Method Article

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

DOI:

10.3791/56010

⸱

July 31st, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hele-cel patch klem is de gouden standaard methode om de elektrische eigenschappen van enkele cellen te meten. De in vitro patchclamp blijft echter een uitdagende en low-throughtechniek vanwege de complexiteit en hoge afhankelijkheid van gebruikersoperatie en -controle. Dit manuscript demonstreert een beeldgeleid automatische patchclamp systeem voor in vitro full-cell patch clamp experimenten in acute hersenplakken. Ons systeem implementeert een computergebaseerd algoritme om fluorescente gelabelde cellen te detecteren en te richten op volautomatische patches met behulp van een micromanipulator en interne pipetdrukregeling. Het gehele proces is zeer geautomatiseerd, met minimale eisen voor menselijke interventie. Realtime experimentele informatie, inclusief elektrische weerstand en interne pipettedruk, worden elektronisch gedocumenteerd voor toekomstige analyse en voor optimalisatie voor verschillende celtypen. Hoewel ons systeem wordt beschreven in het kader van acute braiN snijopnamen, kan het ook worden toegepast op de geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp van gedissocieerde neuronen, organotypische snijculturen en andere niet-neuronale celtypes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De patch clamp techniek werd in de jaren 1970 ontwikkeld door Neher en Sakmann om de ionische kanalen van excitabele membranen 1 te bestuderen. Sindsdien is patchclamping toegepast op de studie van veel verschillende onderwerpen op het cellulaire, synaptische en circuitniveau - zowel in vitro als in vivo - in veel verschillende celsoorten, waaronder neuronen, cardiomyocyten, Xenopus-oocyten en kunstmatige liposomen 2 . Dit proces omvat de juiste identificatie en targeting van een cel van belang, ingewikkelde micromanipulatorbesturing om de patchpipet in de nabijheid van de cel te bewegen, de toepassing....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Systeeminstelling

  1. Constructeer de drukregelaar.
    1. Monteer de drukregelaar volgens de schakelkaart ( Figuur 1 ). Soldeert de benodigde onderdelen op de printplaat (PCB) die is vervaardigd volgens de elektrische schema's ( Figuur 1b ). Gebruik standaard weerstanden, LED's, Metaal-Oxide Semiconductor Field-Eeffect Transistors (MOSFET's), condensatoren en connectoren (zie de Tabel van Materialen ). Soldeerseloïde kleppen op de printplaat. Sluit de luchtpomp en de luchtdruksensor aan op de printplaat met elektrische draad.
      OPMERKING: Het duurt ongeveer 2 uu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons systeem is getest op het vermogen om cellen in acute hersenplakken te plakken, met muis geïnduceerde Pluripotent Stamcellen (iPSC's) die gedifferentieerd zijn in neuronen, en HEK 293 cellen kunstmatig kanalen van belangstelling uitdrukken. Figuur 3 toont een experiment met behulp van Thy1-ChR2-YFP transgene muizen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), gericht op fluorescent gelabelde laag 5 pyramidale neuronen in de visuele cortex. De doelc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode voor automatische beeldgeleide patchclamp opnames in vitro . De belangrijkste stappen in dit proces worden als volgt samengevat. Ten eerste wordt computervisie gebruikt om de pipettip automatisch te herkennen met behulp van een reeks beelden die via een microscoop zijn verkregen. Deze informatie wordt dan gebruikt om de coördinaat transformatie functie te berekenen tussen de microscoop en de manipulator coördinatensystemen. Computervisie wordt gebruikt om fluorescent gelabelde ce.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een niet-voorlopige octrooiaanvraag "SYSTEMEN EN METHODEN VOOR AUTOMATISCHE BEELD-GELEIDE PATCH-CLAMP ELECTROPHYSIOLOGY IN VITRO", US-serienummer: 15 / 353.719, werd ingediend op 16 november 2016, Ref. Nr .: PRF 67270-02.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar voor de financiële steun van de Whitehall Foundation. We willen Samuel T. Kissinger bedanken voor de waardevolle opmerkingen.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCD CameraQImagingRolera Bolt
Electrophysiology rigScientificaSliceScope Pro 2000Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
AmplifierMolecular DevicesMultiClamp 700Bcomputer-controlled microelectrode amplifier
DigitizerMolecular DevicesAxon Digidata 1550
LED light sourceCool LEDpE-100488 nm wavelength
Data acquisition boardMeasurement ComputingUSB1208-FSSecondary DAQ.
See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valvesThe Lee Co.LHDA0531115H
Air pumpVirtual industryVMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensorFreescale semiconductorMPXV7025G
Slice hold-downWarner instruments64-1415 (SHD-40/2)Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
PythonAnacondaversion 2.7 (32-bit for windows)https://www.continuum.io/downloads
Screw TerminalsSparkfunPRT - 08084Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 ASparkfunCOM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-PinSparkfunPRT-07937
LED - Basic Red 5 mmSparkfunCOM-09590
LED - Basic Green 5mmSparkfunCOM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)SparkfunPRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mASparkfunTOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)SparkfunPRT-11367
Locking Male x Female x Female StopcockARK-PLASRCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible TubingsFisher scientific14-171-129Outer Diameter: 1/8 in.
Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cableBelkin ComponentsF3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)Radioshack2711116
PicospritzerGeneral ValvePicospritzer II

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Patch ClampImage Guided Patch ClampWhole Cell Patch ClampAcute Brain SlicesComputer Vision AlgorithmFluorescent Cell DetectionMicromanipulator ControlInternal Pipette PressureElectrical Resistance MonitoringGigaseal Formation

Related Articles