Method Article

Zuivering van het membraan compartiment voor endoplasmatisch Reticulum-geassocieerde afbraak van exogene antigenen in Cross-presentatie

DOI:

10.3791/55949

⸱

August 21st, 2017

 ,  ,  , 
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van de cellulaire compartimenten waarin exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak in cross-presentatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) zijn zeer geschikt voor het verwerken en presenteren van verinnerlijkte exogene antigenen op grote comptabiliteit klasse (MHC) ik moleculen ook bekend als cross-presentatie (CP). CP speelt een belangrijke rol niet alleen in het stimuleren van de naïeve CD8+ T cellen en geheugen CD8+ T cellen voor besmettelijke en tumor immuniteit maar ook in de inactivering van self-acting naïef T cellen door T cel anergie of verwijdering van de T cel. Hoewel de kritische moleculair mechanisme van CP moet nog worden opgehelderd, accumuleren gegevens wijzen erop dat exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak (ERAD) na uitvoer van niet-klassieke endocytotische compartimenten. Tot voor kort waren karakterisaties voor deze endocytotische compartimenten beperkt omdat er geen specifieke moleculaire markers dan exogene antigenen. De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van deze endocytotische compartimenten. Met behulp van deze gezuiverde microsome, we gereconstitueerd de ERAD-achtige vervoer ubiquitination en de verwerking van de exogene antigeen in vitro, suggereren dat het systeem van de ubiquitin-proteasoom de exogene antigeen na uitvoer uit dit verwerkt cellulaire compartiment. Dit protocol kan verder worden toegepast op andere celtypes te verduidelijken van het moleculaire mechanisme van CP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MHC ik moleculen worden uitgedrukt op het oppervlak van alle genucleëerde cellen, met korte antigene peptiden afgeleid van endogene antigenen, die worden verwerkt door het systeem van de ubiquitin-proteasoom in het cytosol1. Na verwerking, worden antigene peptides vervoerd in het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER) door de peptide vervoerder TAP. In de ER lumen, een aantal specifieke chaperones helpen het peptide laden en de juiste vouwen van de MHC ik complexe. Deze serie van moleculen heet het peptide-laden complex (PLC), waarmee wordt aangegeven dat ER een centrale compartiment voor peptide laden op MHC ik2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. groeiende cellen en toevoeging van exogene antigenen

  1. voorbereiden bOVA met behulp van een Biotine-eiwit labeling kit na de fabrikant ' s-protocol.
    Opmerking: Normaal, bOVA bevat 2 M Biotine per 1 M eicellen gemiddeld.
  2. Groeien DC2.4 cellen in RPMI-1640 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat 0.1 mM niet-essentiële aminozuren, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) en 10% foetaal kalfsserum (hierna RPMI) bij 37 ° C in 5 % CO, 2 in een bevochtigde incubator (hierna zonder vermelding, cellen worden geïncubeerd op deze voorwaarde). Het is ook mogelijk om te gebruiken DMEM....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te verhelderen van het moleculaire mechanisme van CP, is het nodig vast te stellen van de cellulaire compartimenten, waar exogene antigenen ondergaan ERAD-achtige vervoer en verwerking. Terwijl waarnemingen door immunefluorescentie microscopie of door elektronenmicroscopie geïdentificeerd de cellulaire compartiment waar exogene antigenen16,17,18,1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eerdere studies van CP, de opgenomen exogene antigenen opgebouwd in de beperkte ruimte van de late endosome of ER door immunefluorescentie microscopie16,30,31,32. Geschat wordt dat ERAD-achtige vervoer en verwerking van exogene antigenen worden uitgevoerd in deze gespecialiseerde vakgebieden zoals de ER of late endosome, zoals de cellulaire compartiment werd ontdekt door sacharose of het geb.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het Takasaki Universiteit van gezondheid en welzijn.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetal bovine serumEquitech bioSFB30
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutaminegibco by life technologies25030-164
Penisicillin-Sreptomycingibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotin-protein labelling kitThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
lactacystinSIGMAL6785
Dounce homogenizerIUCHI131703
protease inhibitor cocktailsSIGMAP8340
iodixanolCosmo bio1114542
SA-magnetic beadsNew England Biolabs201270
control magnetic beadsChemagenM-PVA012
magnetic standBD Biosciences552311
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225
silver staining kitsCosmo bio423413
Reticulocyte LysatePromega1730714
Flag-tagged ubiquitinSIGMAU5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)MBLD058−3
anti-Flag (mouse)SIGMAF3165
trypsinSIGMA85450C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

Related Articles