Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56016

⸱

15 augustus 2017

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

In dit artikel

Samenvatting

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.

Samenvatting

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie, de meest effectieve behandeling voor ernstige depressie. ECS induceert gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen met lage sterfte en neuronale dood en is een veel gebruikte model tot scherm anti-epileptische geneesmiddelen. Hier beschrijven we een ECS inductie methode in die een korte 55-mA stroom wordt geleverd voor 0,5 s aan mannelijke ratten 200-250 g in gewicht via oor-clip elektroden. Dergelijke bilaterale stimulatie geproduceerd etappe 4-5 klonische aanvallen die duurde ongeveer 10 s. Na de stopzetting van acute of chronische ECS sham meeste ratten hersteld te gedragsgestoorde niet te onderscheiden van "geen aanvallen" ratten. Omdat ECS wereldwijd hersenactiviteit verheft, heeft het ook te onderzoeken activiteit-afhankelijke wijzigingen van synaptic eiwitten en hun gevolgen voor synaptic kracht met behulp van meerdere methoden gebruikt. Subcellular versplintering van het postsynaptisch dichtheid (PSD) in combinatie met het westelijke bevlekken voorziet met name in de kwantitatieve bepaling van de overvloed aan synaptic eiwitten op deze gespecialiseerde synaptic structuur. In tegenstelling tot een vorige fractionering methode waarvoor grote hoeveelheid knaagdier hersenen, beschrijven we hier een kleinschalige fractionering methode om te isoleren van de PSD van de hippocampi van een enkele rat, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren. Met behulp van deze methode, laten we zien dat de geïsoleerde PSD breuk postsynaptisch membraaneiwitten bevat, met inbegrip van PSD95, GluN2B en GluA2. Synaptophysin van de presynaptische marker en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline werden uitgesloten van de PSD-breuk, tonen van succesvolle PSD isolatie. Bovendien daalde chronische ECS GluN2B expressie in de PSD, waaruit blijkt dat onze kleinschalige PSD fractionering methode kan worden toegepast om de opsporing van de wijzigingen in hippocampal PSD eiwitten uit een enkele rat na genetische, farmacologische of mechanische behandelingen .

Inleiding

Elektroconvulsieve therapie is gebruikt voor de behandeling van patiënten met grote depressieve stoornissen, met inbegrip van ernstige resistente depressie, bipolaire depressie, Parkinson ziekten en schizofrenie1,2. In deze therapie, wordt inbeslagneming gegenereerd door elektrische prikkel geleverd aan het hoofd van narcose patiënten via epicranial elektroden,1,,2,3. Herhaalde toediening van ECS is klinisch gunstig voor resistente depressieve stoornissen1,2,3. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan de lange termijn effectiviteit van het antidepressivum effect bij de mens is echter gebleven ongrijpbaar. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie en wordt veel gebruikt om te onderzoeken zijn therapeutische mechanisme. Bij knaagdieren, zowel acute ECS en chronische ECS behandeling bevorderen van volwassen neurogenesis in het hippocampi en reorganiseren van het neuraal netwerk4,5, die waarschijnlijk zullen bijdragen tot verbeteringen in cognitieve flexibiliteit is. Bovendien, global hoogte van hersenactiviteit door ECS verandert de overvloed van afschriften, zoals een hersenen afgeleide neurotrope factor6en meerdere eiwitten, met inbegrip van metabotropic glutamaat-receptor 17 en de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) type glutamaat receptor subeenheden7. Deze wijzigingen zijn betrokken bij het bemiddelen van langdurige wijziging van SYNAPS nummer, structuur en sterkte in de hippocampus7,8,9.

In ECS modellen, wordt elektrische stimulatie bezorgd bij knaagdieren via stereotaxically geïmplanteerde elektroden, hoornvlies elektroden of oor elektroden te roepen gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen10,11. Stereotaxic implantatie van elektroden hersenoperatie impliceert en vereist heel wat tijd aan het verbeteren van de experimentator chirurgische vaardigheden om te minimaliseren van de schade. Minder invasieve hoornvlies elektroden kon veroorzaken hoornvlies schuren en droogheid en anesthesie nodig. Het gebruik van oor-clip elektroden omzeilt deze beperkingen, omdat ze kunnen worden gebruikt op knaagdieren zonder chirurgie of anesthesie en minimale schade veroorzaken. Inderdaad, vonden we dat huidige geleverde te wakker ratten via de elektroden van de oor-clip betrouwbaar induceert stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen en verandert van synaptic eiwitten in hun hippocampi10.

Om te onderzoeken de ECS-geïnduceerde overvloed van synaptic eiwitten in de specifieke hersengebieden van de knaagdieren, is het belangrijk om te kiezen van de experimentele methoden die meest geschikt voor de detectie en kwantificering zijn. Subcellular versplintering van de hersenen zorgt voor de ruwe isolatie van oplosbare cytosolische proteïnen; membraaneiwitten; organel-grenzen eiwitten; en zelfs eiwitten in speciale subcellular structuren, zoals de PSD-12,13,14. De PSD is een compact en overzichtelijk subcellular domein in neuronen waarin synaptic eiwitten sterk geconcentreerd op en in de buurt van het postsynaptisch membraan12,13,15 zijn. Het isolement van de PSD is handig voor de studie van synaptic eiwitten verrijkt op de PSD, sinds dynamische veranderingen in de omvang en de functie van postsynaptisch glutamaat receptoren, steigers eiwitten en signaaltransductie eiwitten in de PSD-12 , 15 , 16 , 17 zijn gecorreleerd met synaptische plasticiteit en de synaptopathy waargenomen in diverse neurologische aandoeningen17,18. Een vorige subcellular fractionering methode gebruikt voor het zuiveren van de PSD betrokken het isolement van de breuk wasmiddel onoplosbare uit de ruwe membraan van de hersenen door de differentiële centrifugeren van sacharose verlopen14, 19. de grote uitdaging met deze traditionele methode is dat er grote hoeveelheden knaagdieren brains14,19. Voorbereiding van 10-20 knaagdieren te isoleren van de Fractie van de PSD per behandeling vereist uitgebreide kosten en tijdsinvestering en is niet praktisch haalbaar als er vele behandelingen zijn.

Om te overwinnen deze uitdaging, hebben we een eenvoudiger methode die rechtstreeks isoleert van de PSD-breuk, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren20,21, en herzien om te gelden voor PSD isolatie van de hippocampi van een enkele rat aangepast hersenen. Onze kleinschalige PSD fractionering methode levert over 30-50 µg van de PSD-eiwitten uit 2 hippocampi, voldoende voor gebruik in verschillende biochemische tests, met inbegrip van immunoprecipitation en westelijke bevlekken. Westelijke bevlekken toont het succes van onze methode voor het isoleren van de richtlijn betalingsdiensten door te onthullen een verrijking van het postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD-95) en de uitsluiting van de presynaptische marker synaptophysin en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline. Onze ECS inductie en kleinschalige PSD fractionering methoden zijn gemakkelijk aan te passen aan andere knaagdieren hersengebieden en bieden een relatief eenvoudige en betrouwbare manier om te evalueren van de effecten van ECS op de expressie van PSD eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures, met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele zorg van dieren en gebruik Comité bij de Universiteit van Illinois te Urbana-Champaign.

1. het behoud van een kolonie van de Rat

  1. Fokken van Sprague-Dawley ratten (Zie de Tabel van materialen) en handhaven in standaardomstandigheden met een 12-h licht-donker cyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water.
  2. Spenen van de rat pups op postnatale dag (P) 28, en huis ze in groepen van 2-4 mannelijke of vrouwelijke nestgenoten.
  3. Markeer de staarten van mannelijke ratten met een niet-giftige permanente zwarte marker voor identificatie.
  4. Weeg de mannelijke ratten 3 keer per week en het opnemen van hun bodyweights.

2. voorbereiding van een ECS-Machine

  1. 7:30 am, desinfecteren van de Bank in de dierlijke bereidingslokaal en plaats een ECS-machine (pulse generator) op de Bank.
  2. Plaats een afzonderlijke mannelijke rat met een gewicht van 200-250 g in een schone en lege kooi met een deksel. Herhaal dit voor alle mannelijke ratten te worden behandeld met ECS inductie. Laat de rats koeien voor 30 min.
  3. Terwijl de ratten zijn fabriekslawaai in hun kooien, een puls generator voor ECS inductie ingesteld op de frequentie van 100 pulsen/s, een pulsbreedte van 0.5 ms, de duur van een schok van 0,5 s, en een stroom van 55 mA(Figuur 1).
  4. Bereid de puls generator door de "RESET" knop te duwen en ervoor te zorgen dat de "READY" knop brandt. Zorg ervoor dat de oor-clips zijn niet gekoppeld aan een puls generator en druk vervolgens op de knop "SHOCK" voor een paar seconden.
    Opmerking: op dit punt, de pulse generator is klaar voor ECS inductie.
  5. Sluit de oor-clips op de pulse generator.

3. de inductie van Acute ECS

Opmerking: Zie Figuur 1B, bovenste paneel.

  1. NAT van de oor-clips met een steriele zoutoplossing en ervoor te zorgen dat ze zijn verzadigd.
  2. De oren van een rat met steriele zoutoplossing NAT door inwikkeling ze in zoutoplossing doordrenkte gaas. Zodra ze nat zijn, verwijder het gaas.
  3. Bevestig één clip per oor, een positie die voorbij de belangrijkste kraakbeen band.
  4. Op de ECS machine bevestigen dat een ware lus is gevestigd; Als dat niet het geval is, verschijnt een foutbericht of een lezing van "1" op de machine.
  5. Draag een dik, niet-metalen handschoen. Terwijl de rat zachtjes in een gehandschoende hand, druk op de "SHOCK"-knop voor een paar seconden en langzaam laat de grip op de rat te observeren van de inbeslagneming. Voor de schijn "geen aanvallen" (NS) controle, behandelen de rat identiek maar leveren niet de huidige.
  6. Koppel de oor-clips zoals clonus begint en het gedrag van de inbeslagneming volgens een herziene Racine schaal22 , waarin "mond en gezicht bewegingen" (fase 1), "hoofd knikken" (fase 2), "voorpoot clonus" opnemen (fase 3), "fokken met voorpoot clonus" (fase 4), en "fokken en vallen met voorpoot clonus" (fase 5). Het beslag moet duren ongeveer 10 s; record de duur van de inbeslagneming met behulp van een timer.
  7. Terug na beëindiging van de inbeslagneming, de rat naar haar kooi. De rat voor een andere 5 min om er zeker van de terugwinning van de rat uit de vangsten controleren. Houd het afzonderlijk in de kooi waren gehuisvest en de kooi terug te keren naar de recovery room.
  8. Herhaal de ECS inductie op de volgende rat.
  9. Toezicht op de rats gedurende de rest van de dag en ten minste eenmaal in de ochtend en eenmaal in de middag de volgende dag totdat zij zijn euthanized voor experimenten.
    Opmerking: De ECS inductie methode kan leiden tot klinische symptomen als een incidentele bijwerking, waaraan aandacht moet worden. Bijvoorbeeld, kon het ECS inductie protocol aanvallen die langer dan 15 s en oorzaak onnodig leed aan de ratten duren induceren. In dit geval de inbeslagneming met diazepam (10 mg/kg, i.p.) of pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.) te beëindigen. Als de ratten ontwikkelt respiratoire lijden of ernstige gedrags afwijkingen na stopzetting van de inbeslagneming, euthanaseren hen na inademing kooldioxide gevolgd door onthoofding.

4. de inductie van chronische ECS

Opmerking: Zie Figuur 1B, onderste paneel.

  1. Induceren een ECS per dag op hetzelfde tijdstip in de ochtend zoals beschreven in stappen 1-3, hierboven, voor zeven opeenvolgende dagen.
  2. Monitor de rats tweemaal een dag nadat ze worden teruggestuurd naar hun huis kooien.

5. de homogenisering en versplintering van Rat Hippocampi

Opmerking: Zie Figuur 2.

  1. Voorbereiden van een nieuwe homogenisering buffer (oplossing A), die 320 mM sacharose, 5 mM natrium pyrofosfaat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4 bevat, 200 nM "okadaic acid", en proteaseinhibitors. Filter-steriliseren van de buffer met behulp van filters met een 0,22 µm poriegrootte voor vacuüm filtratie en plaats deze op het ijs.
  2. Op een gegeven moment punt na acute ECS of chronische ECS (Figuur 1), de rat euthanaseren bij CO2 inademing gedurende 5-10 minuten, gevolgd door onthoofding met behulp van een guillotine.
  3. Verwijderen van de hersenen en het ontleden van de hippocampi op de metalen plaat geplaatst op het ijs, zoals eerder beschreven23,24.
  4. Plaats twee hippocampi van een rat op een 30-mm weefselkweek schotel en gehakt ze in kleine stukjes met behulp van schaar.
  5. Het gehakt hippocampi overbrengen in een handmatige glas homogenizer met behulp van een precisiepipet 1 mL en voeg 1 mL ijskoud homogenisering buffer (oplossing A, stap 5.1). Een ronde stamper invoegen in een glas homogenizer. Terwijl de homogenizer van het glas op ijs is, voorzichtig en gelijkmatig beroerte op en neer op de stamper 10 - 15 keer voor 1 min, tot kleine stukjes hippocampal weefsel verdwijnen.
  6. Het homogenaat overbrengen in een tube voor het microcentrifuge van 1,7 mL met behulp van een precisiepipet 1 mL en Centrifugeer het homogenaat bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C te scheiden van het postnuclear supernatant (S1 Fractie) van de pellet met onoplosbare weefsel en kernen (P1 breuk). Breng 50 µL en 950 µL van de S1 breuk twee aparte, nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buizen met behulp van een precisiepipet 1 mL en opslaan van deze buizen op ijs. Sla de P1 breuk pellet op ijs.
  7. Centrifugeer de S1 breuk (950 µL) gedurende 10 minuten op 13,800 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (S2 Fractie), verrijkt met cytosolische oplosbare eiwitten, en de pellet (P2 Fractie), verrijkt met membraan-gebonden eiwitten, met inbegrip van synaptosomal eiwitten. De S2 fractie overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.
  8. Resuspendeer de pellet (P2 breuk) in 498 µL van ijskoude gezuiverd water met behulp van een precisiepipet 1 mL. Voeg 2 µL van 1 M HEPES (pH 7.4) met behulp van een pipet 20 µL om een eindconcentratie van 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubeer bij 4 ° C met agitatie voor 30 min. winkel de geresuspendeerde P2 breuk op ijs.
  9. Bepaal de eiwitconcentratie van de S1, S2, en P2 fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL, of verwerken van de breuk P2 te isoleren van de PSD.

6. isolatie van de PSD van de ruwe membraan-eiwitoplossing (P2)

  1. Centrifugeer de P2 breuk (500 µL) voor 20 min op 25.000 x g- en 4 ° C om te scheiden van het lysed supernatant (LS2 breuk) en de lysed pellet (LP1 breuk). De breuk van LS2 overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.
  2. Resuspendeer de pellet LP1 in 250 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) gemengd met 250 µL van 1% wasmiddel in 1 x PBS buffer met behulp van een precisiepipet 1 mL. Incubeer bij 4 ° C met zachte agitatie voor 15 min.
  3. Centrifugeren van de geresuspendeerde pellet LP1 gedurende 3 uur op 25.000 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (niet-PSD Fractie) van de pellet (PSD breuk). Verwijder de bovendrijvende vloeistof tot een microcentrifuge van 1,7 mL koker en resuspendeer de pellet PSD in 100 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) met behulp van een precisiepipet 200 µL.
  4. Bepaal de concentratie van de eiwitten van de LS2, niet-PSD en PSD fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL.
    Opmerking: Alle oplossingen gebruikt in stap 5-6 (dat wil zeggen, oplossing A, HEPES-buffer en buffer PBS) moeten worden gemaakt met gezuiverde water vrij van Ionische en organische verontreinigende stoffen en deeltjes.

7. het westelijke bevlekken

  1. Ontdooi elke eiwitoplossing op ijs. 12 µL van elke breuk (S2 P2 en PSD in 1 mg/mL) overbrengen naar een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 20-µL.
  2. Voeg 3 µL van 5 x SDS monster buffer en Incubeer bij 75 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad. Koel het monster tot kamertemperatuur (RT).
  3. 10 µL van het eiwit monster in elk putje van 4-20% helling 15-well kam SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel met behulp van een precisiepipet 20 µL laden. Stel de gel in het apparaat van de SDS-pagina en op 80-100 V in rijklare buffer (0,1% SDS; 25 mM Tris en 190 mM glycine pH 8.3).
    Opmerking: Elke gel moet bevatten EiwitSteekproeven van NS ratten en ECS ratten op verschillende tijdstippen na acute of chronische ECS.
  4. De eiwitten van de SDS-pagina gel overdracht naar een membraan polyvinyl difluoride (PVDF) in het apparaat van de overdracht in 25-30 V (60 mA) voor 9-12 h in overdracht buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine en 20% methanol; pH 8.3).
  5. Verwijder het membraan PVDF uit het apparaat van de overdracht en wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 5 minuten op een multifunctionele rotator op RT.
  6. Blokkeren van de membraan in melk 5% en 0,1% Tween-20 in TBS voor 1 h. Incubeer het in primaire antilichamen (tabel 1) in wassen buffer (melk van 1% en 0,1% Tween-20 in TBS) overnachting op een multifunctionele rotator bij 4 ° C (Zie de Tabel van materialen voor verdunningen).
  7. Wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en het vervolgens uit te broeden met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundaire antilichamen in buffer voor 1 h wassen op een multifunctionele rotator op RT.
  8. Het wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en daarna bij TBS voor 5 min.
  9. Incubeer het membraan met verbeterde chemifluorescence substraat voor 1 min en worden blootgesteld aan een X-ray film. Ontwikkelen van de belichte film met een film-processor.

8. kwantificering van Western Blots

  1. Scan de Western blot als een TIFF-bestand en sla het bestand op de computer.
  2. De westelijke vlek-bestand openen in het programma ImageJ als een afbeelding in grijswaarden, onder "Bestand," "Afbeelding openen," pijl "grijstinten."
  3. Kies het rechthoekig gereedschap in de werkbalk ImageJ en teken een rechthoek dat betrekking heeft op een enkele westelijke vlek band van een proteïne van belang.
  4. Onder "Analyze," hit "Maatregel" om het gebied en de gemiddelde dichtheid van een geselecteerde band te verkrijgen.
  5. Verplaats de rechthoek naar een achtergrondgebied zonder het wijzigen van de grootte en vorm. Herhaal stap 8.4 op het gebied en de gemiddelde dichtheid van een achtergrond.
  6. Aftrekken van de waarde van de gemiddelde dichtheid van een band van de achtergrond van die van een westelijke vlek band, waardoor de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang.
  7. Herhaal stap 8.2-8,6 voor alle westelijke vlek bands van belang.
  8. Verdeel de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang door de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van een huishouding gene product, zoals α-tubuline; deze stap levert de genormaliseerde waarde van de proteïne van belang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van de gedetailleerde procedure gepresenteerd hier, een elektrische schok (55 mA, 100 pulsen/s voor 0,5 s) geleverd via oor-clip elektroden geïnduceerde niet-terugkerende stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen bij ratten (Figuur 1A-B). Een totaal 8 van ratten ontvangen van acute ECS inductie en weergegeven 4-5e etappe tonic-klonische aanvallen. De aanvallen duurde ongeveer 10 s en alle ratten binnen 1-2 min van inbeslagneming stopze...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een ECS inductie methode bij ratten die de globale stimulatie van neuronale activiteit in hun hippocampi lokt. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie, die klinisch wordt gebruikt voor de behandeling van drug vuurvaste depressieve stoornissen in mensen1,2,3. Ondanks gebruik van elektroconvulsieve therapie voor de behandeling van ernstige depressie, is de precieze onderliggende mechanisme ond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken dat Dr. Eric C. Bolton te gebruiken zijn centrifuge voor fractionering en Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir lab aan de John Hopkins University voor het verstrekken van ons met het kleinschalige protocol voor de PSD fractionering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS-leveringen
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS-leveringen
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellulaire fractioneringsleveringen
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellulaire fractioneringsleveringen
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellulaire fractioneringsleveringen
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellulaire fractioneringsleveringen
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellulaire fractioneringsleveringen
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellulaire fractioneringsleveringen
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellulaire fractioneringsleveringen
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellulaire fractioneringsleveringen
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellulaire fractioneringsleveringen
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellulaire fractioneringsleveringen
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellulaire fractioneringsleveringen
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellulaire fractioneringsleveringen
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellulaire fractioneringsleveringen
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellulaire fractioneringsleveringen
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot leveringen
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot leveringen
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot leveringen
Running BufferMade in the labWestern blot leveringen. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot leveringen
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot leveringen
Transfer BufferMade in the labWestern blot leveringen. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot leveringen
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot leveringen
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot leveringen
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot leveringen
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent voor PSD-isolatie
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot leveringen
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot leveringen
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot leveringen
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot leveringen
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot leveringen
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot leveringen
Naam van het antilichaam
PSD-95Cell Signaling#2507Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Konijn
SynaptophysineCell Signaling#4329Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Konijn
alpha-TubulineSantacruzSC-5286Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Muis
GluN2BNeuromab75-097Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Muis
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antilichaamverdunning = 1:500 - 1.000, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Konijn
STEPSantacruzSC-23892Antilichaamverdunning = 1:200 - 500, tijd = 9 - 12 h, Reactietemperatuur = 4 °C, Gastsoort = Muis
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antilichaamverdunning = 1:2.000-5.000, tijd = 1 u, Reactietemperatuur = RT, Gastsoort = Ezel
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antilichaamverdunning = 1:2.000-5.000, tijd = 1 u, Reactietemperatuur = RT, Gastsoort = Ezel

Referenties

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869(2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230(2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896(2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269(2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Elektroconvulsieve insultenhippocampale fractioneringWestern blottinganalyse van synaptische eiwittenGluN2B-expressiePSD95-detectiekleinschalige fractioneringhippocampus-isolatieinductie van insulten
Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.