DnaA^ADP is opnieuw geactiveerd te DnaA^ATP op specifieke opeenvolgingen van het DnaA-reactiveren (DARS): DARS1 en DARS2^16,17. De chromosomale gegevens, DARS1,en DARS2 regio's zijn niet-coderende en handelen op een chaperone-achtige wijze te moduleren DnaA^ATP/DnaA^ADP interconversion. Deze gebieden, gelegen buiten de oorsprong van replicatie inschakelen de vergadering van een complexe DnaA voor hetzij de inactivering (gegevens; ¹⁴) of activering (DARS1 en DARS2; ¹⁷) van DnaA. Verwijderen van DARS2 in een cel verandert niet massa verdubbeling tijd maar resultaten van asynchrone replicatie initiatie^15,16,18. Echter DARS2-deficiënte cellen hebben een fitness kosten ten opzichte van een anders isogene wildtype tijdens de wedstrijd van beide continue groei in rijke medium of tijdens de totstandbrenging van kolonisatie van de darm van muis¹⁸. Dit geeft aan dat zelfs kleine veranderingen in de concentratie van de asynchrony/oorsprong een negatief effect hebben op bacteriële fitness. In E. coliis er een selectieve druk om het handhaven van chromosoom symmetrie (dat wil zeggen, twee bijna gelijke lengte replicatie arms)¹⁹. De gegevens, DARS1en DARS2 regio's hebben de dezelfde relatieve afstand tot oriC in alle E. coli stammen sequenced¹⁸, ondanks de grote verschillen in de grootte van het chromosoom.

Hier, gebruiken we de DARS2 regio van E. coli als voorbeeld voor de identificatie van de chromosomale stand(en) optimaal functioneren. DARS2 werd ingevoegd in de NKBOR transposon, en de resulterende NKBOR::DARS2 transposon vervolgens willekeurig ingevoegd in het genoom van MG1655 ΔDARS2. Wij aldus opgewekte een verzameling cellen, elk bezit DARS2 geplaatst op een andere locatie op het chromosoom. Een in vitro competitie experiment, waar alle cellen in de collectie waren gebundeld en streden tegen elkaar tijdens de continue groei in LB voor een geschatte 700 generaties, werd uitgevoerd. De uitkomst van het experiment van de competitie werd gecontroleerd/bepaald met behulp van zuidelijke vlek gemakkelijk gene wandelen en geheel-genoom sequencing (WGS; Figuur 1). Eindpunt klonen opgelost door eenvoudig gene lopen werden gekenmerkt door stroom cytometry te evalueren van de celcyclus parameters. In een flow cytometrische analyse, kunnen celgrootte, DNA-inhoud en inleiding synchrony worden gemeten voor een groot aantal cellen. Tijdens stroom cytometry, loopt een stroom van afzonderlijke cellen een lichtstraal van de juiste golflengte te prikkelen de gebeitst DNA, die wordt vervolgens tegelijkertijd geregistreerd door photomultipliers die het verzamelen van de uitgestoten fluorescentie, een maatregel van DNA de inhoud, mits de cellen zijn gekleurd voor DNA. De forward-strooilicht is een maatregel van cel massa²⁰.

De in vitro competitie experiment we hier presenteren wordt gebruikt om kwesties met betrekking tot het belang van de chromosomale positie en genomische context van de genetische element. De methode is onbevooroordeeld en makkelijk te gebruiken.

Protocol

1. collectie van de bibliotheek van Transposon

Opmerking: de chromosomale locus van DARS2 werd gekloond in de mini Tn 10-op basis van transposon, NKBOR (op pNKBOR) ²¹, wat resulteert in NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR kan worden verkregen online ²². pNKBOR is een R6K gebaseerde zelfmoord vector die de initiatiefnemer eiwit π voor replicatie ²³ vereist. Plasmide pJFM1 daarom kan repliceren in een stam met E. coli (bijvoorbeeld Dh5α λ pir) met een chromosomale kopie van de pir-gen. Echter, wanneer de pJFM1 wordt omgezet in de Pir-deficiënte wildtype MG1655, pJFM1 niet repliceren, leidt tot de keuze van kanamycine-resistente klonen gegenereerd door de willekeurige inlassingen uit NKBOR:: DARS2 in het bacteriële chromosoom. Voor eenvoud, worden deze aangeduid als DARS2 invoegingen. Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de methodologie.

1. Voorbereiden electrocompetent MG1655 Δ DARS2 van de actief groeiende cellen in lysogenie Bouillon (LB) gekweekt bij 37 ° C ²⁴.
2. Electroporate pJFM1 in electrocompetent MG1655 Δ DARS2, volgens Gonzales et al. ²⁴
   1. pJFM1 (in 1 µL van water) tot 40 µg add 1 µL van E. coli MG1655 electrocompetent Δ DARS2 en dit mengsel overbrengen in een cuvet vooraf gekoeld, steriele 0,2 cm tussenruimte. De cuvette invoegen de electroporation kamer. Electroporate op 18 kV, 500 Ω en 25 µF; De tijdconstante moet ~5.0 ms, en geen vonken plaatsvinden.
   2. De bacteriële suspensie snel te herstellen door het resuspending in 1 mL voorverwarmde de pond-Bouillon en overdracht aan een test tube van 15 mL.
   3. Laat de cellen herstellen door omstandigheden waaraan koolzuurgas is toegevoegd groei bij 37 ° C gedurende 30 minuten, zonder antibiotica selectie aan het broeden. Plaat van de bacteriën op LB agar platen aangevuld met 50µg/mL kanamycine en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
3. De kolonies van de electroporation tellen: één kolonie wordt beschouwd als gelijk aan één chromosomale transposon invoeging.
   Opmerking: Kolonies kunnen worden geteld door oog of met een Kolonieteller. Het aantal kolonies is omgekeerd evenredig aan de gemiddelde afstand tussen de transposons gelegen in het chromosoom van elke kloon.
4. Add 1 mL van de pond-Bouillon aan elke plaat en wassen van alle kolonies; 1 mL van de pond-Bouillon moet voldoende zijn om te afwassen ~ 100.000 kolonies. Hergebruik de dezelfde 1 mL van de pond-Bouillon toe de bacteriële concentratie. Bundelen alle kolonies in de dezelfde tube van 50 mL.
5. Vortex de buis en het bevriezen van de start-materiaal (t = 0). Om te bevriezen, meng 1 mL celsuspensie met 1 mL 50% glycerol op ijs. Overdracht van de buizen om droog ijs gedurende 10 minuten. Zodra de culturen zijn bevroren, overbrengen naar een vriezer-80 ° C.
   Opmerking: De concentratie van een cel van een minimum van 50.000 CFU/mL wordt verwacht bij deze stap.

2. Competitie Experiment in LB

1. dooi de transposon bibliotheek van-80 ° C op ijs. Meng door pipetteren.
2. Transfer 100 µL van de bibliotheek van transposon tot 10 mL voor LB in een reageerbuis 15 mL.
3. Groeien de cellen, belucht door continue schudden (250 rpm), gedurende 8 uur bij 37 ° C tot stationaire fase (dat wil zeggen, OD ₆₀₀ = ~ 4.0). Deze parameters aan verschillende groei omstandigheden, desgewenst aanpassen.
4. De bacteriële bevolking door continue overdrachten in verse voorverwarmde medium elke ~ 10 generaties worden doorgegeven. Dit doen door overdracht van 10 µL van de vorige stationaire fase cultuur tot 10 mL van de verse LB en in toenemende mate van een andere 8 h aan de stationaire fase (dat wil zeggen, OD ₆₀₀ = ~ 4.0).
   Opmerking: Als de optische dichtheid van begin- en einddatum gelijk zijn, een 1,000-fold verdunning komt overeen met ~ 10 generaties groei (2 ¹⁰ = 1024). De bacteriële bevolking kan worden rechtstreeks in verse voorverwarmde medium doorgegeven of opgeslagen op 0-4 ° C (op ijs) en de volgende dag doorgegeven. LB werd hier gebruikt om zo veel cellulaire verdubbelingen in zo kort mogelijk (een verdubbeling keer dicht bij 22 min).
5. Na elke 100 generaties van concurrentie, slaan vijf 1-mL monsters bij-80 ° C (zoals beschreven in stap 3.3).
6. Als de fitness verschillen tussen cellen met individuele transposon invoegingen zijn naar verwachting zal kleine, houden de duur van wedstrijd lang; hier, 700 generaties (t = 700) dienden.

3. Zuidelijke vlek analyse om te controleren de concurrentie Experiment Over tijd

1. bereiden de sonde voor de zuidelijke vlek (1-kb sectie van de NKBOR) door het uitvoeren van de polymerase-kettingreactie (PCR) versterking met behulp van specifieke primers: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat en NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
   1. Incubate bij 98 ° C gedurende 30 s voor eerste denaturatie. Voer vervolgens 35 cycli bij 98 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 45 s. Gebruiken voor de laatste uitbreiding, 72 ° C gedurende 10 minuten
      Opmerking: De sjabloon voor de PCR reactie was een gezuiverde pNKBOR plasmide ²¹.
   2. Het resulterende PCR fragment van een label met [α - 32P] dATP via het systeem willekeurig primer volgens Smith ²⁵.
2. De totale cellulaire DNA volgens Løbner-Olesen en von Freiesleben ²⁶ voorbereiden op t = 0 en geselecteerde tijdstippen tot t = 700 generaties van concurrentie geschat.
3. Verteren het totale cellulaire DNA met Pvu ik, die snijdt de NKBOR met de regio van belang eens alleen in een regio niet door de sonde gedekt; 1 eenheid van Pvu ik kan worden gebruikt om volledig digest 1 µg substraat DNA.
   Opmerking: De sonde zal herkennen fragmenten waarop een deel van de transposon, samen met de chromosomale DNA van verschillende lengtes, afhankelijk van de plaats van de invoegpositie.
4. Uitvoeren van een zuidelijke vlek met behulp van een 0,7% agarose gel volgens Løbner-Olesen en von Freiesleben ²⁶.

4. Identificatie van de sterkste klonen

1. Gebruik gemakkelijk gene wandelen, zoals beschreven door Harrison et al. ²⁷, DARS2 inbrengen sites van enkele klonen (geïsoleerd op LB platen) identificeren na 700 geschatte generaties van concurrentie; de meer bands op de Southern blot, de meer isolaten zijn nodig ter dekking van alle transposon invoegingen.
   1. Isolaat genomic DNA voor PCR sjabloon. Verspreiden bacteriën op een LB agarplaat met 50 µg Mo/mL kanamycine en Incubeer bij 37 ° C's nachts. Groeien enkele kolonies 's nachts in de pond-Bouillon bij 37 ° C en daarna Pipetteer 20 µL in 200 µL van gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water (of gebruik van DNA zuivering, zoals in stap 3.2).
      1. Vortex te mengen. Verwarm de mix bij 100 ° C voor 10 min en centrifugeer bij max snelheid gedurende 5 min. de cel lysate bij-20 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
   2. Ontwerp van de drie genestelde inleidingen te ontharden binnen het transposon van keuze (Zie Figuur 2 voor een grafische weergave van de PCR-strategie).
      Opmerking: Ontwerpen van inleidingen genest moet ervoor zorgen dat genest Primer 3 dichtst bij de bekende 5 ligt ' einde van het transposon DNA, gevolgd door geneste inleidingen 2 en 1. De afstand tussen geneste Primer 3 en de 5 ' einde van het bekende transposon DNA moet voldoende zijn voor een read-through van de reeks van het bekende DNA tot het onbekende DNA (de specifieke chromosomale transposon inbrengen om site te vinden). Voor NKBOR de volgende genestelde inleidingen werden gebruikt: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, en pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Willekeurige inleidingen met de sites van de erkenning van bekende restrictie-enzymen worden ook gebruikt. Om ervoor te zorgen een resultaat, moet men gebruik maken van ten minste twee verschillende willekeurige inleidingen. De beperkingsplaatsen voor de restrictie-enzymen (e.g.,Sau 3AI en Hin terugmatch) moeten worden gevestigd op de 3 ' beëindigen en voorafgegaan door tien willekeurige basen dus dat 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' en 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' zijn de inleidingen met een Sau 3AI site (GATC) en een Hin terugmatch site (AAGCTT), respectievelijk, waar N = A, T, G en C.
   3. Gebruik 200 ng van genomic DNA in een 20 µL PCR reactie. Incubeer bij 98 ° C gedurende 30 s voor de eerste denaturatie. Uitvoeren van 25 cycli bij 98 ° C voor 30 s, 50 ° C gedurende 15 s, en 72 ° C gedurende 4 minuten. Voor de laatste uitbreiding, 72 ° C te gebruiken voor 10 min. gebruik primerparen bestaande uit genest Primer 1 en een van de willekeurige inleidingen.
   4. Primerparen bestaande uit genest Primer 2 en de dezelfde willekeurige primer van de tweede versterking, waarbij 1 µL van haar eerdere reactie als sjabloon gebruiken.
   5. Herhaal stap 4.1.4 met bestaande uit genest Primer 3 en de dezelfde willekeurige primer primerparen.
   6. Voer de producten uit de laatste PCR-reactie op een 1,5% agarose gel en de vlek met ethidiumbromide. Knip uit een band in het bereik 100-800 bp en isoleren van het DNA met behulp van een commerciële DNA-gel uitpakken kit volgens de fabrikant ' s richting. Resuspendeer de DNA in 15 µL water.
      Opmerking: Let op. Ethidiumbromide is giftig en moeten met zorg worden behandeld.
   7. Sequentie van de band in de vorige stap (stap 4.1.6), met geneste Primer 3 geïsoleerd als de sequencing primer, met behulp van Sanger sequencing bij een commerciële leverancier.
2. Uitvoeren WGS.
   1. Uitvoeren op de totale DNA geëxtraheerd uit WGS geselecteerd monsters verzameld tijdens het experiment van de concurrentie, zoals beschreven door Frimodt-Møller et al. ⁴.
3. Sequencing analyses uit te voeren.
   1. Uitlijnen gekoppeld-einde leest tot 150 Ns grenzen aan NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2,204 Bowtie2 ²⁸ met een interval tussen zaad subtekenreeksen (S, 1, 1.15) en een maximum aantal onduidelijke tekens (L, 0, 0.9).
   2. Selecteer de uitgelijnde leest en vervolgens opnieuw uitlijnen op beide MG1655 ref | NC_000913.3 en NKBOR gb | AF310136 met behulp van blastN ²⁹
   3. toewijzen omzetting invoeging posities bij kruisingen MG1655-NKBOR.

5. Stroom Cytometry

1. verzamelen van monsters voor stroom cytometry.
   1. Evenwicht, elke cultuur door het behoud van het in de fase van de exponentiële groei van ten minste 10 generaties. De OD-₆₀₀ controleren en ervoor te zorgen dat het nooit hoger is dan 0,3.
   2. Twee soorten stroom monsters verzamelen.
      1. Voor RIF-uitloop, breng 1 mL van de cultuur een tube van 15 mL met 30 µL van de RIF-CEF (300 µg/mL rifampicine en 36 µg/mL cephalexin opgelost in 12,5 mM NaOH). Laat het bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur schudden.
         Opmerking: Rifampicine niet indirect blokkeert de inleiding van chromosoom replicatie terwijl u voor lopende rondes van de replicatie tot beëindiging zou blijven. Cephalexin voorkomt celdeling, waardoor slijtage van de replicatie (RIF-uitloop) en de accumulatie van cellen met volledig gerepliceerde chromosomen. Het aantal volledig gerepliceerde chromosomen is gelijk aan het aantal oorsprong ten tijde van de behandeling met rifampicine en cephalexin ²⁰.
      2. Voor de EXP-steekproef, overdracht 1 mL van de exponentieel groeiende cultuur tot een 1.5-mL koker op ice.
2. De cellen als volgt oplossen. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. resuspendeer de pellet in 100 µL van de ijskoude 10 mM Tris pH 7.5 en voeg 1 mL ijskoud 77% ethanol. Bewaren van de monsters bij 4 ° C tot gebruik.
3. Vlek de cellen als volgt. Oogsten van 100-300 µL van vaste cellen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant en resuspendeer de pellet in 130 µL van " DNA kleuring oplossing " (90 µg/mL mithramycin, 20 µg Mo/mL ethidiumbromide, 10 mM MgCl ₂ en 10 mM Tris pH 7.5). Zet de monsters op ijs en in het donker; de monsters zijn klaar voor stroom cytometry analyse na 10 min.
   Opmerking: Andere DNA vlekken dan ethidiumbromide en mithramycin kunnen ook gebruikte ^{30 , 31}.
4. Bepalen van de oorsprong per cel, de relatieve cel-massa en de relatieve inhoud van DNA door stroom cytometry analyse.
   1. Uitvoeren stroom cytometry, zoals eerder beschreven ³². RIF-uitloop en EXP-monsters met behulp van de stroom cytometer fabrikant uitvoeren ' s instructies . Gebruik van excitatie golflengten 395 en 440 nm voor mithramycin- en ethidium bromide gebeitste cellen, en verzamelen de fluorescentie boven 565 nm.
      1. Te bepalen van de relatieve inhoud van cel massa en relatieve DNA, lopen de EXP-monsters om één-parameter vooruit-licht scatter versus cel nummer histogrammen en intensiteit van de fluorescentie versus cel nummer histogrammen voor een minimum van 30.000 gebeurtenissen te verkrijgen overeenkomt met de cel signaal.
      2. Gebruik voorwaartse-verstrooid single-parameter lichtverdeling te meten van de gemiddelde relatieve cel mass.
         Opmerking: Voorwaartse-verstrooid licht is een maat voor de gemiddelde cel massa ²⁰.
      3. Gebruik fluorescentie intensiteit single-parameter distributies voor het meten van de gemiddelde DNA inhoud ²⁰.
      4. Verkrijgen van de DNA-concentratie als de verhouding van het gemiddelde gehalte aan DNA aan de gemiddelde cel massa ²⁰.
   2. Bepalen het aantal oorsprong per cel.
      1. Run RIF-uitloop monsters te verkrijgen van de intensiteit van de fluorescentie van de één-parameter versus cel nummer histogrammen voor een minimum van 30.000 gebeurtenissen die overeenkomt met de cel signaal.
      2. Gebruik fluorescentie intensiteit single-parameter uitkeringen aan het bepalen van het aantal chromosomen in elke cel ²⁰.
5. Berekenen de asynchrony index (Ai).
   1. Berekenen de Ai, zoals beschreven door Løbner-Olesen et al. ³², met behulp van de fluorescentie intensiteit enkele parameter distributies van de RIF-uitloop monsters en de formule Ai = (f3 + f5 f6 + f7) / (f2 + f4- + f8), waar fx is de cellen van de breuk met x aantal volledig gerepliceerde chromosomen. Inwijdingen wanneer asynchrone overwegen A > 0.1.

Resultaten

Een zuidelijke vlek werd gedaan om te verifiëren dat de DARS2 willekeurig was verspreid over het chromosoom in de bibliotheek van transposon (t = 0) en die het geschiktst klonen na verloop van tijd zou aanhouden. De zuidelijke vlek werd uitgevoerd op DNA geëxtraheerd uit het eerste transposon zwembad (op t = 0) en elke geschatte 100 uit 700 generaties van de concurrentie (Figuur 3). Hier, de totale cellulaire DNA van elk moment-punt werd verteerd met...

Discussie

De hier gebruikte methode maakt gebruik van state-of-the-art technieken een moeilijke vraag met betrekking tot de optimale genomic positie van een genetische element te beantwoorden. De willekeurige invoeging van het genetische element (gemedieerd door de transposon) maakt het snel en gemakkelijk collectie van duizenden klonen, die vervolgens kunnen worden aangebracht om te concurreren tegen elkaar te selecteren voor de optimale positie van het onderzochte genetische element (d.w.z. de sterkste kloon).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Autoclaved Mili-Q water		None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System	Bio-Rad	165-2100
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB Agar, powder (Lennox L agar)	Thermo Fisher Scientific	22700025
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc CryoTubes	Sigma-Aldrich	V7634
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32	Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2.0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
Sodium Chloride	Merck	6404
96% Ethanol	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
Phenol Ultra Pure	BRL	5509UA
Chloroform	Merck	2445
Ribonuclease A type II A	Sigma-Aldrich	R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS)	Merck	13760
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L 6876
Isopropanol	Sigma-Aldrich	405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	10106801001
PvuI (10 U/µL)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	433160
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	71687
Whatman 3MM papers	Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN119B
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F8016
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Sigma-Aldrich	85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute  PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Thermal Cycler	Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad
Rifampicin	Serva	34514.01
Cephalexin	Sigma-Aldrich	C4895
Mithramycin	Serva	29803.02
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	246964
Apogee A10 instrument	Apogee