Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Samenvatting

Gezien het zeer voorspelbare karakter van hun ontwikkeling, zijn Arabidopsis embryo's gebruikt als een model voor studies van genuitdrukking in planten. Echter vroeg stadium plant embryo's zijn klein en bevatten weinig cellen, waardoor ze moeilijk te observeren en te analyseren. Een methode is hier beschreven voor het karakteriseren van patroonformatie in plant embryo's onder een microscoop met behulp van de model-organisme Arabidopsis. Na de goedkeuring van de verse zaadknoppen met behulp van Hoyer de oplossing, het mobiele nummer in en morfologie van embryo's kon worden waargenomen en hun ontwikkelingsstadium door differentiële interferentie contrast microscopie met behulp van een 100 X olie-immersie objectief kan worden vastgesteld. Bovendien was de expressie van specifieke marker eiwitten gelabeld met Green Fluorescent Protein (GFP) gecontroleerd om te annoteren cel identiteit specificatie tijdens embryo patronen door confocale laser scanning microscopie. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te observeren patroonformatie in wild-type plant embryo's de cellulaire en moleculaire niveau, en te karakteriseren van de rol van specifieke genen in embryonale patronen door het vergelijken van patroonformatie in embryo's van wild-type planten en embryo-dodelijke mutanten. Daarom kan de methode worden gebruikt om te karakteriseren embryogenese Arabidopsis.

Inleiding

Embryogenese is de vroegste gebeurtenis in de ontwikkeling van hogere planten. Een volwassen embryo vormt van een zygote door celdeling- en differentiatie onder strenge controle van de genetische^1,2. Arabidopsis embryo's zijn een nuttig model voor de controle op de voedselproductie studeren omdat de volgorde van de celdelingen tijdens de embryogenese een verwachte patroon^{3,4 volgt}. Een embryo van Arabidopsis met één tot meerdere cellen is echter te klein om te worden waargenomen en geanalyseerd. Bovendien kan de mutatie van bepaalde genen embryo letaliteit⁵, met vermelding van de sleutelrol van die genen in embryogenese veroorzaken. De karakterisering van patroonformatie in de embryo-dodelijke mutanten biedt een basis voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme waarbij essentiële genen embryo-ontwikkeling reguleren.

Een gedetailleerde methode wordt hier beschreven voor de karakterisatie van embryo patroonformatie in de model plant Arabidopsis met directe microscopische observatie. Bij deze methode wordt de zaadknop goedkeuring, gevolgd door de microscopische observatie van een embryo. De karakterisering van een embryo-dodelijke mutant wordt ook beschreven.

De morfologie van de embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia kan direct door microscopie met behulp van de zaadknoppen die zijn gewist met⁷-Hoyer van oplossing^6,worden bepaald. Dergelijke zaadknoppen vertonen een hoge brekingsindex; Deze zaadknop clearing methode is dus vooral voordelig voor specimens die moeten worden nageleefd door differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie.

Daarnaast is de genen die worden uitgedrukt in een bepaalde cel of een beperkt aantal cellen tijdens de embryogenese inzetbaar als markeringen te identificeren van de cellen in het embryo. Daarom kan de cel identiteit specificatie tijdens de embryogenese geannoteerde worden door het toezicht op de expressie van marker GFP-gelabelde proteïnen met behulp van confocale laser scanning microscopie. Omgekeerd, observeren het expressiepatroon van een onbekende functioneel gen -GFP fusion tijdens de embryogenese kan beschikken over een koppeling tussen embryo patronen en de uitdrukking van dit gen, en vergemakkelijken de identificatie van nieuwe genen die vereist voor embryogenese Arabidopsis zijn.

De hier beschreven methode kan ook worden gebruikt om karakteriseren het fenotype van een embryo-dodelijke mutant, te bepalen en het effect van het betrokken gen op embryogenese op cellulair niveau. Bovendien kan de methode in combinatie met een vergelijking van het expressiepatroon van markers tijdens de embryogenese tussen wild-type en mutant planten, aanwijzingen over de moleculaire mechanismen en signaalroutes betrokken bij embryogenese^8,9opleveren. Inderdaad, de methode werd toegepast op naa10 planten, en het bleek dat de abnormale verdeling van de hypophysis in de mutant kan worden veroorzaakt door een wijziging in de verdeling van de auxine tijdens de embryogenese⁵.

Protocol

Opmerking: Dit protocol bestaat uit drie delen: 1) observeren de patroonformatie in wild-type Arabidopsis embryo's met behulp van DIC microscopie; 2) karakteriseren de embryo patroon vorming via de waarneming van marker eiwit expressie met behulp van confocale laser scanning microscopie; en 3) bepaling van de rol van een specifiek gen in embryogenese (met behulp van de mutant naa10 als voorbeeld).

1. ovule Clearing

1. Plant materiaal voorbereiding
   Opmerking: Het protocol beschreven hier is een voorbeeld over hoe om te groeien van gezonde planten; andere manieren om gezonde planten groeien ook werken.
   1. Voegt toe 100 zaden tot een 1,5 mL koker, en vervolgens 1 mL van 1,5% natriumhypochloriet (mix 15 mL 10% chloor met 85 mL water) om te steriliseren de zaden voor 5 min. omkeren de buis meerdere malen om ervoor te zorgen dat de zaden en de oplossing goed gemengd aan de oppervlakte zaden volledig te steriliseren.
   2. De zaden omzetten in de onderkant van de buis door centrifugeren voor 30 s bij 1.200 x g, verwijder het supernatant en de zaden met steriel water viermaal wassen bij een bank te verwijderen van de resterende natriumhypochloriet.
   3. 4.4 g van Murashige en Skoog (MS) basale zout mengsel en 10 g van sacharose aan 1 L ultrazuiver water toevoegen. Roer het mengsel te ontbinden en de zouten en sacharose. 3 g Geleermiddel, zoals Phytagel, de oplossing voor pH 5,8 met 1 M KOH, aanpassen toevoegen aan de MS-sacharoseoplossing en steriliseren van de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten staan om MS medium.
   4. Giet 30 mL van de MS-medium in een schotel 12 cm cultuur voor het genereren van MS middellange platen.
   5. Plaats de gesteriliseerde zaden op de MS-plaat. De plaat overbrengen in een kamer van de groei en het houden van de plaat onder de voorwaarden van de lange dagen (22 ° C gedurende 16 uur in het licht en 18 ° C voor 8u in het donker) na zaad stratificatie (3 dagen bij 4 ° C in het donker).
   6. Na 8 dagen van de groei, de planten overbrengen naar bodem (mix voedselrijke bodem en vermiculiet bij een verhouding van 1:1) in een lade, het dienblad met een wit, transparant deksel voor 5 dagen om te voorkomen dat het waterverlies te dekken, en laat een gat om te voorkomen dat verglazing van de planten.
   7. Neem het deksel uit de lade en het kweken van de planten in een walk-in kamer onder de voorwaarden van de lange-dag (zie 1.1.5). Zet het licht op 6:00 am en off om 10:00 uur. Na ongeveer 20 dagen van de groei in de walk-in zaal, hebben de planten gebloeid en siliques geproduceerd.
   8. Mark de bloemknoppen met een draad op de positie van het zaad stengels in de bloeiwijze om 8:00 pm (gebruik niet de eerste naar de derde bloemknoppen; de siliques gegenereerd op basis van deze bloemknoppen meestal een paar afgebroken zaden ontwikkelen, en dit kan het aandeel van normaal tot abnormale zaadknoppen wijzigen). Definieert het begin van de bestuiving van de zaadknop als wanneer de gemarkeerde kiem opent tot bloem bij 8:00 am de volgende ochtend.
2. Bereiding van de Hoyer-oplossing
   1. Voeg 24 g Chloraalhydraat voor een tube van 50 mL en wikkel de buis volledig met aluminiumfolie (oplossingen van Chloraalhydraat zijn niet stabiel onder licht).
   2. Vervolgens 9 mL ultrazuiver water en 3 mL glycerol toevoegen aan de bovenstaande oplossing en schudden van de buis te ontbinden de Chloraalhydraat. Hoyer van om oplossing te maken, laat de buis rusten bij kamertemperatuur te elimineren alle bubbels.
3. Zaadknop scheiding en ruimen van bouwterreinen
   1. Bevestig een stuk dubbelzijdige plakband aan een Microscoop glasplaatje. Plaats een Hauw gekweekt voor het gewenste aantal dagen na bestuiving (DAP) op de dia met de pseudoseptum die loodrecht op het oppervlak; Dit maakt het gemakkelijk te splitsen van de carpellen (figuren 1A en 1B).
   2. Splitsen van de carpellen aan beide zijden van de pseudoseptum met een spuit-naald en bevestig de twee ontleed carpellen aan de dia zodat de zaadknoppen in de Hauw zichtbaar onder een stereoscoop (cijfers 1 c en 1 D zijn).
   3. Afzien van 70 µL van Hoyer de oplossing op het glasplaatje en Bevochtig dan het puntje van een paar schone-tipped pincet met Hoyer de oplossing door dompelen. Met behulp van de stereoscoop, gaan de zaadknoppen van de Hoyer-oplossing op de dia met de pincet te reinigen van de embryo's. Breng een dekglaasje aan naar de dia voorzichtig om te voorkomen dat het genereren van alle bubbels.
   4. Zet de voltooide dia in een doos in een donkere kamer voor 2 tot 12 h (de meer volwassen een zaadknop is, hoe meer tijd nodig zal zijn) bij kamertemperatuur. Embryo's in de 2/4-cel stadium (1-2 DAP) kunnen worden waargenomen microscopisch na 2U, terwijl embryo's tussen de octant en bolvormige beginfase (3 DAP) kunnen worden waargenomen na 4 uur. Rijpere embryo's (4-8 DAP) kunnen worden waargenomen na 12 h.
   5. Onderzoeken de gewiste zaadknoppen DIC de functie van een microscoop. Zoek de embryo's onder een spaarstand veld (10 X) en vervolgens omzetten in een high-power veld (100 X olie onderdompeling lens) te observeren het cellulaire patroon in de ontwikkelde embryo's.
   6. Het onderzoeken van de embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia.

2. karakterisering van Embryo patronen en cel identiteit via de waarneming van Marker eiwit expressie

1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
   1. Kloon van de promotor en de codering van de opeenvolging van de marker-gen of hormoon respons-element en vervolgens zekering het met een fluorescente proteïne (zoals GFP); Steek vervolgens de constructie in de binaire vector (zoals pCambia1300). Hier, de auxine respons-element DR5 wordt gepresenteerd als een voorbeeld¹⁰.
   2. De resulterende DR5-GFP plasmide introduceren in het wild-type planten door Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie¹¹. Selecteer de T1-planten met behulp van MS middellange platen met hygromycin (moeder drank, 50 mg/mL verdund 1:1, 000). De transgene planten zal vertonen lange wortels en twee rozet bladeren na 8 dagen van de groei onder de voorwaarden beschreven in 1.1.5 te genereren.
   3. Breng de transgene planten voor de bodem en kweken zoals aangegeven in 1.1.6 en 1.1.7.
   4. De T2 zaden verzamelen van de onafhankelijke T1-lijnen. Zaaien op MS-hygromycin platen, selecteer de planten uitvoering van één exemplaar van de DR5-GFP -invoeging (de verhouding van resistente planten gevoelige planten zullen ongeveer 3:1) en deze overbrengen naar de bodem.
   5. De T2 planten cultiveren zoals aangegeven in 1.1.6 en 1.1.7.
   6. De T3 zaden van de T2 planten verzamelen. Zaaien op MS-hygromycin platen, selecteer de homozygoot transgene planten (alle van de planten uit een enkele lijn zal vertonen hygromycin weerstand) en deze overbrengen naar de bodem.
   7. Mark de bloemknoppen van de homozygoot T3 planten zoals aangegeven in 1.1.8.
2. GFP signaal observatie
   1. Meng 3 mL van glycerol met 47 mL ultrazuiver water voor het genereren van een 6% glycerol-oplossing.
   2. Bevestig een stuk dubbelzijdige plakband aan een glasplaatje Microscoop en monteren van een Hauw, zoals aangegeven in punt 1.3.1.
   3. Splitsen van de carpellen aan beide zijden van de pseudoseptum met een spuit-naald en bevestig de twee ontleed carpellen aan de dia onder een stereoscoop zoals aangegeven in 1.3.2.
   4. Afzien van 30 µL 6% glycerol op het glasplaatje en alle van de zaadknoppen uit de ontleed carpellen plaatsen in de oplossing met behulp van fine-tipped pincet. Plaats een dekglaasje aan op de dia voorzichtig.
   5. Als het zaad jas en endosperm in elke zaadknop voorkomen de waarneming van GFP signalen in het embryo dat kunnen, pak het embryo uit de zaadknop. Tik op de dia snel en zachtjes te extruderen van het embryo van de zaadknop (de meer volwassen een zaadknop is, de minder kracht moet worden toegepast op de dia).
   6. Onderzoeken van de dia voor GFP fluorescentie met behulp van confocale laser scanning microscopie. De geïsoleerde embryo's vinden onder een spaarstand veld (10 X) en hun locatie opnemen, dan overstappen op een high-power veld (100 X olie onderdompeling lens) te observeren van DR5-GFP expressie in de embryo's door de excitatie-lichtbron op 488 nm voor de detectie van het GFP-signaal.
   7. Bemerk de GFP-expressie in de embryo's om te kiezen van de geschikte T3 lijn voor verdere analyse.

3. karakterisering van Embryo patroonformatie in een Embryo-dodelijke Mutant via Ovule mijnen en Marker eiwit observatie: Naa10 als voorbeeld

1. Embryo patronen in naa10 mutant planten
   1. Bereid het plantaardig materiaal zoals aangegeven in 1.1.1-1.1.7.
   2. Identificeren van de naa10^{+/ −} planten door PCR met behulp van gen-specifieke primers⁵, en dan merk de bloemknoppen van de naa10^{+/ −} planten zoals aangegeven in 1.1.8.
   3. Uitvoeren van de zaadknop mijnen en het microscopisch onderzoek van naa10^{+/ −} embryo's zoals aangegeven in de 1.2 en 1.3.
2. Marker eiwit analyse met behulp van naa10 embryo 's
   1. Verkrijgen van geschikte DR5-GFP transgene lijnen met behulp van de procedure die wordt beschreven in de 2.1-2.2.
   2. Een homozygoot transgene DR5-GFP -lijn met een naa10 Kruis^{+/ −} plant te verkrijgen naa10^{+/ −} planten die homozygoot voor het GFP fluorescentie markeerteken op de F2-generatie (geïdentificeerd door gen-specifieke PCR zijn) te karakteriseren naa10^{+/ −5} en observeren van het GFP-signaal onder een microscoop met behulp van een homozygoot DR5-GFP -lijn.
   3. Mark van de bloemknoppen van naa10^{+/ −} planten die homozygoot voor DR5-GFP zijn zoals aangegeven in 2.1.7.
   4. Zoeken naar het GFP-signaal in naa10 embryo's die homozygoot voor DR5-GFP zijn zoals aangegeven in punt 2.2.

Resultaten

De methode in dit artikel wordt beschreven kan worden gebruikt om te observeren embryogenese direct onder een Microscoop, de cel identiteit specificatie tijdens de embryogenese annoteren met specifieke markers en karakteriseren van de rol van een bepaald gen tijdens de embryogenese.

Representatieve resultaten van de analyse van embryo patronen (vanaf de fase van verlengde zygote naar de volwassen walking-stick-fase) in het wild-...

Discussie

Zaadknop klaring is een handige methode voor het opsporen van de celdeling en morfologie beoordelen tijdens de embryogenese Arabidopsis; met behulp van deze techniek, kunnen direct onder DIC microscopie^5,12embryo's worden waargenomen. De kritieke stap voor zaadknop goedkeuring is stap 1.3.4. De tijd die nodig is voor de zaadknop mijnen in stap 1.3.4 is variabel. Embryo's in het stadium van 2/4-cel duidelijk waarneembaar na 2U in van de Hoyer oplossing, t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chloral Hydrate	Sigma	15307
Murashige and Skoog Basal Medium	Sigma	M5519
Phytagel	Sigma	P8169
Hygromycin	Roche	10843555001
Growth chamber	Percival	CU36L5
Fluorescence microscope	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	camera: AxioCam 506 color
Confocal Laser Scanning Microscopy	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	filters: BP 495 - 555 nm
Stereoscope	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	camera: AxioCam MRc5
nutrient-rich soil	KLASMANN, Germany
50-mL tube	Corning Inc.
1.5-mL tube	Corning Inc.
10% sodium hypochlorite solution			Huishoudelijke analytische reagens
sucrose			Huishoudelijke analytische reagens
KOH			Huishoudelijke analytische reagens
glycerol			Huishoudelijke analytische reagens
culture dish			Huishoudelijke benodigdheden
vermiculite			Huishoudelijke benodigdheden
glass slide			Huishoudelijke benodigdheden
syringe needle			Huishoudelijke benodigdheden
fine-tipped tweezers			Huishoudelijke benodigdheden
super clean bench			Huishoudelijke apparatuur