Method Article

Zuivering van het membraan compartiment voor endoplasmatisch Reticulum-geassocieerde afbraak van exogene antigenen in Cross-presentatie

DOI:

10.3791/55949

⸱

August 21st, 2017

 ,  ,  , 
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van de cellulaire compartimenten waarin exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak in cross-presentatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) zijn zeer geschikt voor het verwerken en presenteren van verinnerlijkte exogene antigenen op grote comptabiliteit klasse (MHC) ik moleculen ook bekend als cross-presentatie (CP). CP speelt een belangrijke rol niet alleen in het stimuleren van de naïeve CD8+ T cellen en geheugen CD8+ T cellen voor besmettelijke en tumor immuniteit maar ook in de inactivering van self-acting naïef T cellen door T cel anergie of verwijdering van de T cel. Hoewel de kritische moleculair mechanisme van CP moet nog worden opgehelderd, accumuleren gegevens wijzen erop dat exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak (ERAD) na uitvoer van niet-klassieke endocytotische compartimenten. Tot voor kort waren karakterisaties voor deze endocytotische compartimenten beperkt omdat er geen specifieke moleculaire markers dan exogene antigenen. De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van deze endocytotische compartimenten. Met behulp van deze gezuiverde microsome, we gereconstitueerd de ERAD-achtige vervoer ubiquitination en de verwerking van de exogene antigeen in vitro, suggereren dat het systeem van de ubiquitin-proteasoom de exogene antigeen na uitvoer uit dit verwerkt cellulaire compartiment. Dit protocol kan verder worden toegepast op andere celtypes te verduidelijken van het moleculaire mechanisme van CP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MHC ik moleculen worden uitgedrukt op het oppervlak van alle genucleëerde cellen, met korte antigene peptiden afgeleid van endogene antigenen, die worden verwerkt door het systeem van de ubiquitin-proteasoom in het cytosol1. Na verwerking, worden antigene peptides vervoerd in het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER) door de peptide vervoerder TAP. In de ER lumen, een aantal specifieke chaperones helpen het peptide laden en de juiste vouwen van de MHC ik complexe. Deze serie van moleculen heet het peptide-laden complex (PLC), waarmee wordt aangegeven dat ER een centrale compartiment voor peptide laden op MHC ik2. Na peptide laden, het MHC ik moleculen naar het celoppervlak worden vervoerd en een sleutelrol spelen in het adaptieve immuunsysteem als zelfstandige markeringen, en stelt de CD8+ cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) kankercellen of infectieuze agentia op te sporen door antigene peptiden van niet-zelf eiwitten3.

Antigeen presentatie van cellen (APC), antigene peptiden van exogene antigenen ook in zijn gepresenteerd op MHC ik4,5,6,7,8 via CP, die voornamelijk wordt uitgevoerd door DCs9,10,11. CP is essentieel zowel voor de activering van naïeve CD8+ T cellen en geheugen CD8+ T cellen in anti-infectieuze en anti-tumoral CTL's12,13, en in het onderhoud van immuun tolerantie door het inactiveren van zelf waarnemend naïef T cellen14,15. De CP speelt veel belangrijke rollen in het adaptieve immuunsysteem, maar de moleculaire mechanismen van CP nog moeten in detail worden beschreven. Eerdere studies van CP bleek dat exogene antigenen waren gelokaliseerd, zowel in de ER en de endosome en werden verwerkt door ERAD, suggereren dat exogene antigenen van de endosome worden vervoerd naar de ER voor ERAD-achtige verwerking en peptide laden16 . Accumuleren bewijsmateriaal blijkt evenwel dat het laden van de peptide van CP wordt uitgevoerd niet in het ER maar in niet-klassieke endocytotische compartimenten, die ook kenmerken van de ER (Figuur 1)17,18 hebben ,19,20,21. Voorkom aantasting van de voorlopers van de antigene peptide door de hoge activiteit van aminopeptidase22 in het cytosol, de verwerking en de peptide laden in CP treedt op in het proximale gebied voor deze niet-klassieke endocytotische compartimenten (Figuur 1). Hoewel de karakteristieken van deze endocytotische compartimenten controversieel zijn, zijn er geen bestaande specifieke moleculen dan exogene antigenen in dit compartiment.

ERAD is een cellulaire traject, waarbij specifiek misfolded eiwitten uit de ER wordt verwijderd. In het traject ERAD zijn misfolded eiwitten retrogradely via het membraan ER naar het cytoplasma getransporteerd en verwerkt door de ubiquitin-proteasoom systeem23,24,25. Wanneer grote moleculen, zoals eiwitten, worden vervoerd via de lipide dubbelgelaagde, deze moleculen passeren aan een moleculaire apparaat genaamd een translocon, zoals het Sec61 complex, Derlin complex in de ER26, en de complexe Tom en Tim complex in de mitochondriën27. Wanneer exogenously toegevoegde antigenen via het ER membraan worden getransporteerd, moeten zij de lipide dubbelgelaagde in complex met translocons, zoals het Sec61-complex doordringen. De hier beschreven methode gezuiverd de gerichte blaasje door gebruik te maken van deze membraan-penetrating moleculen als markers voor de endocytotische compartimenten.

De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel zuivering protocol met behulp van de DC-achtige cel lijn DC2.428 en biotinyleerd ovoalbumine (bOVA) als een exogene antigeen. De endocytotische compartimenten werden gezuiverd door daar (SA)-magnetische kralen met behulp van de membraan-penetrating bOVA als een maker. In deze gezuiverde microsome, enkele exogenously toegevoegd bOVA was nog steeds bewaard in het membraan breuken maar werden vervoerd naar de buitenkant van de microsome, en dan ubiquitinated en verwerkt in vitro29. Deze gezuiverde microsome gegevens opgenomen, niet alleen de endocytotische compartiment-specifieke eiwitten, maar ook ER-ingezeten eiwitten voor ERAD en de peptide laden complex; suggereert dat het cellulaire compartiment het potentiële endocytotische compartiment voor CP29 is. Dit protocol is niet afhankelijk van het soort exogene antigenen, en geldt ook voor andere deelverzamelingen van DC en andere celtypen, zoals macrofagen, B-cellen en endotheliale cellen, ter verduidelijking van de precieze moleculair mechanisme van DCs voor bedreven CP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. groeiende cellen en toevoeging van exogene antigenen

  1. voorbereiden bOVA met behulp van een Biotine-eiwit labeling kit na de fabrikant ' s-protocol.
    Opmerking: Normaal, bOVA bevat 2 M Biotine per 1 M eicellen gemiddeld.
  2. Groeien DC2.4 cellen in RPMI-1640 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat 0.1 mM niet-essentiële aminozuren, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) en 10% foetaal kalfsserum (hierna RPMI) bij 37 ° C in 5 % CO, 2 in een bevochtigde incubator (hierna zonder vermelding, cellen worden geïncubeerd op deze voorwaarde). Het is ook mogelijk om te gebruiken DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 3,7 g/L NaHCO 3 (hierna DMEM) in plaats van RPMI.
  3. Een dag voordat de zuivering, wordt de cellen splitsen in RPMI tot 1 x 10 5 cellen/mL in een weefselkweek plaat. Vermijd de cellen bij een confluente staat te houden. DC2.4 cellen kunnen zeer exogene antigenen te nemen tot een semi-confluente staat, maar snel de mogelijkheid kunt verliezen na het bereiken van een overmatige heuvels staat.
  4. Voor de DC2.4 cellen zijn semi-confluente, voeg toe 250 µg/mL bOVA voor 1 x 10 6 cellen/mL en incubeer gedurende 2-4 h.
    Opmerking: Tijdens de stroomafwaartse experimenten, alle buffers en reagentia worden bewaard bij 4 ° C tenzij anders aangegeven.

2. Voorbereiding van Microsomes

  1. de DC2.4 cellen te oogsten door zachte pipetteren van de plaat weefsel in een nieuwe conische tube van 50 mL.
  2. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C en verwijder voorzichtig het medium met bOVA door aspiratie.
  3. De DC2.4 cellen tweemaal met 40 mL PBS buffer (1.37 mM NaCl, 8.1 mM nb 2 HPO 4, 2.68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) door middel van centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C wassen en verwijder het supernatant telkens door aspiratie.
  4. Resuspendeer de pellet in stap 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 deel van kweekmedium) van homogenisering medium (0,25 M sacharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) met 1/1000 volume van protease inhibitor cocktails en overdracht van de geresuspendeerde DC2.4 cellen in een ijskoude Dounce homogenizer.
  5. Verstoren de geresuspendeerde DC2.4 cellen zachtjes door 10-20 slagen met de ijskoude Dounce-homogenizer.
    Opmerking: Tijdens de verstoring van de stap, de Dounce homogenizer wordt gekoeld op ice.
  6. De cel-verstoord schorsing overbrengen in een nieuwe conische tube van 15 mL.
  7. 8-9 mL homogenisering middellange tot 10 mL totaal toevoegen en centrifugeer de conische buis voor 10 min op 2.000 x g- en 4 ° C.
  8. Het supernatant overbrengen naar een nieuwe 15 mL conische buis ongebroken cellen en kernen te verwijderen, en centrifugeer de conische buis opnieuw gedurende 10 minuten op 2.000 x g en 4 ° C.
  9. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe ultracentrifugatie buis en centrifuge voor 45 min op 100.000 x g- en 4 ° C.
  10. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet zorgvuldig in 1-2 mL van homogenisering medium met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails door de oplossing op en neer meerdere malen te maken van een microsome breuk voor downstream experimenten pipetteren.
  11. De microsome-fractie overbrengen naar een nieuwe 5-mL ronde onderkant buis.
    Opmerking: Na deze stap, is het mogelijk om te verrijken van objectieve microsomes door iodixanol dichtheid kleurovergang centrifugeren volgens de fabrikant ' s protocol, bij het verwijderen van niet-specifieke microsomes. De piek breuken voor exogene antigenen worden verzameld en vervolgens onderworpen aan de volgende stap van zuivering (stap 3).

3. Zuivering van Microsomes met bOVA ondergaan ERAD

  1. toevoegen 1/100 volume van vers SA-magnetische kralen de microsome Fractie van stap 2.11 in de 5 mL ronde onderkant buis.
    Opmerking: Voordat u deze stap, is het mogelijk om vooraf duidelijk de microsome fractie door controle-magnetische kralen om vormen van verontreiniging van niet-specifieke microsomes.
  2. Voorzichtig meng goed en de ronde onderkant-buis langzaam gedurende 30 minuten draaien bij 4 ° C.
  3. 2-3 mL van homogenisering medium tot 4 mL totaal toevoegen in de ronde onderkant-buis en meng voorzichtig goed.
  4. De ronde onderkant-buis te plaatsen op een magnetische standaard en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Aangezien de kralen gebonden aan de blaasjes worden aangetrokken door de magneet, bruin micro-beads geleidelijk zal accumuleren naar de dichtst bij de magneet buiswand.
  5. Met de buis in de magnetische stand blijft zorgvuldig negeren het supernatant door aspiratie te verwijderen de niet-afhankelijke blaasjes.
  6. Wassen de magnetische kralen aan de blaasjes tweemaal met 5 mL van homogenisering medium door de magnetische gebonden staan gedurende 10 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant telkens door zorgvuldig aspiratie.
    Opmerking: Zonder de magnetische standaard, zuivering door centrifugations bij 2.000 x g gedurende 10 min, 4 ° C is ook beschikbaar.
  7. Resuspendeer de magnetische kralen gebonden aan de blaasjes zorgvuldig in 100 µL homogenisering medium de oplossing op en neer meermaals pipetteren.
  8. Breng de geresuspendeerde blaasjes in een nieuwe microtube als de gezuiverde microsome voor downstream experimenten.
    Opmerking: Doorgaans 50 µL microsome breuk met 5-20 µg eiwitten uit 1 x 10 7 cellen kan worden geïsoleerd.

4. Analyse van het gezuiverd Microsomes

  1. resuspendeer de magnetische kralen gebonden aan de blaasjes uit stap 3.8 voor 100-200 µL van TNE buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails in plaats van het medium homogenisering.
  2. Van stap 4.1 de lysate overbrengen naar een nieuwe 1.5-mL microtube.
  3. Bepalen de eiwitconcentratie van stap 4.2 met behulp van een BCA assay kit per de fabrikant ' s-protocol.
    Opmerking: 5-10 µL lysate uit stap 4.2 is meestal genoeg om het bepalen van de eiwitconcentratie.
  4. Van stap 4.2 (2 µg van eiwitten voor de zilveren kleuring en 10 µg van eiwitten voor het westelijke bevlekken) de lysate overboeken naar nieuwe slangen.
  5. Zet de slangen op een blok van de warmte op 95 ° C en kook eiwitten in 1 x SDS gel-laden buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2% bromophenol blauw, 20% glycerol) voor 5 min.
  6. Centrifugeren van de slangen voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in nieuwe slangen te verwijderen van de onoplosbare breuken verzamelen.
  7. Analyseren de opgelost eiwitten in stap 4.6 (2 µg) door SD-standaardpagina.
  8. Visualiseren de bands eiwit door de silver kleuring met behulp van zilveren kleuring na de fabrikant Kit ' s-protocol.
  9. Analyseren de opgelost eiwitten in stap 4.6 (10 µg) door de standaard SD-pagina's en westelijke bevlekken. Gebruik het reagens (SA-HRP) per de fabrikant ' s protocol en visualiseren door fluorography.

5. In Vitro Reconstructie van ERAD Ubiquitination van bOVA met behulp van gezuiverd Microsomes

  1. overdracht de gezuiverde microsomes (5-10 µg van eiwitten) uit stap 3.8 met een 50% volume van Retikulocyt lysate (RL), in 1 x reactie buffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM, ATP, 0.5 mM MgCl 2), en 0 uur twee vlag-gelabeld ubiquitin in een nieuwe microtube. Het uiteindelijke volume van dit experiment is 20-40 µL.
  2. Incubate de microtube gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    Opmerking: Als de hoeveelheid ubiquitinated bOVA in stap 5.12 te klein om op te sporen is door het westelijke bevlekken, 10 µM van MG132 of toevoegen 2 µM van lactacystin voor de remming van de verwerking van de ubiquitinated-bOVA door Proteasomen.
  3. Stop de reactie door het plaatsen van de microtube op ice.
  4. Het microsomes oplossen door toevoeging van 500 µL TNE buffer met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails.
  5. De microtube centrifuge voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in een nieuwe microtube te verwijderen van de onoplosbare fracties, waarin ubiquitinated bOVA in DC2.4 voordat de ubiquitination in vitro assay verzamelen.
  6. Het supernatant overbrengen in een nieuwe microtube en voeg 1/100 volume van nieuwe SA-magnetische kralen (meestal 5 µL voor 500 µL van supernatant).
  7. Voorzichtig meng goed en draaien de microtube langzaam gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  8. Centrifugeren van de microtube voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. Discard het supernatant door aspiratie om te herstellen van de bOVA en ubiquitinated bOVA gebonden met de SA-magnetische kralen.
  9. Wassen van tweemaal de verzamelde SA-magnetische kralen met 1 mL TNE buffer door centrifugeren voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. Discard het supernatant telkens door aspiratie.
  10. Kook de SA-magnetische kralen in 1 x SDS gel laden van de buffer voor 5 min bij 95 ° C op een warmte-blok op te lossen de gezuiverde eiwitten door de SA-magnetische kralen.
  11. Centrifugeren van de microtube voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in een nieuwe microtube te verwijderen van de onoplosbare breuken verzamelen.
  12. Analyseren de SA-magnetische kralen gebonden aan de eiwitten door standaard SD-pagina en het westelijke bevlekken. Het gebruik van antilichamen (Anti-Flag, anti-multi-Ub en anti-muis IgG-HRP) en het reagens (SA-HRP) is per de fabrikant ' s-protocol en gevisualiseerd door fluorography.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te verhelderen van het moleculaire mechanisme van CP, is het nodig vast te stellen van de cellulaire compartimenten, waar exogene antigenen ondergaan ERAD-achtige vervoer en verwerking. Terwijl waarnemingen door immunefluorescentie microscopie of door elektronenmicroscopie geïdentificeerd de cellulaire compartiment waar exogene antigenen16,17,18,1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In eerdere studies van CP, de opgenomen exogene antigenen opgebouwd in de beperkte ruimte van de late endosome of ER door immunefluorescentie microscopie16,30,31,32. Geschat wordt dat ERAD-achtige vervoer en verwerking van exogene antigenen worden uitgevoerd in deze gespecialiseerde vakgebieden zoals de ER of late endosome, zoals de cellulaire compartiment werd ontdekt door sacharose of het geb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het Takasaki Universiteit van gezondheid en welzijn.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetaal bovien serumEquitech bioSFB30
Natriumpyruvaatgibco by life technologies11360-070
MEM niet-essentiële aminozurengibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutaminegibco by life technologies25030-164
Penicilline-Streptomycingibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotine-eiwitlabelingskitThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
lactacystineSIGMAL6785
Dounce homogenisatorIUCHI131703
proteaseremmercocktailsSIGMAP8340
iodixanolCosmo bio1114542
SA-magnetische kralenNew England Biolabs201270
controle magnetische kralenChemagenM-PVA012
magnetische standaardBD Biosciences552311
BCA-eiwitassaykitThermo Fisher Scientific23225
zilverkleuringskitsCosmo bio423413
ReticulocytenlysaatPromega1730714
Flag-gelabeld ubiquitineSIGMAU5382
anti-ovalbumine (OVA, muis)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitine (muis)MBLD058−3
anti-Flag (muis)SIGMAF3165
trypsineSIGMA85450C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

Related Articles