Dit manuscript wordt het nut van echografie uitgevoerd op vrouwelijke ratten te ontwerpen van experimentele modellen voor reproductieve en gynaecologische onderzoek beschreven. Een stapsgewijze uitleg van het uitvoeren van de evaluatie van de ultrasonographic wordt weergegeven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ultrasonografie in experimentele reproductieve onderzoeken op ratten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Met de ontwikkeling van geassisteerde voortplanting technologie en de ethische beperkingen van het onderzoek op de mens, hebben de rat diermodellen wijd in reproductieve geneeskunde is gebruikt. In het verleden, heeft de studie van reproductieve systeemontwikkeling bij knaagdieren zijn gebaseerd op eenmalige histopathologisch onderzoek van het verwijderde weefsel. Onlangs, met de ontwikkeling van hoge resolutie transabdominal echografie, kwalitatief hoogwaardige echografie kan nu worden uitgevoerd om te evalueren van de voortplantingsorganen van ratten, waardoor een nieuwe methode voor het bestuderen van het voortplantingssysteem. Beelden werden verkregen met behulp van een hoge resolutie ultrasonographic systeem. Gynaecologische Ultrasonografie werd uitgevoerd op 28 acht weken oude niet-drachtige ratten en 5 zwangere Sprague-Dawley ratten. We beschrijven hoe herken je organen van het reproductieve systeem en bijbehorende structuren in typische weergaven tijdens de verschillende fasen van de estrus cyclus. Kleur stroom die Doppler werd gebruikt voor het meten van de bloedtoevoer van de baarmoeder slagader en evalueren van baarmoeder bloed stroom patroon wijzigingen tijdens verschillende stadia van de zwangerschap. We hebben aangetoond dat echografie verkenning een handige methode is voor de beoordeling van wijzigingen in interne voortplantingsorganen. Het gebruik ervan verhoogt de mogelijkheid van aanvullende experimenten, met inbegrip van medische of chirurgische procedures, en biedt de mogelijkheid om te controleren sonographic wijzigingen in inwendige organen zonder het offeren van dieren.
Inleiding
Rat dierlijke modellen hebben wijd gebruikt in de reproductieve geneeskunde, met inbegrip van in het embryo en ovariële transplantatie1,2. Echter in het verleden, de studie van reproductieve systeemontwikkeling bij knaagdieren is gebaseerd op eenmalige histopathologisch onderzoek van het verwijderde weefsel, en de longitudinale studie van veranderingen van de dagelijkse reproductieve organen niet mogelijk is geweest in ratten3. Echografie is wijd verbeid gebruikt in gesubsidieerde reproductieve technologie bij de mens voor meer dan 30 jaar, maar deze waardevolle technologie is alleen toegepast op ratten onlangs.
Ons doel was een ultrasonographic aanpak voor het evalueren van de voortplantingsorganen van Sprague-Dawley ratten om te ontwerpen van experimentele modellen voor reproductie en Gynaecologie onderzoek en om aan te tonen van de procedure omdat vast te stellen om onze kennis, Er zijn geen actuele gevisualiseerde publicaties met betrekking tot deze procedure. We beschrijven de procedure van ultrasonographic onderzoek van de geslachtsorganen van de vrouwelijke rat en huidige ultrasonographic bevindingen betreffende anatomie en uteriene slagader doorbloeding met behulp van high-definition echografie. We de kenmerken van het endometrium, de eierstokken en de baarmoeder slagader bloedstroom in niet-drachtige dieren gecontroleerd in verschillende stadia van de cyclus van de estrus om te evalueren van de aanzienlijke verschillen in dikte van het baarmoederslijmvlies, ovariële morfologie en uteriene doorbloeding in verschillende stadia van de cyclus van de estrus, vergelijkbaar met vrouwen. Wij gebruikte hoogwaardige echografie apparatuur met een 70 MHz-frequentie en het niveau van een resolutie van 30 µm. Ons andere doel was om te evalueren van de wijzigingen in de weerstand van de uteriene doorbloeding bij zwangere ratten. Deze techniek zorgt voor de studie van dagelijkse veranderingen in de voortplantingsorganen zonder het offeren van dieren.
Er zijn verschillende technische moeilijkheden bij het gebruik van echografie op ratten. Deze problemen omvatten: het endometrium rat is veel dunner dan een menselijk vrouwelijke4. Moeilijkheid in de eierstokken van ratten imaging heeft toegeschreven aan dikkere huid en de buikwand musculatuur bij ratten, wat in in de buurt van-volledige demping van de echografie5 resulteerde, en de uteriene slagader is veel moeilijker te vinden niet-drachtige ratten. We hebben veel technische problemen met de procedure opgelost, en voor die problemen die blijven, laten we zien hoe ze te minimaliseren.
Succesvolle controle van sonographic veranderingen in de voortplantingsorganen van ratten zonder de noodzaak om het offeren van dieren opent de mogelijkheid van het opbouwen van toekomstige diermodellen van reproductieve geneeskunde en andere chirurgische ingrepen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en overeenkomstig de aankomen (dier onderzoek: rapportage In Vivo experimenten) richtlijnen. Het protocol ontvangen een licentie voor dierproeven voldoen aan richtlijn 2010/63/EU met het nummer van de vergunning A13170404 (Anexo 1). Alle experimenten werden uitgevoerd in een Europese Unie-gecertificeerd laboratorium volgens nationale richtlijnen voor de ethische behandeling van dieren (RD 53/2013, EU-richtlijn 63/2010). Het protocol is goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de Universiteit van Murcia.
1. dierlijke voorbereiding
Opmerking: Alle experimenten werden ondersteund door het dier experimenten sectie van Murcia Universiteit en de verloskunde en Gynaecologie afdeling van Murcia University.
- Gebruik 8 weken oude Sprague-Dawley ratten (28 vrouwelijke ratten) met een gewicht van 200-250 g in alle experimenten.
Nota: Hier, wij ook gebruikt 5 zwangere ratten. - Voor het verkrijgen van zwangere ratten, cage acht weken oude vrouwelijke en vruchtbare mannelijke ratten en stuurman vanaf 17:00 -23:00 h. identificatie van een vaginale stekker op de volgende ochtend werd geïnterpreteerd als paring succes. Beschouw de dag 1 van de dracht, de volgende dag nadat ze werden gekruist.
- De experimenten op 9, 15 en 18 dagen van de dracht uitvoeren.
- Huis ratten in groepen van twee met vrije toegang tot voedsel en water en onderhouden op regelmatige 12 h licht/donker cyclus.
- Na het wennen aan de voorwaarden van de faciliteit voor een minimum van twee weken, door dagelijks 's morgens vaginale cytologie te gebruiken om te beoordelen voor de frequentie van de estrus en regelmatigheid.
Opmerking: Achtentwintig ratten met een reguliere dag van 4 tot en met 5 estrus fase werden geselecteerd voor opname in de studie.
2. voorbereiding van ratten Imaging
Opmerking: Afbeeldingen werden verkregen met behulp van hoge-resolutie transabdominal Ultrasonografie. Oestrische cyclus fasen werden vastgesteld door vaginale uitstrijkjes cytologie.
- Voorafgaand aan de beeldvorming studie, anesthetize de dam in de zaal van de inductie met 2-3% Isofluraan gas.
- Verwijderen van het dier en onmiddellijk plaats van de snuit binnen een neus kegel aangesloten op het systeem van de verdoving en handhaven van het dier op 1,5-2% Isofluraan tijdens het ultrasonographic onderzoek.
- Verwijder de vacht van de ribben marge aan de caudal buik met clippers en ontharende room.
- Plaats de narcose rat in een liggende positie op een verwarmde tafel voor de beveiliging van de rat en zorgen voor optimaal comfort en het onderhoud van fysiologische parameters voor de duur van de imaging-sessie. Alle fysiologische parameters moeten worden geïntegreerd met de beelden en gegevens vastgelegd in real-time via de toepassing van echografie.
- Zachtjes invoegen een rectale sonde (na smeerolie) voor het controleren van de lichaamstemperatuur (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
- De transducer (30 Hz) plaats in een stationaire houder en verplaats het langs de verticale as en de horizontale as (forward-aan-rug en side-to-side) met behulp van een handbediende joystick of met de hand.
- Aardolie gebaseerde ophthalmic balsem toepassen door de ogen van de rat te vermijden tijdens de procedure drogen.
3. de onderzoekprocedure
Opmerking: Anatomie van de voortplantingsorganen van rats´: de vagina ligt aan de urineblaas dorsale en verdeelt in twee baarmoeder horens die naar de nieren uitbreiden. De eierstokken zijn verbonden met de baarmoeder horens via het oviducts (Figuur 1). De baarmoeder ligt in de regio posterieure aan de nieren.
-
Identificatie van de baarmoeder
- Met behulp van de blaas als een herkenningspunt te vinden van de baarmoederhals, volg de baarmoederhals om te zoeken naar de tak van de links en rechts baarmoeder horens.
- Overschakelen naar tweedimensionale weergave/video door het selecteren van "B-modus". Meet de diameter van de antero-zitvlak voor elke baarmoeder hoorn in de medio-isthmic regio op een Sagittaal middellijn afbeelding. Detecteren van metingen met behulp van de ultrasonographic systeemsoftware.
- Meet het baarmoederslijmvlies dikte van echogenic grens naar echogenic grens over het baarmoederslijmvlies holte op de afbeelding van een Sagittaal middellijn in 'B-modus'.
- Doppler kleurmodus wijzigen door het selecteren van "Color Doppler". Gebruik kleur Doppler te identificeren van de bloedvoorziening van het endometrium en meten van de doorbloeding van baarmoederslijmvlies. Selecteer de volgende parameters in Doppler kleurmodus: hoogdoorlaat filter ingesteld op 4 Hz, gepulseerde herhaling frequentie instellen tussen 4 en 48 kHz en Doppler Pulsed poort instellen tussen 0,2 tot 0,5 mm.
-
Identificatie van de bloedtoevoer van de baarmoeder slagader
- Verkrijgen Doppler golfvormen in de baarmoeder slagader in de buurt van de laterale-inferieur marge van de utero-cervicale kruising dichtbij de iliacale slagader aan elke kant.
- Gebruik de volgende parameters in Doppler modus: hoogdoorlaat filter ingesteld bij 6 Hz, gepulseerde herhaling frequentie instellen tussen 4 en 48 kHz en Doppler Pulsed poort instellen tussen 0,2 tot 0,5 mm.
- Zorg voor het uitlijnen van de doorbloeding en de Doppler lichtbundel te minimaliseren de Doppler hoek. Record de hoek tussen de Doppler lichtbundel en het schip. Waarden genomen buiten een hoek van 60° onjuist zijn en moeten worden vermeden6.
- De piek systolische snelheid (PSV) en einde-diastolische snelheid (EDV) van drie opeenvolgende cycli te meten. Vervolgens berekent de systolische diastolische (S/D) verhouding (PSV/EDV) en index van de weerstand (RI) ([PSV-EDV] / PSV) waarden voor elke baarmoeder hoorn.
- De bloedtoevoer van de baarmoeder slagader van 5 zwangere ratten tijdens de 9th15th, 18th dag van de dracht meten.
-
Identificatie van de eierstok en doorbloeding van de eierstok slagader
Opmerking: De vrouwelijke rat eierstokken zijn gelegen laterale aan de nieren aan beide zijden van het dier en verblijf in vet kussentjes die zijn gevonden op het einde van de baarmoeder-hoorn (Figuur 1).- Afbeelding van de eierstok, beginnen met de sonde in een dwarsvlak en plaats deze op de laterale aspect van het dier iets onder de ribben. De nieren en het vet pad hebben een uitstraling van de hyperechoic in vergelijking met het ovarium.
- Het meten van de externe grens van de eierstok en de follikels. Nummers op de schaal naar elke afbeelding zijn in millimeters, met stappen van 0.1 mm.
Opmerking: Color Doppler Mode en Power Doppler Mode beeldvorming helpt met de identificatie van ovariële intensiteit en directionele stroom.
4. ontwerp van het onderzoek
- Controleer de estrus cyclus door vaginale uitstrijkjes cytologie.
- Alle ratten in twee groepen te verdelen. Voor groep 1 of vooraf vruchtbare (of periovulatory), omvatten de ratten die in de proestrus en de estrus cyclus fasen waren. Voor groep 2 of na vruchtbare, omvatten de ratten die in de vroege diestrus en laat diestrus fasen van de cyclus waren.
- Controleren en vergelijken de antero-posterior diameter van elke baarmoeder hoorn in de medio-isthmic regio in groepen 1 en 2.
- Controleren en vergelijken van de dikte van het baarmoederslijmvlies en de kenmerken van het endometrium in groepen 1 en 2.
- Controleren en vergelijk de grootte (maximale diameter) en de kenmerken van de eierstokken en lokaliseren van elke periovulatory follikels in beide eierstokken in groepen 1 en 2.
- Controleren en vergelijken van de bloedtoevoer van de baarmoeder slagader in de groepen 1 en 2.
- Controleren en vergelijken van de bloedtoevoer van de baarmoeder slagader voor zwangere rats in verschillende stadia van de zwangerschap (dagen 9, 15 en 18 van de dracht).
- Voeren statistische analyses met behulp van SPSS. Presenteren gegevens als de gemiddelde ± standaardafwijking (SD) of mediaan met interquartile bereiken. Analyseer de resultaten met behulp van de Student t-test tussen de verschillende groepen. Een P-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als een statistisch significant verschil.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Er waren geen significante verschillen in antero-posterior uteriene hoorn diameters of in de dikte van het baarmoederslijmvlies tussen de twee zijkanten van de baarmoeder-hoorn (tabel 1). Vergeleken met de groep 2, de gemiddelde dikte van het baarmoederslijmvlies in de groep 1 was dikker, maar geen significante verschillen (P > 0,05) werden gevonden tussen de twee groepen (Figuur 3). Toch vonden we vloeistof in de baarmoeder (in 8 van de 28 ratten) in de buurt van de cyclus ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Als gevolg van de procedurele wijzigingen en probleemoplossing die nodig was in deze studie, ondanks ons doel van de identificatie van alle fasen van de estrus cyclus in ratten met behulp van echografie, konden we significante verschillen vinden. We veronderstellen dat deze moeilijkheden worden kunnen omdat de estrus cyclus slechts een paar dagen bij ratten, in tegenstelling tot de cyclus bij vrouwen duurt. Wij zijn ervan overtuigd dat alle metingen werden gedaan op precies het juiste moment om te bepalen van eventuele v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door dier experimenten sectie van Murcia Universiteit en de verloskunde en Gynaecologie afdeling van Murcia University. Wij danken alle technici die werken bij de CEIB (Centro Experimental nl Investigaciones Biomédicas), de sectie van dierproeven voor de Universiteit van Murcia, die hebben meegewerkt aan dit project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo integrated rail system inclusief fysiologische monitoring unit. | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 Transducter | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab Software | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | Rattenras | |
| Smeringsgel | Algemene leverancier | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesiekarsysteem | Cibertec S.A | Anesthesietoestel | |
| Ecogel 100 echografiegel | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| Haarverwijderingslotion (Nair) | Algemene leverancier | ||
| Isofluraan | Esteve Veterinaria | Inhalatieanesthesie | |
| * Vereist software is Vevo software inclusief B-Mode applicatie, pulsgolf Doppler applicatie en vasculaire spanningsanalyse tools pakket. |
Referenties
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823(2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H. Murine Fetal Echocardiography. J Vis Exp. (72), (2013).
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
