Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Samenvatting

Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.

Samenvatting

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om eiwitbinding aan chromatine DNA te bepalen. Vezelrijke skeletspier is echter een uitdaging voor ChIP door technische moeilijkheden in isolatie van hoogwaardige kernen met minimale verontreiniging van myofibrillen. Vorige protocollen hebben geprobeerd nuclei te zuiveren alvorens te verbinden, wat het risico op veranderde DNA-eiwitinteractie tijdens het langdurige nucleaire bereidingsproces oplevert. In het huidige protocol hebben we eerst het skeletspierweefsel dat uit muizen is verzameld, versterkt en de weefsels werden gehakt en gesoneerd. Aangezien we ontdekten dat ultracentrifugatie niet in staat was kernen uit myofibrillen te scheiden met behulp van verknoopt spierweefsel, hebben we een sequentiële filtratieprocedure ontwikkeld om kwalitatief hoogstaande kernen te verkrijgen zonder significante myofibrilverontreiniging. Vervolgens bereidden we chromatine door gebruik te maken van een ultrasonicator, en ChIP assays met anti-BMAL1 antilichaam onthulde robuuste circadiaanse bindingPatroon van BMAL1 om genpromotoren te targeten. Dit filtratieprotocol vormt een gemakkelijk toepasbare methode om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren uit kruisgebonden skeletspierweefsel, waardoor consistente monstervoorbereiding voor circadiaanse en andere tijdgevoelige studies mogelijk is. In combinatie met volgende generatie sequencing (NGS) kan onze methode worden ingezet voor diverse mechanistische en genomische studies die zich richten op de spierfunctie.

Inleiding

Skeletspieren spelen belangrijke rol in fysiologie en gedrag. De multi-nucleated spiervezel bestaat uit myofibrillen waar actine en myosine functionele eenheden vormen die sarcomeren noemen om contractiele kracht te genereren. Skeletspier is ook het grootste metabolische orgaan in het lichaam, met als resultaat> 80% postprandiale glucose-inname en het reguleren van insuline respons en metabolische homeostase ^{1 , 2} . Spierfysiologie en metabolisme worden nauw geregeld door de circadiaanse klok, een intrinsieke biologische timer ^{3 , 4 , 5 , 6} . Bijvoorbeeld, de skeletspierspecifieke deletie van Bmal1 , een van de kerncircadische klokcomponenten, resulteerde in insulineresistentie en verminderde glucoseopname in de skeletspier, en de dieren bleken type 2-diabetes te ontwikkelen ⁷ . ikN aanvulling wordt de skeletspier ook steeds meer gewaardeerd als een endocriene orgaan ⁸ , die myokines uitscheidt om systemisch metabolisme en fysiologie te reguleren. Mechanistische studies zijn nodig om deze regulerende functies in de skeletspieren volledig te begrijpen.

ChIP is een krachtige aanpak voor het werven van DNA-bindende eiwitten. ChIP werd aanvankelijk ontwikkeld om nucleosoomorganisatie op chromatine DNA ^{9 , 10} te identificeren. Verschillende methoden zijn sindsdien gemeld aan crosslink-eiwitten en chromatine-DNA met behulp van formaldehyde, dimethylsulfaat of ultraviolette bestraling (UV) ^{11 , 12} . Formaldehyde verknoping is de meest gebruikte, conserverende chromatine structuur en DNA-eiwit interacties ^{9 , 13 , 14} . Cross-linked chromatografieIn wordt gesnipperd door sonicatie en immunoprecipiteerd met antilichaam tegen het specifieke DNA bindende eiwit van belang ^{15 , 16} . In de afgelopen jaren is ChIP-sequencing (ChIP-seq), een methode die ChIP combineert met NGS, ontwikkeld om genoom-brede transcriptiefactorbinding ¹⁷ te ondervragen en in sommige gevallen dynamische veranderingen te bewaken over een tijdschool ^{18 , 19 , 20} . Bijvoorbeeld hebben circadiaanse ChIP-seq-studies een zeer georkestreerde sequentie van genomische binding van circadiaanse klokcomponenten en histonmarkers aangetoond, die tijdelijk nauwkeurige genexpressie in de 24 uur circadiacyclus ^{18 verricht} .

De meeste beschikbare ChIP-protocollen zijn ontworpen voor zachte weefsels ( bijv. Lever, hersenen, enz. ) En zeer weinig zijn gepubliceerd voor harde weefsels, waaronder skeleTal spier. Het is technisch uitdagend om vezelrijke skeletspieren te homogeniseren en hoogwaardige kernen ^{21 te} isoleren, vooral voor ChIP-experimenten die kruisverbindingen vereisen. In een recente ChIP-studie ^{22 van de} spier werden satellietcellen gescheiden van myofibers, en kernen werden bereid uit beide celtypes door middel van een langdurige procedure waarbij weefselvertering bestond. Het gehele proces duurde ongeveer drie uur om te voltooien voordat formaldehyde verknoping werd uitgevoerd op geïsoleerde kernen. Terwijl deze procedure vermijdt spiervezels crosslinken, waardoor spierweefsel nog meer vuurvast is tegen efficiënte homogenisatie en in staat was hoge kwaliteitskernen te produceren, veroorzaakt de significante tijdsverlaging van weefselverzameling naar nucleïne-crosslinking het risico op veranderd DNA -proteïne interactie. In tegenstelling hiermee hebben de meeste studies onmiddellijk na experimentele behandeling of weefselverzameling crosslinking uitgevoerd om de real-time DNA-protei te behoudenN bindend ¹² . Een tweede nadeel van nucleïneisolatie voor kruisverbindingen is dat het tijdsgevoelige toepassingen voorkomt, zoals circadiaanvangsverzameling die typisch voorkomt bij intervallen van 3 - 4 uur. Zonder de kernen te verbinden, moet de isolatie direct na dissectie doorgaan, terwijl de cross-linked monsters samen kunnen worden verwerkt nadat de volledige tijdsoort is afgerond, waardoor de experimentele consistentie groter wordt.

Andere protocollen voor nucleïneisolatie van ongekruiste skeletspier zijn ook gemeld. Twee studies beschrijven het gebruik van gradiënt-ultracentrifugatie om scheidende kernen te scheiden van overgebleven myofibrillen en celresten ^{23 , 24} . Terwijl sukrose of colloïdale gradiënt ultracentrifugatie effectief is met ongekruiste spierweefsels, hebben onze experimenten aangetoond dat na de verknoping van de gradiënt de gradiënt ultracentrifugatie niet in staat was kernen van cel d te scheidenEbris op de gradiënt.

We hebben daarom een ​​procedure ontwikkeld om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren met behulp van kruisgebonden spierweefsels van het skelet. In plaats van de ultracentrifugatie van de gradiënt, hebben we een seriefiltreringsmethode ontwikkeld om de kernen van puin effectief te scheiden. Na ultrasonicatie werden de chromatinmonsters succesvol toegepast voor ChIP-studies, die een circadiaan patroon van BMAL1-eiwitbinding aan doelpromotors toonden. Onze methode kan breed toepasselijk zijn op diverse mechanistische studies van spierweefsels.

Protocol

Dierenzorg werd uitgevoerd in het kader van de richtlijnen voor de instandhouding van dierenartsen en gebruikscommissie (IACUC), en de procedures werden uitgevoerd volgens een dierprotocol dat door het University of Texas Health Science Center in Houston is goedgekeurd.

1. Nucleaire isolatie van de cross-linked skeletspier

1. Weef- en maalvleesklier-skeletspier, geïsoleerd uit ongeveer 20 weken oude C57BL / 6 mannelijke muizen, in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zoals eerder beschreven in het voorgaande ²² .
   OPMERKING: We krijgen meestal 1,0 - 1,5 g skeletspier van één muis.
   1. Plaats gemalen skeletspierweefsel in een 50 ml conische buis die 10 ml PBS op ijs bevat.
2. Centrifugeer bij 300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
3. Verwijder PBS supernatant zorgvuldig door aspiratie.
4. Schat pelletvolume in elke 50 ml buis door gebruik te maken van referentiebuizen met 1, 2, 3 en 4 ml water.
5. Voeg 7 volumes vanIjskoud 1% formaldehyde in PBS en homogeniseer de monsters op ijs met behulp van een sondeweefselhomogenisator (zie tabel van materialen ).
   OPMERKING: Optioneel: De homogenisatieprocedure kan in een koude kamer worden uitgevoerd.
6. Verbind het monster door incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
7. Blus de kruisverbindingsreactie door de toevoeging van 1 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Centrifugeer de monsters bij 3 000 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant via aspiratie.
9. Spoel met 10 ml ijskoude base buffer (10 mM HEPES-KOH bij pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) bevattende vers toegevoegde proteaseremmers (0,2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) , En 10 ug / ml leupeptine). Centrifugeer bij 3 000 g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig door aspiratie.
10. Resuspendeer de pellet in 6 ml lysisbuffer (10 mM HEPES-KOH op pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) die vers toegevoegde protease remmers bevatten (0,2 mM PMSF en 10 ug / ml leupeptine).
11. Breng het monster over naar een voorverpakte 15 mL Dounce homogenizer en incubeer 10 minuten op ijs. Ontleed elk monster op ijs met 15 trage strepen met losse stamper, gevolgd door 15 strepen met strakke stamper om de kernen vrij te geven.
12. Filtreer het homogenaat (6 ml) door de celfilter (poriegrootte: 100 μm) en spoel met 4 ml lysisbuffer. Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in 5 ml ijskoude basisbuffer en doei 10 keer met strakke stamper om kernen vrij te geven.
    1. Verwijder een aliquot van 20 μL voor DNA-concentratiemeting met een spectrofotometer (OD260 / OD280) en microscopische observatie met trypanblauw indien nodig (zie hieronder) ( Figuur 1A ).
13. Filter de ophanging doorEen celsuur (poriënmaat: 70 μm), spoel de buis af en filter opnieuw met 2 ml base buffer zoals hierboven.
14. Herhaal de filtratie zoals in stap 1.13 met cilinders van geleidelijk gereduceerde poriegrootte (40 μm, 30 μm, 20 μm en 10 μm).
    OPMERKING: In totaal werden stromers met 6 poriëngroottes gebruikt in stappen 1.12-1.14.
15. Centrifugeer bij 1000 g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 μl base buffer.
16. Meet de DNA-concentratie zoals hierboven.
    OPMERKING: Ongeveer 200 μg nucleair DNA werd verkregen uit het combineren van beide achterste ledematen van één dier. Optioneel, bespaar 20 μL voor microscopische observatie met trypan blue staining (voorraadconcentratie 0,4%, 1: 5 verdunning); Kernen zullen blauw vlek ( figuur 1 B ).
17. Centrifugeer bij 1000 g bij 4 ° C gedurende 10 minuten en wrijf de supernatant af. Bewaar pellet bij -80 ° C.

2. Sonication

1. Ontdooit monsters in 500 μl SDS lysis buffer en resuspendeer met zachte pipettering.
2. Breng de nucleïne-DNA-suspensie over op een glazen flesje op ijs.
3. Doe de sonicatie met gefocuste barsten van ultrasone akoestische energie uit een schotelvormige transducer. Zie tabel van materialen voor apparatuur details. Gebruik de volgende instelling: cycli per barst: 200; Intensiteit: 5; Arbeidscyclus: 20; Temperatuur 4 - 6 ° C; 30 s aan / uit.
   OPMERKING: een voorbeeld voor het evalueren van de efficiëntie van de geluidsisolatie wordt weergegeven in figuur 2 .
4. Breng de sonicated chromatine over naar een 1,5 ml buis. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 minuten en draag de supernatant over naar een nieuwe buis. Vervoer 50 μl sonicated monsters (~ 7 - 10 μg / spiermonster) in een nieuwe 1,5 ml buis voor de omgekeerde verknoping overnacht bij 65 ° C. Bevroren de resterende monsters bij -80 ° C.

3. Evaluatie van Sonication en Quantitation

1. Voeg 1.0 toeΜL RNase A (500 U / ml RNase A: 20.000 U / ml RNase T1) aan de opgeslagen 50 μl gesoneerde monsters en incuberen gedurende 30 min bij 37 ° C.
2. Voeg 8 μl protease K (10 mg / ml) toe en incubeer 30 min bij 55 ° C.
3. Oog het DNA door gebruik te maken van een DNA-extractie kit.
   1. Voeg 5 volumes bindende buffer toe, doe het aan de spoelkolom en centrifugeer bij 4.000 xg, 10 min.
   2. Breng de doorgang door op dezelfde kolom en centrifugeer opnieuw.
   3. Was met wasbuffer tweemaal bij 13.000 xg, 1 min.
   4. Centrifugeer opnieuw bij 13.000 xg, 1 min om de kolom te drogen.
   5. Voeg 50 μl H20 toe en centrifuge bij 13.000 xg, 1 min om DNA te elueren.
   6. Breng de doorgang door op dezelfde kolom en centrifugeer opnieuw.
4. Kwantificeer de hoeveelheid DNA met een spectrofotometer (OD260 / OD280). Doe monsters op 0,8% gels om de grootte en hoeveelheid (1 μg) van de geonicideerde producten te beoordelen ( Figuur 2 ).
   OPMERKING: De gemiddelde chromatine opbrengst is ongeveer ~ 20%.

4. ChIP

1. Doe de eerder opgeslagen chromatine op -80 ° C en doei de chromatine tot ~ 100 - 120 μg per buis. Verdun 1:10 met radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1x Protease-inhibitorcocktail (PIC), 0,1% Na-deoxycholaat W / v), 1% Triton X-100).
   1. Als er meerdere monsters in elke groep zijn, combineer u gelijke hoeveelheden chromatine DNA tot de uiteindelijke hoeveelheid van ~ 100 - 120 μg / monster. Bespaar 10% als invoer.
2. Voeg 40 μL (50% v / v slurry in RIPA buffer) toe van BSA-voorgeblokkeerde (~ 2 uur, 4 ° C) Proteïne A / G agarose (niet-Kip antilichaam) of IgY kralen (Kip antilichaam) en incubeer op Een rotator gedurende 3 uur bij 4 ° C.
3. Centrifugeer bij 1.000 xg, 10 minuten en zorg voorzichtig over de supernatant naar nieuwe buizen.
4. Antilichamen toevoegen aan 1 μg antilichaam per ~25 - 100 μg chromatine DNA.
5. Draai zachtjes bij 4 ° C overnacht bij ongeveer 15 rpm.
6. Voeg 10 μl BSA-voorgeblokkeerde (~ 2 uur, 4 ° C) eiwit A / G agarose (non-Chicken antilichaam) of IgY-kralen (Kippen-antilichaam) mengen en draai in de koude kamer gedurende 2 uur.
7. Was kralen als volgt. Wassen met 1 ml RIPA-buffer gedurende 3 minuten tweemaal, wassen met 1 ml hoge zoutbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) gedurende 3 min. , Wassen met 1 ml LiCl-buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoxycholaat, 0,5% NP40) gedurende 3 min.
   1. Was gedurende 1 minuut met 1 ml Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA). Dan eluteer DNA met elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA en 0,5% SDS).
8. Centrifugeer bij 1.000 g, 1 min en verwijder de supernatant zorgvuldig.
9. Resuspendeer de kraal met 50 μl elutiebuffer.
10. Incubeer voor 10Min bij 65 ° C.
11. Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 5 minuten.
12. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis, voeg nog eens 50 μL toe en centrifugeer nog eens bij 12.000 g gedurende 5 minuten. Het uiteindelijke elutie volume zal 100 μl zijn.
13. Reverse crosslinking en DNA-elutie.
    1. Incubeer het geëlueerde chromatine overnacht bij 65 ° C.
    2. Voeg 1,0 μl RNase A toe en incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C.
    3. Voeg 8 μl protease K (10 mg / ml) toe en incubeer 30 min bij 55 ° C.
    4. Oog het DNA door gebruik te maken van een PCR opruimingsset met elutievolume bij 50 μL volgens het protocol van de fabrikant.
14. Analyseer de profielen met real-time qPCR zoals eerder beschreven ^{25 , 26} .
    OPMERKING: De primer sequenties staan ​​in figuur 3 legenda . Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM ( Figuur 3 ).

Resultaten

Hier hebben we onmiddellijk na het weefselverzameling formaldehyde-cross-linking uitgevoerd om real-time DNA-eiwit interactie te behouden. We vonden echter dat sucrose of colloïdale gradiënt, die gewoonlijk wordt gebruikt voor nucleïne-isolatie ^{23 , 24} , niet effectief was bij het scheiden van kernen uit myofibrillen (gegevens niet getoond). De oorzaak kan zijn dat crosslinking dezelfde zwaartekracht verleent aan kernen en myofib...

Discussie

Hier beschrijven we een robuuste methode waarbij crosslinked skeletspierweefsels werden gebruikt om hoge kwaliteit kernen te isoleren. Sequentiële filtratie werd uitgevoerd om de kernen effectief te scheiden van puin en ultrasone akoestische energie van schotelvormige transducer scheurde de chromatine voor ChIP analyse. De resultaten toonden circadia-tijdspecifieke binding van BMAL1 aan doelpromotoren.

ChIP kan worden gebruikt om real-time eiwit bezetting op genomisch DNA vast te leggen wann...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Formaldehyde oplossing	Sigma Aldrich	F8775
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Trypan Blue oplossing (0,4%)	Fisher Scientific	15250061
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
Protease K	Sigma Aldrich	3115887001
Kip Anti-BMAL1 antilichaam			Gemaakt in kip (Cocalico Biologicals) tegen antigeen aa 318 - 579, en IgY werd gezuiverd met behulp van hetzelfde antigeen.
Kip IgY Precipiterende Hars	GenScript	L00405
Utrusting
KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Dounce weefselmolen	Whearton	357544
Falcon Cell Strainers 100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
Falcon Cell Strainers 70 µm	Fisher Scientific	08-771-1
Falcon Cell Strainers 40 µm	Fisher Scientific	08-771-2
pluriStrainer 30 µm	PluriSelect	43-50030-03
pluriStrainer 20 µm	PluriSelect	43-50020-03
pluriStrainer 10 µm	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Focused-ultrasonicator	Covaris	Model S2
Labquake	Thermo Scientific	C415110
CCD Microscoopcamera	Leica Microsystems	DFC3000 G
Reagenskit
DNA extractie kit	Thermo Scientific	K0691
Buffers
Alle buffercomponenten worden beschreven in het protocol. Elk onderdeel werd gekocht bij Sigma Aldrich