Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

Summary

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.

Abstract

Er zijn verschillende technieken voor het meten van telomere lengte, elk met hun eigen voor- en nadelen. De traditionele benadering, Telomere Restriction Fragment (TRF) analyse, maakt gebruik van een DNA hybridisatie techniek waarbij genomische DNA monsters worden verteerd met restrictie enzymen, waardoor telomere DNA repeats achtergelaten en wat sub-telomeer DNA. Deze worden gescheiden door agarosegelelektroforese, overgebracht naar een filtermembraan en gehybridiseerd aan oligonucleotide probes gemarkeerd met ofwel chemiluminescentie of radioactiviteit om telomere restrictiefragmenten te visualiseren. Deze aanpak, terwijl een grotere hoeveelheid DNA nodig is dan andere technieken, zoals PCR, kan de telomere lengteverdeling van een populatie cellen meten en de meting uitgedrukt in absolute kilobasen kunnen meten. Dit manuscript demonstreert een gemodificeerde DNA hybridisatie procedure voor het bepalen van telomere lengte. Genomisch DNA wordt eerst verteerd met restrictie-enzymen (die niet knippenTelomeren) en gescheiden door agarosegel-elektroforese. De gel wordt vervolgens gedroogd en het DNA wordt gedenatureerd en in situ gehybridiseerd aan een radioactief gemerkte oligonucleotide probe. Deze in situ hybridisatie vermijdt verlies van telomere DNA en verbetert de signaalintensiteit. Na hybridisatie worden de gels afgebeeld met behulp van fosforschermen en de telomere lengte wordt gekwantificeerd met behulp van een grafisch programma. Deze procedure is ontwikkeld door de laboratoria van Drs. Woodring Wright en Jerry Shay aan de Universiteit van Texas Southwestern ^{1 , 2} . Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van deze procedure, met enkele wijzigingen.

Introduction

Telomeren, gelegen aan de uiteinden van chromosomen, zijn nucleotide repeats van de sequentie TTAGGG (op menselijke chromosomen) die een cruciale rol spelen bij het beschermen van cellulaire genetische informatie ^{3 , 4 , 5} . Telomeren zijn enkele duizend basisparen in lengte en dienen om de integriteit van de rest van het chromosoom tijdens DNA-replicatie te beschermen. Replicatie van chromosomen is niet perfect, waardoor de uiteinden van het chromosoom niet volledig worden gekopieerd. Deze inefficiëntie in replicatie heet het "eind replicatie probleem" en resulteert in het verlies van enkele telomere repeats tijdens elke ronde replicatie ^{6 , 7} . Telomere lengte kan worden hersteld na celverdeling door telomerase, een enzym dat de verloren telomere sequenties ^{8 , 9} vervangt. Telomerase is echter nietGeactiveerd in de meeste menselijke somatische cellen en als gevolg daarvan zullen telomeren mettertijd verkorten, uiteindelijk resulterend in cellulaire senescentie ¹⁰ . Door telomere verkorting worden telomeren beschouwd als een biomarker van veroudering en risico op leeftijd gerelateerde aandoeningen ^{11 , 12} . Daarnaast kan telomere lengte beïnvloed worden door genetische, milieu- en levensstijl factoren en andere stimuli zoals oxidatieve stress, wat aangeeft dat telomere lengte een rol kan spelen als biomarker in toxicologische, epidemiologische en gedragsstudies ^{13 , 14 , 15} .

Dit artikel toont een techniek voor het meten van telomere lengte door gebruik te maken van een gewijzigde terminale restrictie fragment (TRF) analyse aangepast van Mender and Shay ² en Kimura et al. ¹⁶ , en vergelijkbaar met Herbert, Shay en WrigHt ¹ en Haussmann en Mauck ¹⁷ . Traditioneel omvat TRF analyse een Southern blot procedure. Southern blots worden beschouwd als de "gouden standaard" voor het bestuderen van telomere lengte en worden actief gebruikt voor het onderzoeken van leukocyten telomere lengte in epidemiologie studies ¹⁸ . Deze TRF analyse maakt gebruik van gedigereerd genomisch DNA achter de telomere herhalingen. De DNA-fragmenten worden dan gescheiden door gelelektroforese, gedenatureerd en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan. De telomere sequenties worden gehybridiseerd aan een telomere oligonucleotide probe. In plaats van de gescheiden telomeren naar een membraan over te brengen, gebruiken andere TRF-technieken in-gel hybridisatie technieken met en zonder denaturatie van het DNA. De opname van denaturatie is belangrijk bij het onderzoek naar de detectie van interstitiële telomeren, die bij sommige soorten ¹⁹ zijn gerapporteerd. Procedures die geen denaturerende stappen hebben, detecteren alleen thE enkelstrengige DNA overhangen bij terminale telomeren en bindt niet aan interstitiële telomere sequenties ¹⁸ .

Naast TRF analyse zijn er verschillende andere technieken om telomere lengte te meten die elk hun eigen voor- en nadelen hebben. De Flow-FISH-techniek kan de gemiddelde telomere lengte van individuele cellen van een duidelijk celtype meten met behulp van flowcytometrie ^{16 , 20} meten. Hoewel het telomeren met zeer specifieke probes nauwkeurig kan taggen en de menselijke fout door automatisering kan verminderen, is Flow-FISH duur, minder efficiënt en vereist verse monsters en een hooggeschoolde technicus, waardoor zijn capaciteit voor epidemiologische studies beperkt is ¹⁶ . Bovendien geeft deze methode geen rekening met mogelijke veranderingen in het aantal chromosomen in de celpopulatie. Een andere techniek, qPCR, wordt algemeen geaccepteerd als middel om telomere lengte te meten voor epidemiologische studies ^{16 door zijn hoge doorvoer, lage kosten en vereiste voor kleine hoeveelheden DNA in vergelijking met andere methoden. Echter, qPCR kan alleen gemiddeld telomeer DNA-gehalte meten aan een enkelkopie gen en is dus een indirecte schatting van de gemiddelde telomere lengte. Het geeft ook een hoge variatiecoëfficiënt in vergelijkende studies, vergeleken met zuidelijke blots, wat leidt tot twijfelachtige nauwkeurigheid 21 .}

De TRF procedure heeft zijn eigen tekortkomingen die het gebruik ervan beperken voor sommige studies. TRF technieken vereisen een grote hoeveelheid DNA in vergelijking met andere methoden (tussen 2 en 3 μg per monster). Dit beperkt de toepassingen van de techniek om de telomere lengte van klinische monsters te onderzoeken waarvoor voldoende genomisch DNA kan worden verzameld en kan niet worden gebruikt op gedegradeerde DNA-monsters. Bovendien is de TRF-analyse kostbaar en arbeidsintensief, waarbij 4-5 dagen nodig zijn om resultaten op te leveren. De TRF levert echter een lage coëfficiënt van variantieDe reproduceerbaarheid ervan toestaan. Hoewel dit protocol anders is dan de traditionele Southern blot (gebruikmakend van in situ gel hybridisatie), zijn de twee technieken fundamenteel hetzelfde.

De hier gepresenteerde techniek is een combinatie van een Southern blot en in-gel hybridisatie; Associëren van de DNA-denatureringsstap van zuidelijke blots met de in-gel hybridisatie. Deze combinatie heeft het bijkomende voordeel van verbeterde sonde-signaalsterkte ten opzichte van de Southern blot en heeft consequent kwantificeerbare resultaten in ons lab verkregen. Bovendien levert het gebruik van radioactieve probes in plaats van chemiluminescerende probes een hogere signaalintensiteit en zorgt voor visualisatie en kwantificering met een fosforimager, waardoor de analyses van de gebruikersvriendelijke TRF worden gemaakt.

Protocol

1. Genomische DNA-extractie

1. Voer een genomische DNA-extractie uit de cellen (hier, cellijn BJ-hTERT) uit, met behulp van een commerciële DNA-extractie kit, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Als de DNA-concentratie minder dan 100 μg / ml is, precipiteer het DNA met ethanol en resuspendeer in een volume TE-buffer (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (Ethyleendiaminetetraazijnzuur), pH 8,0) om een ​​DNA-concentratie van 100-600 μg / ml).

2. DNA Integrity Assessment

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol schetst een DNA-integriteitsbeoordeling met behulp van een gelelektroforese systeem met een 11 cm x 14 cm gel. Andere systemen en gelgroottes kunnen ook worden gebruikt, maar de spanning en de DNA-migratietijd kunnen variëren.

1. Bereid een 1% agarosegel door 1 g elektroforese graad agarose in 100 ml 1x TAE buffer (40 mM Tr-base is; 20 mM azijnzuur; 2 mM EDTA; PH 8,5) en magnetron tot de agarose is opgelost en de oplossing helder is. Koel de oplossing bij kamertemperatuur tot 50 ° C (ongeveer 15 - 20 minuten).
2. Terwijl de agarose-oplossing afkoelt, bereid de gietbak van de gietstukken door het toevoegen van gietende poorten aan de gietbak. Om agarose lekkage te voorkomen, moet u de eindpoorten afkoelen tot 4 ° C voordat u deze vastzet aan de gietbak.
3. Zodra de agaroseoplossing tot 50 ° C is afgekoeld, voeg 10 μL ethidiumbromide (10 mg / ml in dH20) toe en giet de agaroseoplossing in de gelgietbak. Voeg de kam toe aan de gietbak.
4. Laat de agarose oplossing bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten verharden.
5. Bereid DNA-monsters voor elektroforese door 25 ng genomisch DNA te verdunnen met 1x TE buffer tot een eindvolume van 9 μl en voeg 1 μL 10x laadverf (0.25% (w / v) bromfenolblauw, 0,25% (w / v) xyleen Cyano FF, 30% (v / v) glycerol). Goed mengen.
6. Bereid het gelelektroforese systeem voor DNA-migratie door het elektroforese systeem te vullen met 1x TAE buffer zodat het bufferniveau meerdere millimeter boven de gel is. Laad de putjes van de gel met de helft van de DNA-monsters. Voeg 5 μL van een DNA ladder toe aan een enkele put.
7. Run de DNA-migratie bij 100 V gedurende ongeveer 2 uur of tot de bromfenol-blauwe kleurstof ongeveer halverwege de gel is.
8. Beeld de gel met behulp van een ultraviolet licht transilluminator of equivalent.
   OPMERKING: DNA-monsters met goede integriteit hebben banden met een hoge molecuulgewicht zonder smeden (dat komt door scheren of gebroken DNA). Als de DNA-banden worden uitgezaaid, hebben ze een lage integriteit en zijn ze niet geschikt voor de Southern blot-analyse, en het DNA moet opnieuw geïsoleerd worden met verse cellen.

3. Genomic DNA Digestion

1. Voer de spijsvertering van het genomische DNA uit in een eindvolume van 20-40 μl.
   OPMERKING: Volumes groterDan 40 μl zal de putjes van de agarosegel overlopen.
   1. Combineer 3 μg genomisch DNA en de geschikte hoeveelheid 10x DNA-digestbuffer (geleverd met de restrictie-enzymen) zodat de uiteindelijke concentratie 1x in een microtube is. Voeg 1 μL RsaI-restrictie-enzym (10.000 U / ml) en 1 μl HinfI-restrictie-enzym (10.000 U / ml) toe aan elke buis. Pas het eindvolume aan met behulp van steriele, gedeioniseerde H ₂ O. Meng goed. Centrifugeer kort (10-15 s bij 16.000 xg) om ervoor te zorgen dat alle onderdelen in de bodem van de buis liggen.
2. Incubeer de spijsvertering bij 37 ° C gedurende ≥16 uur. Bewaar het verteerde DNA bij 4 ° C of -20 ° C gedurende maximaal 2 dagen indien nodig ^17, indien nodig.

4. Genomische DNA Gel Electroforese

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol beschrijft een procedure voor het gebruik van een 20,2 x 25 cm gelelektroforese systeem. Verschillende gel electroPhoresis-systemen kunnen gebruikt worden, maar verschillende variabelen moeten mogelijk worden aangepast, inclusief spanning, tijd van migratie en hoeveelheid elektroforese buffer toegevoegd aan het systeem om optimale resultaten te verkrijgen.

1. Bereid een 0,6% agarose oplossing door 2,25 g gelelektroforese kwaliteit agarose te combineren met 375 ml elektroforese buffer, ofwel 1x TAE of 0,5x TBE (110 mM Tris base; 90 mM boorzuur; 2,5 mM EDTA; pH 8,3).
   OPMERKING: Voor telomeren minder dan 8.000 kB wordt 0,5x TBE aanbevolen, terwijl 1x TAE wordt aanbevolen voor telomeren tussen 8.000 kB en 20.000 kB ¹ .
2. Magnetron de oplossing tot de agarose is opgelost en de oplossing is helder. Laat de oplossing gedurende 15 - 20 minuten afkoelen bij kamertemperatuur of tot de agarose 50 ° C bereikt.
3. Terwijl de agarose-oplossing afkoelt, bereid het gelelektroforese systeem voor gelgieten zoals beschreven in stap 2.2. Giet de agarosegeloplossing in een gietbak. Plaats een kam inDe gel. Laat de gel gedurende 45 minuten verhard worden bij kamertemperatuur.
4. Bereid de verteerde DNA monsters voor elektroforese. Voor een 40 uL reactie, voeg 0,4 μL 10x laadkleuring toe aan elk monster van verteerd DNA. Kortom centrifuge (10-15 s, 16.000 xg) om ervoor te zorgen dat alle oplossing onderaan de buis zit.
5. Bereid het gelelektroforese systeem voor DNA-migratie op. Verwijder de eindpoorten en kam uit de gel. Vul het gelelektroforese systeem met 1x TAE of 0,5x TBE op de vullijn, zodat de gel volledig in de buffer wordt ondergedompeld.
6. Laad de putjes van de gel met de DNA-monsters op, zodat er een blanco tussen de monsters is. Vermijd het veroorzaken van belletjes of het prikken van de gel. Voeg 10 μL van een DNA ladder in de putjes op de tegenovergestelde uiteinden van de gel.
   OPMERKING: Het type DNA ladder zal afhangen van de lengte van de telomeren, die van persoon tot persoon en tussen celbronnen verschilt.
7. Doe de gelelektroforese bij 150 V gedurende 30 minuten om het DNA snel in de gel te bewegen; Stel dan de spanning op op 57 V en laat het 18-24 uur lopen.

5. Gel Fluorescent Imaging en Hybridization

1. Zet na 18-24 uur de gelelektroforese stroombron uit. Verwijder de gelgietbak met de gel uit de elektroforese buffer. Plak de rechter bovenhoek van de gel af om als referentie voor de oriëntatie van de gel te dienen.
2. Bereid een stuk filterpapier door het papier te snijden om iets groter te zijn dan de gel. Plaats het filterpapier bovenop de gel in de gietbak en laat het papier de overmaat op de gel opdrogen. Verwijder de luchtbellen tussen het filterpapier en de gel voorzichtig met behulp van een pipet als een roller om de bellen door de zijkanten uit te drukken.
3. Verwijder de gel van de gietbak door de gel te draaien en filterpapier over te laten zodat het papier onder de gel ligt. Breng de gel met het filterpapier over naar een gel droger en bedek hetGel met plastic wrap. Verwijder alle luchtbellen tussen de plastic wrap en de gel met behulp van een pipet als een rol.
4. Droog de gel gedurende 2 uur bij 50 ° C.
5. Verwijder eens de plastic wrap en laat de gel overbrengen en filterpapier op een glasschaal met 250 ml gedeïoniseerd water (voldoende om de gel te bedekken) overbrengen. Verwijder het filterpapier voorzichtig en incubeer de gel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. De gel wordt dun, stevig en makkelijk te manipuleren zonder te scheuren.
6. Bereid 5x SSC oplossing (750 mM NaCl; 75 mM natriumcitraat) in gedeïoniseerd water.
7. Leg de gel op een nylon gaas (12 in x 12 in). Rol het nylonnetje en de gel samen om ervoor te zorgen dat de gel niet in contact is met zichzelf. Plaats het gaas en de gel in een hybridisatiebuis ( bijv . 12 in buis met 1,5 in diameter).
   OPMERKING: Bij gelijktijdig oprollen komt de gel in contact met het nylonnet aan beide zijden.
8. Combineer 100 ml 5x SSC en 12 μL groene fluorescerende nucleïne aCid vlek, en plaats in de hybridisatiebuis. Bescherm de oplossing tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij 42 ° C in een hybridisatieoven met rotatie.
9. Verwijder de nylon gaas / gel uit de hybridisatiebuis, rol open en plaats plat in een glazen schaal met 250 ml gedeïoniseerd water en verwijder voorzichtig nylon mesh. Beeld de gel met behulp van een fosforimager. Gebruik de fluorescentie instellingen: 520 BP, 40 Blue en 488 nm. Stel de fotomultiplicatorbuis (PMT) in op 375, het brandpuntsvlak naar +3 mm en de gevoeligheid voor normaal. Sla de afbeelding op een bestand op.

6. Hybridisatie

1. Bereid de radioactieve telomere sonde op.
   1. Combineer 2 μL (2 ng) telomere probe (5- (CCC TAA) ₄ 3 '), 2,5 μl 10x polynucleotide kinase reactiebuffer, 3 μL y32P-dATP (6.000 Ci / mmol), 4 μl T4 Polynucleotide kinase en DNase vrij, steriel gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 20 ul in een micrOcentrifuge buis.
      Let op: Volg de radioactieve veiligheidsvoorschriften van de voorzieningen bij gebruik van radioactiviteit.
2. Kort centrifuge (10-30 s bij 16.000 xg) en incubeer in waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur. Centrifugeer gedurende 10-30 s bij 16.000 xg en incubeer bij 20 ° C gedurende 20 minuten om de reactie te stoppen.
3. Meng de inhoud van de kolom met behulp van een G-25 chromatografie microspin kolom door vortexen, centrifugeer gedurende 1 minuut bij 700 xg bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg.
4. Laad de radioactieve sondeoplossing in de G-25 chromatografie kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 700 x g. Bewaar het filtraat.
   OPMERKING: behoud het filtraat aangezien deze de radioactieve telomere sonde bevat. De radioactieve sonde kan indien nodig bij 4 ° C opgeslagen worden.
5. Bereid 250 ml denaturerende oplossing samengesteld uit 1,5 M NaCl en 0,5 M NaOH in steriel gedeïoniseerd water.
6. Plaats de gel in een glazen schaal met 250 ml denaturerende oplossing en incubBij kamertemperatuur gedurende 15 minuten gegeten. Verwijder de denatureringsoplossing en vervang met 250 ml steriel gedeïoniseerd water. Incubeer gedurende 10 minuten op een orbitale shaker (40 - 50 rpm) bij kamertemperatuur.
7. Bereid 250 ml neutralisatieoplossing samengesteld uit 1,5 NaCl en 0,5 M Tris-zoutzuur, pH 8,0 in steriel gedeïoniseerd water.
8. Verwijder het gedeïoniseerd water en vervang met 250 ml neutraliseringsoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
9. Bereid 50 ml hybridisatieoplossing uit 5x SSC, 5x Denhardt's oplossing (0,1% niet-ionisch synthetisch polymeer, 0,1% polyvinylpyrrolidine, 0,1% runder serumalbumine), 10 mM dinatriumfosfaat (Na2 HPO) tijdens de incubatie in de neutraliseringsoplossing. ₄ ) en 1 mM natriumpyrofosfaat tetrabasische decahydraat (Na4P207.10H20) in steriel gedeïoniseerd water.
10. Rol de gel in nylon gaas en plaats in de hybridisatiebuis (stap5.7). Voeg 20 ml van de hybridisatieoplossing toe en incubeer 10 minuten bij een hybridisatieoven bij 42 ° C met rotatie.
11. Verwijder de hybridisatieoplossing en vervang met 20 ml verse hybridisatieoplossing. Voeg het geheel van de telomere sonde toe en incubeer in een hybridisatieoven bij 42 ° C overnacht met rotatie.

7. Gel Was, Fosfor Screen Exposure, en Radio Imaging

1. Bereid 500 ml 2x SSC oplossing (300 mM NaCl; 30 mM natriumcitraat) in steriel gedeïoniseerd water.
2. Bereid 250 ml 0,1x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM natriumcitraat) en 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water.
3. Verwijder de gel en ga uit de hybridisatiebuis en plaats in een glazen schaal die 250 ml 2x SSC bevat. Ontrollen en verwijder het nylonnetje uit het gerecht. Leg de glazen schaal op een orbitale shaker en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwijder de 2x SSC en vervang met 250 mL van 0.1x SSC en 0.1% SDS oplossing, en incubeer gedurende 15 minuten op een orbitale shaker bij kamertemperatuur.
5. Tijdens de incubatie, blootstelt het fosfor scherm op de beeldvezer gedurende 15 minuten.
6. Verwijder de 0,1x SSC en 0,1% SDS oplossing en vervang met 250 mL 2x SSC. Incubeer gedurende 15 minuten op een orbitale shaker.
7. Verwijder de gel van 2x SSC-oplossing en draai de gel in plastic wrap of plaats in een hitteafdichtbare zak. Verwijder alle bellen en luchtzakken tussen de gel en de plastic wrap of plastic zakje. Plaats de gel in een belichtingscassette met het Phopshor scherm. Laat het fosforscherm overnacht op de gel.
8. Beeld het blootgestelde fosforscherm met behulp van een fosforimager.

8. Telomere Lengte Kwantificering

1. Open het fosforimager-bestand met het fluorescerende beeld van de groene fluorescerende nucleïnezuurgekleurde gel ( Figuur 1 ).
2. Selecteer 'Tools' en vervolgens 'Pixel Distance'9 ;. Trek met behulp van de muis een lijn van de bodem van de gel tot aan het midden van de eerste markering en teken de afstand op. Herhaal deze procedure voor elke merkband ( afbeelding 2 ). Deze afstanden worden gebruikt in het grafisch programma zoals hieronder beschreven.
3. Open de fosforimage van de radioactief gelabelde gel ( Figuur 3 ). Selecteer 'Object Manager' en vervolgens 'Grid'. Stel het rooster in op 1 kolom en 150 rijen. Zet het rooster zodanig dat het van de bovenkant van de gel naar de onderkant van de gel strekt. Pas de breedte van het raster aan op de breedte van de rijstrook, klik op de rand van het raster en sleep de breedte van het raster naar de breedte van de rijstrook.
4. Kopieer dit raster (zodat de breedte en hoogte van de dozen hetzelfde blijven) en verplaats het tweede raster naar een lege rijstrook (voor achtergronddoeleinden). Ga verder met extra roosters voor extra voorbeeldbanen.
   OPMERKING: als het klaar is, moet er zijnRoosters voor elke steekproefbaan en één rooster van een lege rijbaan voor achtergrond ( figuur 4 ).
5. Selecteer 'Analyse' en vervolgens 'Volume Rapport'. Selecteer alle rasteren voor het rapport. Zodra het volume rapport is weergegeven, dubbelklik op het rapport om het spreadsheet programma te activeren. Sla het spreadsheet bestand op. De gegevens voor dit bestand worden opgeslagen Onder de 'Volume' baan.
6. Open een geschikt grafisch programma en maak een nieuwe data en tabel. Selecteer 'Y: Enter en plot een enkele Y-waarde voor elk punt' en selecteer vervolgens 'Creëren'.
7. Benoem de eerste kolom (Kolom X) als 'Gemeten afstand' en label de tweede kolom (Kolom Y) als 'Moleculair gewicht'. Voer de markeermolecuulgewichten van elke markerband in kolom Y in. Voer de migratieafstanden die zijn verkregen in stap 8.2 overeen met elke molecuulgewichtmarkering.
8. Ga naar 'Analyse' en selecteer 'Analyseer' en dan 'nonlinear regressi'Aan (curve fit) 'en selecteer' OK '. In het volgende scherm selecteert u 'Exponentieel en vervolgens' Een fase verval '. Selecteer 'Range' tab en voer '150' in 'aantal punten die de curve definiëren' en controleer 'Maak een tabel met XY-coördinaten om de curve naar een ander programma te exporteren of kopiëren'.
   OPMERKING: Het resultaat, 'nonlinear fit of Data 1', bevat het molecuulgewicht voor elke afstand in de Y-rij.
9. Voor analyse van de steekproeven selecteert u een gebied van analyse die boven en onder de werkelijke telomere banden ligt. Gebruik de volledige lengte van de baan niet ( figuur 5 ). Bepaal de rasterlocaties voor het analysegebied van elke baan.
10. Selecteer 'Bestand', 'Nieuw' 'Nieuwe tabel en grafiek maken'. Selecteer 'Y: Enter en plot een enkele Y-waarde voor elk punt' en selecteer vervolgens 'Creëren'. Kopieer en plak de volume-waarden van de achtergrondbaan (intensiteitswaarden) uit het spreadsheetbestandIn de eerste kolom (X) en de volumewaarden (intensiteitswaarden) van de steekproefbaan in de eerste kolom Y. Als er meerdere steekproeven zijn, kopieer elke set volumewaarden van het spreadsheetbestand naar extra Y-kolommen in het grafisch programma het dossier.
11. Verwijder de waarden uit de achtergrondkolom (X) en elke voorbeeldbaan (Y) die buiten de analyses zijn die in stap 8.8 zijn bepaald.
    OPMERKING: De gegevens tabel mag alleen waarden bevatten in die rasterlocaties die overeenstemmen met de analyses.
12. Selecteer Analyse, analyseer dan en transformeer. Klik op 'OK'. Selecteer 'Y-waarden transformeren met Y = YX'. Dit zal de data transformeren in Data 2 (getransformeerde intensiteitswaarde (Y) = steekproefintensiteit (Y) - achtergrondintensiteit (X)).
    1. Selecteer Analyse dan 'Analyseren', 'Kolomanalyse' en 'Kolomstatistieken'. Selecteer OK. Het tabblad 'Col. Statistieken van Transform of Data 2 'toontOnder de 'Sum' rij, Σ (Int _i ).
13. Selecteer 'Bestand', 'Nieuw', 'Nieuwe tabel en grafiek maken'. Selecteer 'Y: Enter en plot een enkele Y-waarde voor elk punt' en selecteer vervolgens 'Creëren'. Kopieer en plak de Y-kolomgegevens van de resultatenpagina 'Nonlin fit van Data 1, Curve' in de nieuwe X-kolom. Kopieer en plak de Y-kolomgegevens van de resultatenpagina 'Transform of Data 2' in de nieuwe Y-kolom. Selecteer Analyse dan 'Analyseren' en 'Transformeren'. Klik op 'OK'. Selecteer 'Transform Y-waarden met Y = Y / X'.
    1. Selecteer Analyse dan 'Analyseren', 'Kolomanalyse' en 'Kolomstatistieken'. Selecteer OK. Het tabblad 'Col. Stats Transform of Data 3 'staat onder de' Sum 'rij, Σ (Int _i / MW _i ). MW = molecuulgewicht.
14. Om de gemiddelde telomere lengte (TL) voor elk monster te berekenen, gebruik deFormule TL = Σ (Int _i ) / Σ (Int _i / MW _i ).

Results

Drie concentraties van DNA (1, 2 en 3 μg) geïsoleerd uit de cellijn BJ-hTERT (telomerase immortalized human foreskin fibroblasts) ²² en humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werden geanalyseerd voor telomere lengte. Tabel 1 toont de baanopdrachten voor elk DNA-monster. Figuur 1 toont een nucleïnezuur fluorescerende vlek van de gel. De molecuulgewichtstandaarden zijn duidelijk zichtbaar. De afstand van de ...

Discussion

Na elektroforese is het genomische DNA-smear hoger dan 800 bp. Dit kan optreden als de restrictie-enzymen defect zijn of indien extra enzymen (zoals hierboven beschreven) nodig zijn. Een tweede mogelijke verklaring is dat het eiwit nog steeds aan het DNA gehecht is. Bij het bepalen van de DNA-concentratie door spectrofotometer moet de 260/280 verhouding ongeveer 1,8 zijn. Als deze verhouding <1,5 bedraagt, is er eiwitverontreiniging die de restrictie-enzymvertering kan bemoeien. Ofwel zou het DNA-monster opnieuw geïs...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, restrictie-enzym	New England Biolabs, Inc	R0167S	10.000 U/mL, DNA-vertering.  Wordt geleverd met Cutsmart Buffer (verteringsbuffer)
Hinf1, restrictie-enzym	New England Biolabs, Inc	R0155S	10.000 U/mL, DNA-vertering.  Wordt geleverd met Cutsmart Buffer (verteringsbuffer)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	elektroforesekwaliteit agarose
Optikinase	affymetrix	78334X 500 UN	T4 Polynucleotide Kinase
SYBR Green Nucleic Acid Stain I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		Op maat besteld DNA-oligonucleotide
Gamma-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	Radio-isotoop
Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit	Qiagen	13323	DNA-extractiekit
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	Voor zuivering van readioactieve oligo probe
Ficoll 400			niet-ionische synthetische polymeer
Equipment/Software
Owl A5 Gel elektroforese systeem (20 cm x 25 cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel elektroforese
Horizon 11.4 Gel elektroforese systeem (11 cm x 14 cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel elektroforese
Nylon gaas, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE Storage Phosphor Screens	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
Phosphor Screen Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp Hybridisatie Incubator	Fisher Scientific	13-247-20Q
Cilindrische hybridisatiebuizen	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer orbital shaker	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	Orbitaal shaker
Typhoon 9400	ABI		Voor beeldvorming van gels en fosforscreens
GraphPad Prism 6	GraphPad	Versie 6.05	Grafische programma
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	Spreadsheetprogramma
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	Spectrofotometer