Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

16.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56037

⸱

18 augustus 2017

 , 
1Langone Medical Center, New York University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor wasmiddel-vrije homogenisering van gekweekte zoogdiercellen gebaseerd op stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Deze methode is ideaal voor het toezicht op de partitionering van perifere membraaneiwitten tussen oplosbare en membraan breuken.

Samenvatting

Gekweekte cellen zijn nuttig voor het bestuderen van de subcellular verdeling van eiwitten, met inbegrip van perifere membraaneiwitten. Genetisch gecodeerd fluorescently tagged eiwitten hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van eiwit subcellular distributie. Het is echter moeilijk te kwantificeren van de verdeling met fluorescent microscopie, vooral wanneer de eiwitten zijn deels cytosolische. Bovendien is het vaak belangrijk om te studeren van endogene eiwitten. Biochemisch onderzoek zoals immunoblots blijven de gouden standaard voor de kwantificering van eiwit verdeling na subcellular fractionering. Hoewel er commerciële kits die gericht zijn zijn op het isoleren van cytosolische of bepaalde fracties membraan, zijn de meeste van deze kits gebaseerd op extractie met detergentia die mogelijk niet geschikt voor de studie van perifere membraaneiwitten die gemakkelijk membranen worden uitgepakt. Hier presenteren we een wasmiddel-gratis protocol voor cellulaire homogenisering door stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Wij bevestigen de scheiding van subcellular organellen in oplosbare en pellet fracties over de verschillende soorten cellen, en vergelijk eiwit extractie onder verschillende gemeenschappelijke mechanische homogenisering wasmiddel gebaseerde methoden. Onder de verschillende voordelen van stikstof is cavitatie de superieure efficiëntie van verstoring van de cellulaire met minimale fysische en chemische schade aan gevoelige organellen. Gecombineerd met ultracentrifugatie, stikstof cavitatie is een uitstekende methode om te onderzoeken van de verschuiving van perifere membraaneiwitten tussen cytosolische en membraan breuken.

Inleiding

Cellulaire eiwitten kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: die membranen en die niet zijn gekoppeld. Non-membraan geassocieerde eiwitten worden aangetroffen in het cytosol, nucleoplasm en lumina van organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER). Er zijn twee klassen van membraan-geassocieerde eiwitten, integraal en perifere. Integraal membraaneiwitten zijn ook bekend als transmembraan eiwitten, omdat een of meer segmenten van de polypeptide keten omvat het membraan, meestal als een α-helix samengesteld uit hydrofobe aminozuren. Transmembraan eiwitten zijn co-translationally ingevoegd membranen in de loop van hun biosynthese en zo geconfigureerd blijven totdat zij zijn catabolized. Perifere membraaneiwitten zijn subsidiair naar membranen, meestal als gevolg van posttranslationele wijziging met hydrofobe moleculen zoals lipiden gereden. In tegenstelling tot integraal membraaneiwitten, de vereniging van perifere membraaneiwitten met cellulaire membranen is omkeerbaar en kan worden geregeld. Vele perifere membraan eiwitten functie in signaalroutes en gereglementeerde vereniging met een membraan is een mechanisme voor activeren of remming van een traject. Een voorbeeld van een signalering molecuul thats een perifere membraan eiwit is de kleine GTPase, RAS. Na een reeks van posttranslationele modificaties die wijziging met een lipide farnesyl, de gewijzigde C-terminus van een volwassen RAS-eiwit wordt ingevoegd in de cytoplasmatische bijsluiter van het cellulaire membraan. Het plasma-membraan is met name waar het RAS zijn downstream effector RAF1 bezighoudt. Om te voorkomen dat een constitutief activering van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) traject, zijn meerdere niveaus van controle van RAS. Naast rendering RAS inactief door hydrolyseerd GTP in BBP, kan actieve RAS ook worden gelost van het plasma-membraan door wijzigingen of interacties met solubilizing factoren om te remmen signalering. Hoewel fluorescerende levende imaging cel biologen de gelegenheid biedt te observeren de subcellular localisatie van fluorescente proteïne-gelabeld perifere membraan eiwitten1, blijft er een kritische noodzaak om te evalueren van de membraan vereniging van endogene eiwitten semi-kwantitatief met eenvoudige biochemische benaderingen.

De juiste biochemische evaluatie van eiwit verdeling tussen membraan en oplosbare breuken is kritisch afhankelijk van twee factoren: cellulaire homogenisering en efficiënte scheiding van membraan en oplosbare breuken. Hoewel sommige protocollen, met inbegrip van de meest gebruikte gecommercialiseerd kits, is afhankelijk van wasmiddel gebaseerde cel homogenisering, kunnen deze methoden analyse verduisteren door winning van membraaneiwitten in oplosbare fase2. Dienovereenkomstig, niet-wasmiddel op basis, mechanische methoden van verstoring van de cel schonere resultaten opleveren. Er zijn verschillende methoden van mechanische verstoring van cellen gekweekt in cultuur of geoogst van bloed of organen. Het gaat hierbij om Dounce homogenisering, verstoring van de fijne naald, kogellager homogenisering, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie. Hier wij stikstof cavitatie te evalueren en te vergelijken met andere methoden. Stikstof cavitatie is afhankelijk van stikstof, dat wordt ontbonden in het cytoplasma van de cellen onder hoge druk. Na evenwichtsinstelling, wordt de celsuspensie abrupt blootgesteld aan atmosferische druk zodanig dat stikstof belletjes worden gevormd in het cytoplasma die traan open de cel als gevolg van hun bruisen. Als de druk voldoende hoog is, stikstof bruisen de kern3 kan verstoren en membraan gebonden organellen zoals lysosomen4. Echter, als de druk laag genoeg wordt gehouden, zal de decompressie verstoren het plasmamembraan en ER maar niet andere organellen, waardoor het morsen van zowel cytosol en intact cytoplasmatische organellen in het homogenaat die de cavitate5is aangewezen. Om deze reden is stikstof cavitatie de methode van keuze voor het isoleren van organellen zoals lysosomen- en mitochondriën.

Het is echter ook een uitstekende manier voor te bereiden op een homogenaat die gemakkelijk kan worden gescheiden in membraan en oplosbare breuken. Het drukvat (voortaan "de bom" genoemd) gebruikt tijdens cavitatie bestaat uit een dikke roestvast stalen behuizing die hoge druk, met een inham voor levering van de stikstofgas uit een tank en een retourzijde met een verstelbare spoelafsluiter doorstaat.

Stikstof cavitatie is gebruikt voor de cel homogenisering sinds de jaren 1960-6. In 1961 vestigde Hunter en Commerfold7 stikstof Cavitatie als een haalbare optie voor verstoring van de zoogdieren weefsel. Sindsdien onderzoekers hebben de techniek om de verschillende cellen en weefsels met succes, en aangepast stikstof cavitatie is uitgegroeid tot een nietje in meerdere toepassingen, waaronder membraan voorbereiding8,9, kernen en organel voorbereiding10,11, en onstabiele biochemische extractie. Op dit moment cel biologen vaker andere methoden gebruiken van cel homogenisering omdat de voordelen van stikstof homogenisering hebben niet veel geadverteerd, stikstof bommen duur zijn en er is een misvatting dat een relatief groot aantal cellen Vereist. Protocollen voor stikstof cavitatie tot cel-vrije homogenates met intact kernen niet zijn gepubliceerd, en in de meest gepubliceerde evaluaties volumes van 20 mL celsuspensie werden gebruikt. Aan te passen deze klassieke techniek te passen aan de huidige eisen van het werken met kleinschalige monsters, presenteren we een gewijzigde protocol van stikstof cavitatie speciaal ontworpen voor gekweekte cellen. Na stikstof cavitatie, het homogenaat wordt gescheiden in oplosbare (S) en membraan (P) breuken door differentiële centrifugeren, eerst met een lage snelheid spin kernen en ongebroken cellen te verwijderen, en vervolgens met een snelle spin (> 100.000 x g) om te scheiden membranen van de oplosbare fractie. Wij de efficiëntie van de scheiding met immunoblots analyseren en vergelijken van stikstof cavitatie met andere verstoring van de mechanische technieken. We onderzoeken ook de osmotische werking van homogenisering buffer tijdens stikstof cavitatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. buffer en apparatuur preparaten

  1. Chill 45 mL cel verstoring bommen, 15 mL buizen en ultracentrifugatie buizen bij 4 ° C.
  2. Voorbereiden en chill homogenisering buffer per 2 x 10 7 cellen bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 25 mL.
    Opmerking: Homogenisering buffers bevatten doorgaans KCl in plaats van NaCl beter weerspiegelen intracellulaire zout samenstelling. Homogenisering buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM HEPES met een pH van 7,4, 10 mM KCl en 1,5 mM MgCl 2 (hierna te noemen hypotone homogenisering buffer). Meeste buffers kunnen worden aangepast voor stikstof cavitatie (Zie discussie).
  3. Voorbereiden en chill 6 mL 1 x Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen protease inhibitor tabletten vóór gebruik vers.
    Opmerking: PBS buffer die wordt gebruikt in dit protocol bestaat uit 10 mM nb 2 HPO 4 met een pH van 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl.
  4. Voorbereiden en chill solubilisatie buffer per monster bij 4 ° C. toevoegen een protease inhibitor tablet vlak voor gebruik 4 mL.
    Opmerking: Solubilisatie buffer die wordt gebruikt in dit protocol is 1 x Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer, die uit 25 mM Tris op pH 7.4, 150 mM NaCl, SDS 0,1% en 0,5% natrium deoxycholate 1 bestaat % NP-40. 4.6 zienoot.

2. Opruiming Cell

  1. Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 weefselkweek cellen met de aanbevolen voedingsbodems voor het celtype. Typisch, een 15-cm schotel levert 2 x 10 7 HEK-293 cellen gekweekt in DMEM op 90% confluentie ( Figuur 1).
  2. Verwijderen van het groeimedium door vacuüm.
  3. Voor Adherente cellen, plaatst u de cultuur gerechten op ijs, wassen van de cellen rechtstreeks in de cultuur-gerechten zachtjes met gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 15 cm schotel per wasbeurt) en de cellen met een grote cel schraper in een passende omvang van de oogst homogenisering buffer; Voor schorsing cellen, verzamelen de cel pellet in gekoeld homogenisering buffer tweemaal (10 mL buffer per 50 mL cultuur per wasbeurt) met 500 x g spin bij 4 ° C gedurende 5 minuten wassen en resuspendeer de pellet gewassen cel in een passende omvang van homogenisering buffer op ijs.
    Opmerking: het volume moet worden gebaseerd op de vereisten voor eiwitconcentratie in de voorgenomen experimenten, evenals het volume van de minimale/maximale toegestaan in de cel verstoring bom. Een algemene richtsnoer is 2-10 x 10 7 cellen/mL, of ongeveer 10 volumes van de cel pellet. Dit protocol is geoptimaliseerd voor drie 15-cm schotels van HEK-293 cellen in 2 mL zuiver homogenisering buffer.

3. Stikstof cavitatie

  1. de celsuspensie overdracht aan een schone en gekoelde bom in een ijsbad op een roer plaat.
    Let op: De bom heeft hoge druk, lage temperatuur, stikstofgas – dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen .
  2. Een micro magnetische roer staaf van de plaats binnen de bom en zet op het roer plaat om schorsing homogeniteit.
  3. Voegen een protease inhibitor tablet tot de schorsing en de bom per fabrikant te sluiten ' s instructie.
  4. Geleidelijk druk uitoefenen op de bom met een gastank stikstof per fabrikant ' s instructie tot de drukmeter bom leest 300 tot 600 psi. Sluit alle afsluiters en verbreken van de stikstof tank.
    Opmerking: De vereiste druk kan variëren met het celtype. Hier hebben we uitgevoerd cavitatie bij 350 tot 400 psi voor HEK-293, NIH-3T3 en Jurkat cellen.
  5. Wachten op 20 min om de stikstof te ontbinden en te bereiken evenwicht binnen de cellen.
  6. Verwijder overtollig water rond de spoelafsluiter met behulp van een doek handdoek. Open de spoelafsluiter zachtjes voor het bereiken van een dropwise versie van homogenaat en verzamelen in een tube pre gekoeld 15 mL.
    Opmerking: In de buurt van het einde van de collectie zal er een spurt van homogenaat en gas zal ontstaan met een sissende geluid. Zorg ervoor dat het gas niet oorzaak eerder verzameld cavitate om te schieten uit de buis (vandaar het gebruik van 15 mL tubes in plaats van 1,5 mL buizen). Zodra de spurt begint, sluiten de spoelafsluiter en de stikstof ingangsafsluiter abrupt te depressurize de bom bereiken cavitatie van de resterende cellen in de bom te openen. Open de bom voor cavitate herstel en grondige reiniging.
    Opmerking: De laatste cavitate moet een melkachtige uitstraling met schuim bovenop. Zachtjes roeren met een uiteinde van de pipet om het schuim te laten verdwijnen voordat centrifugeren.
    Opmerking: Bestuderen de cavitate met fase contrast microscopie bepalen de homogenisering efficiëntie. Voeg een druppel 15 µL cavitate op het oppervlak van een microscopie dia en dek met een dekglaasje aan. Herhaal stap 3.4-3.6 alleen als teveel ongebroken cellen worden gedetecteerd met een 20 X doelstelling.
    Opmerking: Als de homogenisering buffer bevat geen EDTA of EGTA, toevoegen aan de verzamelde cavitate op een eindconcentratie van 1 mM binnen 5 min na lozing.

4. Scheiding van Cytosolic en membraan breuken

  1. Centrifuge de cavitate bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot verwijderen ongebroken cellen en kernen.
    Let op: Herhaal de centrifugeren stap totdat geen zichtbare pellet wordt geproduceerd en de Post nucleaire Supernatant (PNS) verzamelen terwijl het vermijden van het schuim drijvend op bovenkant. Opnieuw Centrifugeer het schuim om verder te verzamelen en combineren van PNS, indien nodig ( Figuur 1).
  2. Verwerken de PNS desgewenst te verkrijgen van breuken van belang. Met het oog op scheiden cytosolische en membraan breuken, de PNS overbrengen in een buis ultracentrifuge en ultracentrifugatie desgewenst uit te voeren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor een < 3,5 mL monster in de buis van een polycarbonaat ultracentrifuge en voor ultracentrifugatie bij 350.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  3. Verzamelen het supernatant (de S-Fractie) met behulp van een precisiepipet 1 mL.
  4. Spoel zorgvuldig de pellet met 3 mL koude PBS zonder verstoring van het. Verwijderen van de PBS door vacuüm.
    Opmerking: Als de besmetting van de membraan breuk door cytosolische eiwitten is een groter probleem dan het verlies van monster, resuspendeer de pellet in 3 mL koud PBS en re-ultracentrifuge zoals in stap 4.2. Verwijderen van de PBS door vacuüm.
  5. Resuspendeer de pellet volledig in een juiste hoeveelheid wasmiddel-bevattende solubilisatie buffer van keuze. Om te bereiken cel gelijkwaardigheid, gebruiken dezelfde hoeveelheid buffer solubilisatie als de cytosolische breuk.
    Opmerking: We raden aan 1 x RIPA buffer gebruiken als solubilisatie buffer voor efficiënte membraan eiwit extractie. Als geen downstream assay vereist voor membraan fractie is, gebruikt u 1 x laemmli monster buffer voor maximale membraan eiwit extractie.
    Opmerking: We raden loskomen en de pellet in solubilisatie buffer overbrengen naar een schone buis op een buis rotator bij 4 ° C voor maximale membraan eiwit extractie.
    Opmerking: Als de pellet te plakkerig (teveel lipiden) efficiënt worden verwijderd uit de the ultracentrifuge buis in solubilisatie buffer, wij stellen module voor bevriezing van de pellet in vloeibare stikstof en snel het loskomen van de pellet uit de ultracentrifuge buis met een mini metalen spatel, voordat de pellet ontdooit.
    Opmerking: U kunt ook membraan pellets kunnen worden gewoon geresuspendeerde en niet ontbindend in een niet-wasmiddel-bevattende buffer te produceren een fractie P van membraan vesikel opschorting, in dat geval het centrifugeren stap in 4.6 niet vereist is. Dergelijke breuken P zijn nuttig bij het onderzoeken van functies zoals enzym-activiteiten die afhankelijk van de vereniging van de membraan zijn.
  6. De schorsing van de volledig ontbindend pellet uit stap 4.5 bij 20.000 x g in een tafelblad centrifuge voor 10 min Centrifugeer bij 4 ° C. de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet 1 mL (de P-Fractie) verzamelen en negeren de pellet (onoplosbare lipiden).
  7. Uitvoeren van gewenste assays zoals het westelijke bevlekken met de cytosolische en/of membraan breuken, of ze bij-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 toont de partitionering van cellulaire eiwitten uit PNS in de oplosbare cytosolische fractie (S) of het membraan pellet breuk (P). Wij onderzochten drie representatieve cellijnen van verschillende celtypes: HEK-293 (epitheliale), NIH-3T3 (fibroblast) en Jurkat (lymfocyten). Rho Guanine dissociatie remmer (RhoGDI) en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptor (CIMPR) werden gebruikt als positieve controles voor cytosolische en membraan breuken, r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De voordelen van stikstof cavitatie boven andere methoden van mechanische storingen zijn spruitstuk. Misschien is het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om voorzichtig nog efficiënt Meng exemplaren. De fysische principes van decompressie cools monsters in plaats van de veldgenerator lokale verwarming schade zoals ultrasone en wrijving/scheren technieken gebaseerd. Cavitatie is ook zeer efficiënt op het verstoren van het plasma-membraan. Omdat stikstof bubbels worden gegenereerd binnen elke afzonderlijke cel op dec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door GM055279, CA116034 en CA163489.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell Disruption Vessel (45 mL)Parr Instrument4639Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogeniser (2 mL)Kontes885300-0002Dounce stamper en buis
U-100 Insulin Syringe 28G½Becton Dickinson329461Naald
Atg12 antibodySanta Cruz271688Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
β-actin antibodySanta Cruz47778Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
β-tubulin antibodyDSHBE7-sMuis antilichaam, gebruik bij 1:5000 verdunning
Calnexin antibodySanta Cruz23954Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Calregulin antibodySanta Cruz373863Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Catalase antibodySanta Cruz271803Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
CIMPR antibodyAbcam124767Konijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
EEA1 antibodySanta Cruz137130Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
EGFR antibodySanta Cruz373746Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
F0-ATPase antibodySanta Cruz514419Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
F1-ATPase antibodySanta Cruz55597Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Fibrillarin antibodySanta Cruz374022Muis antilichaam, gebruik bij 1:200 verdunning
Golgin 97 antibodySanta Cruz59820Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
HDAC1 antibodySanta Cruz81598Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Hexokinase 1 antibodyCell Signaling Technology2024SKonijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Lamin A/C antibodySanta Cruz376248Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
LAMP1 antibodyDSHBH4A3-cMuis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Na+/K+ ATPase antibodySanta Cruz48345Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Rab7 antibodyAbcam137029Konijn antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Rab9 antibodyThermoMA3-067Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
RCAS1 antibodySanta Cruz398052Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
RhoGDI antibodySanta Cruz360Konijn antilichaam, gebruik bij 1:3000 verdunning
Ribosomal protein S6 antibodySanta Cruz74459Muis antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Sec61a antibodySanta Cruz12322Geiten antilichaam, gebruik bij 1:1000 verdunning
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter349622Steekproefbuis voor ultracentrifugering
TLK-100.3 rotorBeckman Coulter349481rotor voor ultracentrifugering
Optima MAX High-Capacity Personal UltracentrifugeBeckman Coulter364300ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsRoche11697498001proteaseremmers
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm BladeCorning353089grote celschraper
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-57SIXmicro roerstaaf
Ceramic-Top Magnetic StirrerFisher ScientificS504501ASmagnetische roerder

Referenties

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Subcellulaire fractioneringultracentrifugatiecytosolische fractiemembraanfractieeiwitpartitioneringcelhomogenisatieWestern blot-analyse
Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.