Methodenartikel

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

DOI:

10.3791/56003

⸱

27 november 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autologe cel-gebaseerde therapieën kreeg een stap dichter bij de werkelijkheid met de introductie van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Foetale stamcellen, zoals vruchtwater en membraan mesenchymale stamcellen, vertegenwoordigen een uniek type ongedifferentieerde cellen met belofte in weefselengineering en herprogrammering in iPSC voor toekomstige pediatrische interventies en bankieren van de cel van de stam. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een geoptimaliseerde procedure voor het extraheren en kweken van primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen en het genereren van episomal geïnduceerde pluripotente stamcellen uit deze cellen in volledig chemisch welbepaalde cultuur voorwaarden gebruik te maken van menselijke recombinante vitronectin en het E8-medium. Karakterisering van de nieuwe regels door het toepassen van strenge methoden – stroom cytometry, confocal imaging, Teratoom vorming en transcriptionele profilering – wordt ook beschreven. De nieuw gegenereerde regels express markers van embryonale stamcellen – Oct3/4A Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – terwijl ze negatief voor de markering van de SSEA-1. De stamcellijnen vormen teratomas in scid-beige muizen in 6-8 weken en de teratomas bevatten weefsels representatief is voor alle drie lagen van de kiem. Alle lijnen pluripotente transcriptionele profilering van de lijnen door het indienen van globale expressie microarray gegevens aan een bioinformatic algoritme voor de beoordeling van de pluripotent geacht en deze aanpak is daarom een aantrekkelijk alternatief voor dierproeven bevorderen. De nieuwe regels van de iPSC kunnen gemakkelijk worden gebruikt in downstream experimenten met de optimalisatie van differentiatie en weefselkweek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) brengt over potentiële vervanging celtherapieën, ziekte en ontwikkelingsstoornissen modelleren, en drug en toxicologische screening1,2,3. Vervangende therapieën conceptueel kan worden bereikt door cel injectie, in vitro gedifferentieerd weefsel (zoals cardiale patches) implantatie of regeneratie geleid door middel van weefselkweek. Vruchtwater (AFSC) en de cellen van de stam van de membraan (AMSC) zijn een uitstekende bron van cellen voor deze interventies ofwel direct4,5,6,7 of als een startende celpopulatie voor herprogrammering in pluripotent8,9,10,11,12.

Vroege benaderingen gebruikt ongedefinieerde cultuur systemen of methodes die voortvloeien genomic integratie van vereisen herprogrammering construeert9,10,11,12. Een meer recente studie gebruikt een xeno-gratis medium, hoewel een minder gedefinieerde kelder membraan bijlage matrix (BMM) werd gebruikt, voor het genereren van iPSC uit vruchtwater vloeistof epitheliale cellen. De bepaling van de formatie Teratoom werd echter niet opgenomen in de studie samen met een schat van in-vitrotestmethoden en moleculaire gegevens. Vruchtwater vloeistof epitheliale cellen bleken te hebben een ongeveer 8-fold hogere herprogrammering efficiëntie in vergelijking met neonatale fibroblasten13. In een andere studie, werden mesenchymale stamcellen uit vruchtwater ook gevonden te worden geherprogrammeerd in iPSC met een veel hogere efficiëntie12.

Pluripotente stamcellen kunnen worden onderscheiden in weefsels vertegenwoordiger van alle 3 lagen van de kiem en dus hebben de ruimste mogelijkheden. Pediatrische patiënten kunnen profiteren van de oogsten, herprogrammering en Weefselengineering van hun autologe stamcellen voor vruchtwater vloeistof geïnduceerd en vruchtwater membraan stam cellen perinataal overdraagbaar zijn. Bovendien, het relatief lage niveau van differentiatie van foetale stamcellen (lager dan volwassen stamcellen14,15) zou theoretisch helpen bij het aanpakken van de waargenomen eigendomsvoorbehoud epigenetische bias van broncellen in iPSC16.

Hier presenteren we een protocol voor het vruchtwater te herprogrammeren en membraan stamcellen te pluripotent in chemisch welbepaald xeno-vrije E8 medium op recombinante vitronectin17 (Doompixie) met behulp van episomal plasmiden18. Het belangrijkste voordeel van vruchtwater vloeistof en membraan cellen als een bron van cellen voor herprogrammering ligt in hun pre beschikbaarheid en perinataal overdraagbaar zijn en dus deze aanpak vooral gebaat onderzoek naar pediatrische weefselengineering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol volgt institutionele richtsnoeren van de ethische commissie voor menselijke onderzoek. Schriftelijke toestemming van de patiënt is verkregen voor het gebruik van het vruchtwater voor onderzoek.

Dit protocol volgt het beleid van het institutionele Animal Care en gebruik Comité van de Universiteit van Zuid-Alabama.

1. isolatie en cultuur van primaire vruchtwater mesenchymale stamcellen

  1. Beplating van vruchtwater vloeistof cellen
    1. Verkrijgen van minimaal 2,5 ml vruchtwater geoogst in het proces van vruchtwaterpunctie door een arts.
      Opmerking: Alle handling van levende cellen en weefsels moet worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek-kast en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt. Vertrouwdheid met fundamentele celcultuur en steriele techniek is vereist.
    2. Voorbereiden van het vruchtwater vloeistof en membraan cel (AFMC) kweekmedium: EBM-2 Basaal medium, 15% foetale runderserum (FBS), 20 ng/mL bFGF, 25 ng/mL van EFG, 10 ng/mL van het IGF. Voor cultuur van de cellen van de stam van de primaire vruchtwater vloeistof evenals vruchtwater membraan, moet het medium worden aangevuld met antibioticum-antimycotic oplossing.
    3. Op dag 0, Meng 2,5 mL vruchtwater met 3,5 mL AFMC kweekmedium en plaat in een maatkolf van T25. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 48 uur ongestoord voordat het controleren op de aanwezigheid van kolonies.
    4. Op dag 5, moeten kolonies van Adherente cellen aanwezig zijn. Zachtjes rock de kolf te verjagen cellen die deed niet volledig voldoen aan de onder- en puin en vacuüm-aspirate het gebruikte medium/vruchtwater vloeibare mengsel met behulp van een precisiepipet Pasteur. Vervangen door 5 mL verse AFMC voedingsbodem.
    5. Cultuur voor nog eens 5 dagen. Verandering medium om de andere dag zoals beschreven in stap 1.1.4.
  2. Isolatie van primaire mesenchymale stamcellen uit menselijke amnion
    1. Placentas zo spoedig mogelijk na geboorte, binnen de 24u uiterlijk te maximaliseren cellulaire integriteit te verkrijgen. Knip een 9 cm2 segment van het amnion, verwijderen van bloedstolsels en wassen in een centrifugebuis 50 mL met 30 mL PBS aangevuld met antibioticum-antimycotic oplossing.
    2. Mince de membranen met behulp van een paar scalpels aan fijne stukken in een steriele 10 cm weefselkweek schotel. De vertering van de membranen en het extraheren van de cellen zal worden bereikt met behulp van een weefsel dissociatie systeem. Volg protocol van de fabrikant.
      Opmerking: hoe fijner de stukken van het weefsel na hakken, hoe hoger de cel nummers herstelde zich na vertering.
    3. Breng het gehakt membraan weefsel massa met behulp van de scalpel messen in een weefsel dissociatie buis en meng met 4,7 mL van RPMI 1640 medium. Meng in de dissociatie enzymen (Zie Tabel van materialen).
    4. Mount de buizen op de dissociator van het weefsel en stormloop programma "h_tumor_01". Incubeer de buizen bij 37 ° C op een rockende platform voor 30 min.
    5. Verder verdunnen de schorsingen met 35 mL RPMI 1640 en gelden voor een 70 µm zeef geplaatst over een tube van 50 mL collectie centrifuge.
    6. Centrifuge bereid voor 5 min bij 200 x g bij kamertemperatuur, discard supernatant, resuspendeer de pellet in 5 mL RPMI 1640, met behulp van een hemacytometer cellen tellen en plaat bij een dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in Weefselkweek behandeld vaartuigen met vers AFMC medium aangevuld met antibioticum-antimycotic oplossing.
      Opmerking: In geval van onvolledige vertering, kleine stukjes weefsel zal aanwezig zijn en afzonderlijke cellen zullen schaars. Spin naar beneden weer en de hele pellet in een maatkolf van T75 plaat.
  3. Cultuur van primaire AFSC en AMSC
    1. Koloniën van de passage van de AFSC/AMSC door vacuüm-zuigen doorgebracht middellange met behulp van een precisiepipet Pasteur en toevoeging van 2 mL van cel detachement enzym in de kolf. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-8 minuten.
    2. Kraan op de kolf te verjagen van de cellen en meng de opschorting met een gelijke hoeveelheid AFMC medium (antibioticum-antimycotic supplement niet moeten vanaf dit punt). Centrifugeer bij 200 g voor 4-5 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een glazen pipet van Pasteur of gewoon door middel van het omkeren van de buis en het in een afvalcontainer te legen.
    3. De bodem van de centrifugebuis te breken van de pellet in de schorsing van een eencellige in de resterende druppel vloeistof en meng met AFMC medium voor plating flick. Plaat in T-kolven op een dichtheid tussen de 2.500 en 5.000 cellen/cm2.
    4. Verandering medium om de andere dag. Niet cultuur de cellijnen buiten passage 6. Gebruik voor herprogrammering doeleinden, als lage een passage mogelijk.
    5. Bereiden bevroren voorraden AFSC en AMSC als back-ups met behulp van bevriezing medium. Oogst culturen met behulp van een cel detachement enzym, centrifuge op 200 g voor 4 ° C gedurende 5 minuten.
    6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet Pasteur en flick van de onderkant van de buis aan de singularize van de cellen in de pellet. Resuspendeer in volledige bevriezing medium bij een dichtheid van 1 × 106/mL en aliquot in cryovials. Bewaar in een bevriezing container's nachts bij-80 ° C. Verplaats naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

2. herprogrammering in pluripotent

  1. Verkrijgen van de herprogrammering plasmiden
    1. Koop de herprogrammering plasmiden via een non-profit plasmide repository. Een materiaal Transfer Agreement is nodig.
    2. De plasmiden omvormen bevoegde cellen van E. Coli en isoleren van de plasmiden met behulp van een commerciële plasmide extractie kit. Volg de instructies van de fabrikant.
    3. Het meten van de concentratie van plasmide DNA met een spectrofotometer. Streven naar een hoge concentratie voor het resulterende plasmide, idealiter ongeveer 1 µg/µL om te voorkomen dat de verdunning van het monster tijdens transfectie.
    4. Meten van de concentraties van de afzonderlijke plasmiden met behulp van een UV spectrofotometer en aliquot hen individueel.
    5. Meng 3 µg, 3 µg en 2 µg voor EN2K, ET2K en M2L plasmiden, respectievelijk. Dit is de herprogrammering plasmide-oplossing. Het bedrag van de plasmide oplossing is genoeg om 1 x 106 cellen transfect. Bereiden van verschillende dergelijke aliquots.
    6. Opslaan van alle aliquots bij-80 ° C.
  2. Bereiden van doelstelling cultuur platen
    1. Jas van een 6-well plaat met vitronectin – Voeg 1 mL vitronectin verdunning buffer in elk putje en meng in 40 µL van Doompixie stockoplossing (1 µg/cm2). Bij kamertemperatuur (RT) of in de incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur verlaten.
    2. Vacuüm-aspirate de oplossing met behulp van een precisiepipet Pasteur en 2 mL AFMC voedingsbodem in elk putje te vervangen. Opslaan bij 37 ° C, totdat de cellen moeten worden verguld.
      Opmerking: Belangrijk: The AFMC medium gebruikt in deze stap moet niet bevatten geen antibiotica of antimycotic oplossingen.
  3. Oogst gekweekte primaire AFSC/AMSC
    Opmerking: Uitbreiden AFSC/AMSC in cultuur genoeg te maken van bevroren voorraden op een lage passage nummer en wijden een T-75 kolf gedurende de herprogrammering. Sinds zo weinig als 100.000 cellen zijn voldoende voor een experiment, gericht op het oogsten ongeveer 500.000 cellen ter compensatie van verliezen en optimalisatie van de transfectie parameters of verschillende kweekomstandigheden bent te beproeven.
    1. Oogst de AFSC/AMSC met cel detachement enzym mix zoals beschreven in stap 1.3.1 aan 1.3.2 op de vroegste gemak bij een lage passage. Nadat de cellen hebben gecentrifugeerd is, gaat u verder met de volgende stap.
    2. Resuspendeer de pellet in 1 mL PBS en meng goed te wassen serum onderdelen. Met behulp van een hemacytometer cellen tellen. Aanpassen van de celdichtheid aan 100.000/mL PBS en aliquot in 1,5 mL microcentrifuge buizen. Dit zorgt ervoor dat alleen een minimale contacttijd tussen de cellen en de buffer die wordt gebruikt voor Transfectie.
    3. De buis van de microcentrifuge op de top van polystyreen buizen van 5 mL (zoals adapters, zal toestaan centrifugeren in de rotor van een normale swing) en centrifuge op 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Omkeren van de buizen en verwijder het supernatant in een afvalcontainer. Gebruik niet de rotor van een vaste-hoek.
    4. Voer een extra centrifugeren stap bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Hierdoor zal de resterende vloeistof van de wanden van de buis om te verzamelen aan de onderkant. Zorgvuldig gecombineerd allemaal met behulp van een precisiepipet 200 µL.
  4. Transfectie met herprogrammering van plasmiden
    1. Voor herprogrammering experimenten, zal een systeem van transfectie (Zie Tabel van materialen) worden gebruikt voor herprogrammering plasmiden in de cellen. Uiteinden voor transfectie, transfectie buizen, resuspensie buffer en elektrolytische buffer in de weefselkweek kast plaatsen. De kit reagentia worden gehouden op RT totdat ze worden geopend, dan ze bij 4 ° C. opgeslagen worden
      Opmerking: We gebruiken de 10 µL-versie van de kit.
    2. Verplaats het apparaat van de transfectie sluiten zodat haar metrostation direct in de kast geplaatst kan worden. Vul één transfectie buis met 3 mL elektrolytische buffer en monteren van de buis in het station door te drukken het helemaal in de sleuf.
    3. Neem de herprogrammering plasmide oplossing aliquots bereid in stap 2.1.5 uit-80 ° C-opslag en laten ontdooien op RT in het kabinet cultuur.
    4. Op de transfectie apparaat, selecteert u de volgende parameters van de transfectie: 950 V, 40 ms, en 1 puls.
    5. Resuspendeer de pellet met 100.000 cellen in 10 µL resuspensie buffer. Werken snel vanaf dit punt op omdat resuspensie buffer licht giftig is en een verhoogde blootstellingstijd in een aanzienlijk lagere levensvatbaarheid van de cellen resulteert.
    6. Meng 1/10 van de herprogrammering plasmide-oplossing (de oplossing aliquoot was bereid voor een totaal van 1 x 106 cellen).
    7. Monteren van een tip van de transfectie op de transfectie pipet.
    8. Gecombineerd de celsuspensie in de transfectie tip zorgvuldig, vorming van luchtbellen vermijden. Als bubbels worden waargenomen, het verdrijven van de opschorting en herhaalt de aspiratie. Luchtbellen zal transfectie belemmeren.
    9. De transfectie pipet in de buis van de transfectie invoegen en druk op de knop "START" op het scherm van het apparaat van de transfectie. Wacht tot het bericht op het scherm te informeren over het succes van de transfectie en verwijder de pipet uit de buis onmiddellijk.
    10. Het verdrijven van de schorsing in 1 goed van de doelstelling 6-well plaat bereid in punt 2.2. Meng in het medium van een naburige goed en gelijkmatig moeten verdelen van de schorsing in beide wells (de resulterende celdichtheid zullen 50.000 per putje).
    11. Herhaal de transfectie voor alle microcentrifuge buizen met AFSC/AMSC afzonderlijk. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Cultuur van transfected AFSC/AMSC
    1. Cultuur transfected cellen voor 2-5 dagen. Schakel over naar de herprogrammering medium bestaande uit E8 aangevuld met 100 µM van natrium butyraat op dag 3.
      Opmerking: Secundaire passage kan worden uitgevoerd om te voorkomen dat de overmatige groei van de bron AFSC/AMSC. Echter zal het passaging uitschakelen van de optie voor de berekening van de herprogrammering efficiëntie correct als deze parameter van belang is.
    2. Wijzig het herprogrammering medium elke dag in elke andere dag gedurende 10 dagen. Het medium elke dag vanaf dag 10 op wijzigen.
  6. Handmatig plukken van volledig reprogramed kolonies voor klonen uitbreiding
    1. Volledig geherprogrammeerde kolonies verschijnen rond dag 14. Toestaan kolonies uit te breiden in grootte en compact geworden. Ze kunnen handmatig worden geplukt en overgedragen aan de verse platen zo spoedig dag 15-16.
    2. 1 uur vóór de procedure plukken, 24-Wells-platen met 8 µL van Doompixie in 300 µL van vitronectin verdunning buffer per putje (1 µg/cm2) jas en Incubeer bij RT of 37 ° C. De oplossing wordt vervangen door E8 medium zonder natrium butyraat.
    3. Selecteer kolonies van een voldoende groot formaat (liefst meer dan 400 µm in diameter) in een steriele cultuur kabinet. Een fasecontrastmicroscoop of een stereomicroscoop kan worden gebruikt.
    4. Om te worden gepickt, zal een LCD imaging Microscoop geplaatst in het kabinet worden gebruikt, aangezien haar monitor de noodzaak voor lenzen elimineert. Steriliseren van het stadium van de microscoop met 70% ethanol.
    5. Met behulp van een reguliere fase contrast Microscoop voor de cultuur van de cel, selecteert u markeren en noteer het nummer van de kolonies worden gepickt. Dit is belangrijk om ervoor te zorgen dat er tijd is niet verloren voor dit proces tijdens het werkelijke oprapen.
    6. Vul een aantal PCR buisjes die gelijk is aan of groter is dan het aantal kolonies te picken met 30 µL van 0.5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS. Kolonies zal worden geplaatst in deze buizen voor gedeeltelijke dissociatie voordat plating.
    7. Wilt Kies 5 kolonies tegelijk aan de platen met behulp van een precisiepipet van de 10 µL ingesteld op 2 µL. Houd het uiteinde van de pipet op een hoek aan de rand van de kolonie en zorgvuldig en geleidelijk Schraap de hele kolonie vandoor naar de oppervlakte. Onmiddellijk de hele kolonie gecombineerd in het uiteinde van de pipet en breng dit in een van de voorbereide PCR buizen met EDTA.
    8. Herhaal met de overige 4 koloniën. Incubeer bij RT gedurende 4-6 min.
    9. Pipetteer de schorsing op en neer de voorzichtig met behulp van een grotere pipette uiteinde naar de kolonie opsplitsen in kleinere klontjes. Vermijd het maken van een enkele celsuspensie.
    10. Plaat de schorsing rechtstreeks in een streefcijfer goed van een plaat van de 24-well bereid in stap 2.6.2. Herhaal met de resterende koloniën.
    11. Herhaal stap 2.6.6 via 2.6.10 als meer dan 5 kolonies worden geplukt maar kies niet meer dan 5 kolonies tegelijk. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Klonen expansie en rijping van iPSC
    1. Toestaan kolonies te groeien en compact. 3-6 dagen zijn voldoende. Het kweekmedium dagelijks veranderen. Gebruik tussen 400 µL en 1 mL E8 voedingsbodem op basis van de celdichtheid.
    2. Putjes van de plaat 24-well met een voldoende dichtheid van de kolonie zullen worden uitgebreid tot 6-Wells-platen. 1 h voor passaging, coat de 6-Wells-platen met Doompixie (zoals in stap 2.2.1). Vervang de oplossing in de put door 2 mL E8 voedingsbodem per putje.
    3. Het gebruikte medium uit de putten van de bron met behulp van een precisiepipet 1 mL gecombineerd en vervangen met 300 µL van 0.5 mM EDTA te wassen. Gecombineerd onmiddellijk het gebruik van de dezelfde Pipetteer tip en opnieuw vervangen door 300 µL van 0.5 mM EDTA, dan Incubeer bij RT voor 5 min. gecombineerd alle vloeistof met behulp van een precisiepipet 1 mL.
    4. De 1 mL pipet ingesteld op capaciteit, een 1 mL wide-boring tip over het monteren en gecombineerd het E8-medium van het doel goed in de tip. Het bronpakket iPSC cultuur afwassen met een stroom van het medium.
    5. Spoel de suspensie in de doelgroep goed en Pipetteer op en neer meerdere malen te breken van de kolonies in bosjes van 20-50 cellen. Zorg ervoor dat ze krijgen gelijkmatig verdeeld in de put door zachte wiegen en schudden van de plaat en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
    6. Verandering het medium dagelijks en passage elke 3 tot 4 dagen. Een onderscheidende koloniën onder de fase contrast-Microscoop kunnen worden gemarkeerd en verwijderd met behulp van een pipet tip in het kabinet cultuur. Dit zorgt voor selectieve verspreiding van hoge kwaliteit pure iPSC cultuur.
    7. 1 h voor passaging, coat de putjes van de plaat van een 6-well met Doompixie zoals in stap 2.2.1. Vervolgens vervangen door de oplossing 2 ml E8 voedingsbodem per putje.
    8. Routine passaging is vergelijkbaar met de eerste passaging gedaan met behulp van 0.5 mM EDTA (stappen 2.7.2 aan 2.7.5). Vervang verbruikte medium in een put van een 6-well plaat met 1 mL EDTA te wassen en te negeren.
    9. Voeg 1 mL EDTA en Incubeer bij RT gedurende 5-7 min. voor gedeeltelijke dissociatie. Optimaliseren van de incubatietijd als nodig ervoor te zorgen dat een opschorting van rond 20-50-cel in bosjes wordt geproduceerd. Vermijd dissociatie in afzonderlijke cellen.
    10. Negeren van de EDTA-oplossing en gecombineerd 1 mL van het medium van de E8 met behulp van een pipet 1 mL van het doel goed in een wide-boring pipette uiteinde.
    11. Wassen van de zendende iPSC cultuur met een stroom van het medium E8 herhaaldelijk tot een gewenste deel ervan werd vrijgegeven van het oppervlak af en breng in het doel goed. Dit gedeelte vertegenwoordigt de splitsingsverhouding (bv1/8 van de cultuur kan worden overgebracht voor een verhouding van 1:8.)
    12. Passage elke 3-4 dagen. Toestaan van iPSC lijnen te rijpen door kweken ze voor ten minste 15 passages voordat u ze gebruikt in downstream experimenten

3. karakterisering en bevestiging van pluripotent

Opmerking: Kijk naar de aanvullende bestanden voor meer informatie op stroom cytometry en confocale microscopie.

  1. Teratoom vorming assay
    1. Om te bepalen van de capaciteit van iPSC om te differentiëren in weefsels representatief is voor alle drie lagen van de kiem door Teratoom vorming assay, volg de institutionele beleidslijnen met betrekking tot de verzorging van de dieren en het gebruik, vooruit te plannen om tijd voor het indienen van het juiste protocol te geven documenten. De vorming van de Teratoom in muizen vindt tussen 6-10 weken.
    2. Cultuur 4 putjes van de plaat van een 6-well per iPSC regel voor 4 dagen. Het geschatte aantal cellen geïnjecteerd in één flank van een muis is 0,5 tot 1 x 106 cellen. Optioneel: extra goed kan worden gewijd aan een representatieve celaantal in een goed te bepalen door middel van eencellige dissociatie met een mobiele-detachement enzym en tellen.
    3. Berekenen van het volume van het mengsel van de E8/BMM de iPSC bosjes zal worden geschorst in: beide flanken van een muis worden geïnjecteerd, elk met 150 µL van schorsing van de klomp. Drie muizen zijn voldoende om te testen Teratoom vorming van één iPSC regel. Neem een extra 150 µL per naald in het resulterende volume om dood volume verlies te compenseren. 1 naald per muis wordt gebruikt. Het totale volume is dus 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. Gedeeltelijk distantiëren de iPSC kolonies met EDTA alsof zij worden gepasseerd, moesten zoals beschreven in de stappen punt 2.7.8 aan 2.7.10. Het is belangrijk dat de koloniën worden losgekoppeld in klontjes en niet in afzonderlijke cellen gescheiden.
    5. Wash uit de iPSC kolonies met 675 µL van E8-medium (de helft van de berekende volume worden gecontroleerd vanaf stap 3.3.3), met behulp van een tip wide-boring. Spoel de suspensie van klomp in een polystyreen tube van 5 mL. Plaats op het ijs.
    6. Combineren met 675 µL van BMM. Houden de resulterende schorsing op ijs totdat de injectie.
    7. Anesthetize van de muizen om ze te immobiliseren met behulp van Isofluraan. Dit moet worden uitgevoerd of begeleid door gekwalificeerd personeel van het terrarium.
    8. Vortex de polystyreen 5 mL tube kort en de opschorting van de klomp (450 µL per muis) gecombineerd in één insuline spuit uitgerust met een naald 22 G. 150 µL van de celsuspensie subcutaan injecteren. Ongeveer 1 x 106 cellen (zie stap 3.1.2) bevat dit volume.
    9. Injecteren 3 muizen per iPSC regel. Verzorging van de dieren van de goede praktijken voor alle procedures volgen.
    10. De gezondheid van de muizen dagelijks controleren.
    11. Wanneer de teratomas een eindpunt diameter van 1,5 tot 2 cm bereikt, euthanaseren van de muizen, explant van de teratomas en bewaar ze in formaline oplossing voor fixatie van het weefsel gedurende 24 uur.
    12. De vaste teratomas brengen een histologie kern faciliteit voor Haematoxyline eosine (H & E) kleuring. Een patholoog zal rang de aanwezigheid van weefsels van alle drie lagen van de kiem.
      Opmerking voor Karyotyping: Live iPSC culturen worden geleverd gespecialiseerd cytogenetische laboratoria voor het testen van de integriteit van het karyotype. Het wordt aanbevolen dat deze testen worden uitgevoerd elke 5 passages.
  2. Transcriptionele profilering
    1. Cultuur 2 putjes van de plaat van een 6-goed voor 3-4 dagen te verkrijgen van een RNA monster. Gebruik alleen hoge kwaliteit culturen, secundaire besmetting met differentiatie van cellen kan worden aangepakt door ze met behulp van een pipet tip schrapen.
    2. Isoleren RNA van iPSC culturen met behulp van een commercieel beschikbare kit volgens protocol van de fabrikant. Schip monsters aan de inrichting van een gespecialiseerde genomic kern.
    3. Het verkrijgen van de wereldwijde transcriptionele profielen van de iPSC-lijnen met behulp van microarrays (Zie Tabel van materialen voor ondersteunde keuzes) of RNA sequencing.
    4. "*.Idat" bestanden voor bioinformatic beoordeling van pluripotent via een online interface bij het Coriell Instituut indienen. U kunt ook indienen "* .cel" bestanden voor bioinformatic identificatie van celtype, met inbegrip van pluripotente stamcellen, via een online interface aan de Johns Hopkins University. Zie Tabel van materialen voor meer informatie over de soorten gegevens die de individuele bioinformatic assays accepteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnformeerde schriftelijke toestemming is verkregen uit patiënten vóór het oogsten van vruchtwater voor genetische testende doeleinden en een kleine hoeveelheid van de vloeistof voor onderzoek wijden. Geen toestemming is vereist voor het gebruik van het vruchtwater membraan in onderzoek als de placenta medisch afval vertegenwoordigt. Vruchtwater vloeistof en membraan stamcellen beeldschermeigenschappen typische mesenchymale, morfologisch hun cellen zijn spindel-vormig en fase-licht. Na h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste fase van iPSC generatie van foetale stamcellen impliceert de extractie van de broncellen van de foetale weefsels, hun cultuur, expansie en invoering van de episomal herprogrammering plasmiden. Deze fase wordt gevolgd door een periode van de cultuur van ongeveer 14-18 dagen voordat de eerste volledig geherprogrammeerde kolonies kunnen worden uitgebreid. De laatste fase is de rijping van de iPSC-klonen. De eerste extractie van cellen van de stam van het vruchtwater membraan wordt bereikt door middel van een gecom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Fonds Medizinische Forschung aan de Universiteit van Zürich, Forschungskredit van de Universiteit van Zürich, The SCIEX NMSCh onder Fellowships 10.216 en 12.176, de Zwitserse Society of Cardiology, de Zwitserse nationale wetenschap Stichting onder Grant [320030-122273] en [310030-143992], het 7de kaderprogramma, leven ventiel, Europese Commissie onder Grant [242008], de Olga Mayenfisch Stichting, de Stichting EMDO, de Start-up subsidie 2012 van het universiteitsziekenhuis Zurich, en interne financiering van de Mitchell Cancer Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tumor Dissociation Kit, humanMiltenyi Biotec130-095-929weefseldissociatiesysteem, reagent kit, inclusief weefseldissociatiebuizen en weefseldissociatie-enzymen
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235weefseldissociatiesysteem, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm)Thermo-Fisher3120032
70 µm cell strainersCorning10054-456
RPMI 1640 mediumThermo-Fisher32404014 
rocking platformVWR40000-300
50 ml centrifuge tubesThermo-Fisher339652
15 ml centrifuge tubesThermo-Fisher339650
EBM-2 basal mediumLonzaCC-3156basale medium voor AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated)Prospec BioCYT-218bFGF, supplement voor AFMC medium
EGF Human, PichiaProspec BioCYT-332 EGF, supplement voor AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human RecombinantProspec BioCYT-022IGF, supplement voor AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualifiedThermo-Fisher10439024FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo-Fisher15240062 voor primaire AFSC/AMSC, voor routine AFSC/AMSC zou het niet nodig moeten zijn, niet gebruiken in medium voor getransfecteerde cellen!
Accutase cell detachment solutionStemCell Technologies07920celdetacheringsenzym
CryoStor™ CS10StemCell Technologies07930compleet invriesmedium
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362voor plasmide-isolatie
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, reprogrammeringsfactoren Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, reprogrammeringsfactoren Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, reprogrammeringsfactoren c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis SpectrophotometerThermo-FisherND-2000Cspectrofotometer
Neon® Transfection SystemThermo-FisherMPK5000transfectiesysteem, componenten:
Neon pipette - transfectiepijpe
Neon device - transfectieapparaat
Neon® Transfection System 10 µL KitThermo-FisherMPK1025verbruiksartikelenkit voor het Neon Transfectiesysteem, het bevat:
Neon tip - transfectietip
Neon tube - transfectiebuis
buffer R - resuspenderingsbuffer
buffer E - elektrolytische buffer
Stemolecule™ Sodium ButyrateStemGent04-0005kleine molecuulversterker van reprogrammering
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 medium
Vitronectin XF™StemCell Technologies07180VTN, stockconcentratie 250 µg/ml, gebruikt voor coating op 1 µg/cm2 in vitronectin verdunningsbuffer (CellAdhere)
CellAdhere™ Dilution BufferStemCell Technologies07183vitronectin verdunningsbuffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020verdun met PBS tot 0.5 mM voor gebruik
EVOS® FL Imaging SystemThermo-Fisher ScientificAMF4300LCD beeldvormingsmicroscoopsysteem
CKX53 Inverted MicroscopeOlympusfasecontrast celcultuurmicroscoop
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo-Fisher28908verdun tot 4% met PBS voor gebruik, verdund kan 1 week bij 2-8 °C worden bewaard
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050permeabilisatiebuffer, koel tot -20 °C voor gebruik
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782isotypecontrole voor Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783isotypecontrole voor Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617isotypecontrole voor TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618isotypecontrole voor TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129isotypecontrole voor SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321isotypecontrole voor SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor®

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

VruchtwatercellenMesenchymale Stamcellen uit het VruchtvliesEpisomale HerprogrammeringChemisch Gedefinieerde ConditiesHumaan Recombinant VitronectineE8 mediumFlowcytometrieConfocale BeeldvormingTeratoomvormingTranscriptionele Profilering

Gerelateerde artikelen