Beoordeling van menselijk vetweefsel microvasculaire functie met behulp van Videomicroscopy

Summary

Videomicroscopy systemen worden gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli. Deze techniek kan worden gebruikt om te onderzoeken microvasculaire fenotypen in verschillende adipeus weefsel domeinen bij zwaarlijvige mensen.

Abstract

Terwijl obesitas nauw met de ontwikkeling van metabole en cardiovasculaire ziekte verbonden is, is weinig bekend over de mechanismen die deze processen regelen. Het hypothetische is dat pro-atherogene bemiddelaars vrijgelaten uit vetweefsel met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering pathogene vasculaire wijzigingen, zowel lokaal als systemisch bevorderen kunnen, en het begrip dat hart-en vaatziekten kan de gevolg van vetweefsel dysfunctie blijft zich ontwikkelen. Hier beschrijven we een unieke methode van videomicroscopy waarbij de analyse van vaatverwijdende en vasoconstrictor antwoorden van intact kleine menselijke arteriolen verwijderd uit de obesitas depot van levende menselijke proefpersonen. Videomicroscopy wordt gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde microvessels in reactie op farmacologische of fysiologische stimuli met behulp van een druk systeem dat in vivo voorwaarden bootst. De techniek is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie lokaal binnen de kring van vetweefsel bijdragen. Afwijkingen in het adipeus weefsel microvasculature hebben bovendien ook verbonden met systemische ziekten. We deze techniek te onderzoeken depot-specifieke vasculaire reacties bij zwaarlijvige proefpersonen toegepast. We beoordeeld endotheel-afhankelijke vasodilatatie groeiende stroom én acetylcholine in obesitas arteriolen (50-350 µm inwendige diameter, 2-3 mm in lengte) geïsoleerd van twee verschillende obesitas depots tijdens bariatric chirurgie van dezelfde persoon. We toonden aan dat arteriolen van viscerale vet verminderde endotheel-afhankelijke vasodilatatie in vergelijking met de schepen van de subcutane depot geïsoleerd vertonen. De bevindingen suggereren dat de viscerale communicatie wordt geassocieerd met vasculaire endotheel disfunctie die relevant zijn voor de klinische observatie verhoogde viscerale vetmobilisering koppelen aan systemische ziekte mechanismen kan zijn. De videomicroscopy-techniek kan worden gebruikt om vasculaire fenotypes van verschillende vet depots onderzoeken evenals bevindingen van personen met verschillende mate van obesitas en metabole dysfunctie met elkaar vergelijken. De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken vasculaire reacties overlangs in reactie op klinische interventies.

Introduction

Videomicroscopy is een handige techniek gebruikt om de vasomotorisch functie van kleine arteriolen verwijderd uit levende menselijke proefpersonen ex vivoonderzoeken. Ons laboratorium heeft zich gericht op ontrafeling uit kleine microvessels uit verschillende adipeus weefsel compartimenten te karakteriseren van de effecten van verschillende obesitas microenvironments op de microvasculature. Een groot voordeel van deze techniek is dat de bloedvaten van het menselijke lichaam verwijderd functioneren blijven en gemakkelijk binnen enkele minuten tot uren na biopsie kan worden onderzocht. Fysiologische omstandigheden worden geïmiteerd en stabiel Transmurale druk in de ruimte van de intraluminale via micro-glas-cannulas die veel in vivo kenmerken recapituleren gehandhaafd. ^{1 , 2} bovendien een betrouwbare videomicroscopy set-up met geautomatiseerde rand detectie software kunt voor zowel de kwantitatieve als de kwalitatieve beoordeling van endotheel-afhankelijke en -onafhankelijke vaatverwijdende en vasoconstrictor hoedanigheid van geïsoleerde schepen in real-time, executoriale snelle fysiologische beoordeling in reactie op fysieke en farmacologische stimuli. ³ andere microvasculaire technieken zijn ook beschikbaar, zoals draad myography die de neiging om minder tijd in beslag nemen en meten van spanning reacties op verschillende agonisten door een kracht transducer.

Ons laboratorium heeft videomicroscopy om zich te buigen over de relatie tussen obesitas en vasculaire dysfunctie, gericht op de effecten van verschillende adipeus weefsel domeinen op de therapieën worden toegepast. Centrale vetmobilisering met accumulatie van intra-abdominale visceraal vet is meest nauw gekoppeld aan adipocytokine productie, metabole dysfunctie en cardiometabolic risico. Het heeft zijn gepostuleerd dat adipeus weefsel dysfunctie met overproductie van pro-atherogene disregulatie van cytokines en adipokine zijn sterk betrokken bij deze processen, maar specifieke regelgevende moleculen en de behandeling doelstellingen grotendeels blijven onontdekt. ⁴ voorts, op het niveau van de lokale adipeus weefsel, de capillaire rarefaction en de verminderde perfusie zijn gekoppeld aan vetweefsel pseudohypoxia en metabole disregulatie. De hypothese dat hart-en vaatziekten mogelijk het gevolg van vetweefsel dysfunctie evolueert. Pro-atherogene bemiddelaars vrijgegeven uit vet, met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering, waarschijnlijk bevorderen endotheel disfunctie en pathogene vasculaire veranderingen die kunnen manifesteren lokaal in de obesitas therapieën en gedetecteerd met behulp van de hierin beschreven methodologie. ⁵

De functionele beoordeling van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie in menselijke obesitas bijdragen. Voor het onderzoek naar de mechanismen die aan vet depot-specifieke dysfunctie bijdragen, hebben we methoden te onderzoeken endotheel-afhankelijke en - onafhankelijke vasodilatory reacties van de microvasculature, en evalueren van de expressie van verschillende regelgevende kandidaten in gepaarde viscerale en onderhuidse (SC) vetweefsel specimens verkregen zwaarlijvige onderwerpen ten tijde van bariatrische chirurgie.

Protocol

het protocol en de voorbeelden die hier beschreven werden goedgekeurd door Boston University School van geneeskunde institutionele Review Board (IRB, protocol #H-25644) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki. Alle onderwerpen verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat deelname.

1. bereiding van de oplossingen en Micro-glas Cannulas

1. voorbereiden de 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic zuur zout (HEPES) oplossing. Voor 1 liter, Los 8.059 g NaCl, 0.298 g KCl, 0.296 g MgSO ₄ • 7 H ₂ O, 0.235 g CaCl ₂ • 2 H ₂ O, 0.16 g KH ₂ PO ₄, 0,01 g EDTA, 1.081 g D-Glucose en 2.383 g HEPES zuur in 950 mL gedeïoniseerd water. Vul aan tot 1 L met gedeïoniseerd water. Breng de pH op 7.4 met NaOH. HEPES-buffer kan worden opgeslagen tot 7 dagen bij 4 ° C.
2. Bereiden de 20 x zout buffervoorraad. Voor 1 liter, het toevoegen van 143,8 g NaCl, 7.0 g KCl, 5,9 g MgSO ₄ en 7.4 g CaCl ₂ • 2 H ₂ O in 900 mL gedestilleerd water. Waaruit volume aan 1 L met gedeïoniseerd water. Stockoplossing bewaren bij 4 ° C.
3. Bereiden de 20 x buffervoorraad. Voor 1 liter, voeg 26.8 g NaHCO ₃ en 0.2 g EDTA·2H ₂ O in 900 mL gedeïoniseerd water. Waaruit volume aan 1 L met gedeïoniseerd water. Stockoplossing bewaren bij 4 ° C.
4. Bereid de KREBS oplossing moet worden gebruikt tijdens de fysiologische experimenten. Voor 1 liter, voeg 900 mL gedeïoniseerd water, 50 mL 20 x buffervoorraad, 50 mL 20 x zout bufferoplossing, 0.99 g D-Glucose en 0.16 g KH ₂ PO ₄. Breng de pH op 7.4 met behulp van HCl. Om de pH van de buffer, roer voortdurend en bedek met paraffine of continu bubble.
   1. Check de pH elke 20 min. maken de KREBS-oplossing vers dagelijks.
5. Maken van micro-glas cannulas met een inwendige diameter van 40-240 µm met behulp van een commercieel beschikbare naald/pipet trekker. De grootte van de glazen cannulas wordt bepaald door de grootte van de inwendige diameter van geïsoleerde bloedvaten (50-350 µm). U aanschaffen micro-glas cannulas van de vooraf bepaalde grootte.

2. Bereiding van reagentia

1. voorbereiden de acetylcholine (Ach, 10 ^-2 M, stockoplossing). Los 18.29 g in 10 mL gedeïoniseerd water. Opslaan van 1 mL aliquots van stockoplossing (10 ^-2 M) bij-80 ° C. Op de dag van het experiment serieel verdund te verkrijgen van de volgende concentraties van de werken: 10 ^-5 met 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8, 10 ^-9 M.
2. Bereiden de papaverine (2 x 10 ^-2 M, stockoplossing). Los 0.07517 g in 10 mL gedeïoniseerd water. Bereiden van 10 µL hoeveelheden van de stamoplossing en winkel op -80 ° C. serieel verdunnen om te verkrijgen van 10 ^-4, 10 ^-5, 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8 M op de dag van het experiment.
3. Bereiden de endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 ^-5 M, stockoplossing). Los 50 µg endothelin-1 in 1 mL van de 1% BSA/PBS. Opslaan van 1 mL aliquots van stockoplossing (2 x 10 ^-5 M) bij-80 ° C. Op de dag van het experiment verdund tot een concentratie van de werken van 10 ^-10 M op de dag van het experiment aan.
4. Opslaan van reagentia in beide-20 ° C of -80 ° C, afhankelijk van type vriezer beschikbaar, maar niet langer dan 6 maanden tot.

3. Vetweefsel collectie en vaartuig voorbereiding

1. werven zwaarlijvige mannen en vrouwen (index van de lichaamsmassa (BMI) ≥ 35 kg/m², leeftijd ≥ 18 jaar) ingeschreven in het programma van bariatric chirurgie aan het Boston Medical Center (BMC). Een totaal van 40 onderwerpen deelgenomen aan deze experimenten.
2. Subcutane en viscerale adipeus weefselmonsters verzamelen tijdens geplande bariatrische chirurgie door de chirurg de bewerking.
   1. Oogst het onderhuids vetweefsel van de lagere buikwand en viscerale vet uit het Omentum majus, respectievelijk. De grootte van de steekproef van de typische vetweefsel varieert van 3-10 mg van weefsel.
   2. Plaats weefsels onmiddellijk in koud HEPES buffer oplossing met een pH van 7,4 en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 24 h.
      Opmerking: Daarnaast obesitas arteriolen kan worden verkregen voor mager individuen ook tijdens andere soorten operaties zoals hernia reparaties of plastische chirurgie, en kan ook van het subcutane depot via trans-cutane buik vet pad biopsie biopsied < sup Class = "xref" > 6.
3. Met behulp van een weefsel dissectie Microscoop, de micro-schaar en de micro-pincet, zorgvuldig verwijderen omringende vet en bindweefsel de kleine obesitas arteriolen (50-350 µm intraluminale diameter, 2-3 mm in lengte).
4. Tie uit alle takken van de arteriolen met kleine nylon of zijde hechtingen vóór het cannulating op de glazen capillaire pipetten. Zorgvuldig ontleden de arteriolen omdat zelfs kleine beschadigingen van de muur arteriole zorgt ervoor dat belangrijke functionele veranderingen.
   1. Minimaliseren vaartuig blootstelling aan licht en warmte als het kan leiden tot vasodilatatie. Omdat het soms moeilijk worden kan te onderscheiden van de arteriolen van venules, identificeren de grootte en vlotte spier Toon van schepen door de toppen van de schepen te happen. Arteriolen zijn meestal kleiner en getuigen van meer Toon in vergelijking met venules.
5. De orgel-zaal voor te bereiden. Langzaam vullen de glazen capillaire pipetten en rubber slangen met KREBS oplossing met behulp van een spuit van 10 mL.
6. Zodra de rubber slang wordt gevuld en glazen capillaire pipetten zijn ondergedompeld in KREBS oplossing binnen de orgel-zaal, de arteriolen veilig op de beveiligde pipetten cannulate en binden van beide uiteinden van de arteriole met nylon of silk hechtdraad knopen zorgvuldig.
7. Vullen opwaarts naar de orgel-zaal met KREBS oplossing tot 2 mL.
8. Veilig de orgel-kamer op een podium met de omgekeerde Microscoop (vergroting 10 X / 0,25 doelstelling) en videocamera.
9. Inschakelen de rand detectie software die stroomsgewijs wordt verzonden in real-time op een sampling-frequentie van 1 kHz (1 frame/s).
10. Sluit een kant van de onder druk staande buis aan de oplossing van de KREBS gevulde druk reservoirs gratis microbellen, zoals bubbels experimentele fout kunnen invoeren. Verbind de andere kant van onder druk staande buis aan het orgel kamer.
11. De KREBS oplossing gevuld druk reservoirs verbinden met de drukopnemer met schone tubing.
12. Controle van intra-luminal stroom door het reguleren van de hoogte van deze twee reservoirs; dus als reservoirs worden geplaatst op dezelfde hoogte, er treedt geen intra-luminal stroom.
13. Als al deze processen zijn voltooid, schakel verwarming blok en software programma om de temperatuur bij 37 ° C. continu perfuse van het schip met KREBS oplossing en beluchten met een gasmengsel van 74% stikstof, 5% CO ₂ en 21% O _{2 2} ^{7 ,}, ⁸, gedurende de gehele experimentele procedure.
14. Tot de gewenste druk inside het lumen van de geïsoleerde schepen geleidelijk verhogen de intraluminale druk (5 mmHg, iedere 5 min) via de druk controle-eenheid in het deelvenster myo-interface doen in een langzaam tempo om endothelial laag schade te voorkomen.
    Opmerking: Zodra de druk 60 mmHg bereikt, een 20-30 min evenwichtsinstelling periode is nodig om te stabiliseren van het vaartuig. Alle vasculaire functie studies uitgevoerd bij 60 mmHg en 37 ° C met een pH van 7,4. ⁷

4. Beoordeling van obesitas microvasculaire functie

Opmerking: In het algemeen, obesitas arteriole endotheel-afhankelijke vasodilatatie in reactie op fysiologische (stroom-geïnduceerde) kan worden ontlokte en farmacologische stimuli (Ach-geïnduceerde).

1. Flow-gemedieerde, endotheel-afhankelijke vasodilatatie
   1. opnemen na drukregeling, de diameter van de obesitas arteriole in rust (Di). Dit wordt aangeduid als de rust basislijn diameter.
   2. Vooraf vernauwen bloedvaten ~ 55% van de rust basislijn diameter (Dp) door toevoeging van 1 µL van endothelin-1 (ET-1, 10 ^{− 10} M) rechtstreeks naar het bad en wacht 5 min voor effect. Herhaal dit proces totdat het bereiken van de gewenste ~ 55% vooraf staat gespannen.
   3. Na pre vernauwing, induceren continue stroom in de ruimte van de intraluminale van vetweefsel arteriolen, in gelijke en tegengestelde richtingen zodat een drukverschil over het vaartuig kan worden ontwikkeld zonder dat de gemiddelde intraluminale druk van de 60 mmHg.
      Opmerking: bijvoorbeeld, als een reservoir omhoog 10 cm in hoogte wordt, andere één moet worden verplaatst naar beneden 10 cm te veranderen druk verlopen en dus veranderen intraluminale debiet. Desgewenst nauwkeuriger stroom tarief metingen zijn een kwantitatieve debietmeters systeem kan worden toegepast op de experimentele opstelling.
   4. Maatregel flow-gemedieerde dilatatie 3-5 min na de inleiding van de inductie van de stroom. De niveaus van intraluminale stroming (druk verlopen) kunnen worden in het bereik van 0 - 100 cmH ₂ O. verhogen elke toename van drukverschil door Δ10 cmH ₂ O elke 5-6 min, tot een maximum van 100 cmH ₂ O.
      Opmerking: Om te induceren stabiele laminaire flow in het lumen, beide micro glas canule tipformaten moeten zijn zeer dicht bij de binnendiameter van de arteriolen; anders zal het produceren van turbulente stroming binnenkant lumen en veroorzaken ongewenste meetfouten.
   5. Naar aanleiding van de flow-gemedieerde dilatatie beoordeling, door druk reservoirs terug te keren naar dezelfde hoogte (60 mmHg).
   6. Vervolgens wassen arteriole en kamer door het onmiddellijk verwijderen oplossing van kamer en vervangen door verse KREBS oplossing. Dit wordt gedaan met de nodige voorzichtigheid over de geschorste arteriole binnen de kamer niet te verstoren.
   7. Herhaalt dit proces 3 - 4 keer voor 20-30 min of totdat het geïsoleerde schip keert terug naar de rust basislijn diameter.
2. Acetylcholine-gemedieerde, endotheel-afhankelijke, vasodilatatie
   1. wanneer de obesitas arteriole is teruggekeerd naar de rust basislijn diameter, vooraf samentrekken vaartuig ~ 55% door het toedienen van endothelin-1 (ET-1, 10 ^{− 10} M) rechtstreeks naar de bad, zoals hierboven beschreven in punt 4.1.2.
   2. Na pre vernauwing, opeenvolgend beheren toenemende doses (2 µL) van acetylcholine die een receptor-gemedieerde, stikstofmonoxide agonist (Ach, 10 ^-9 tot 10 ^-5 M) rechtstreeks aan het bad. Opnemen van de verandering in arteriolar diameter 5 min na toediening van elke dosis.
   3. Zodra het vaartuig bereikt een plateau na toediening van de laatste dosis van Ach, was het schip 3 - 4 keer met KREBS oplossing. Het toestaan van 20-30 min voor vaartuig te herstellen en terug te keren naar de rust van de diameter van de basislijn. Om te helpen handhaven van de pH in de orgel-camber, wijzigen KREBS oplossing elke 15 min.
3. Broeden de arteriole met N _w - nitro - l-arginine methylester (L-naam, 10 ^-4 M), een inhibitor van de omwenteling van stikstofoxide synthase voor 30 min, en herhaal 4.2.1 en 4.2.2 te karakteriseren de relatieve bijdrage van stikstofmonoxide aan Ach-gemedieerde vaatverwijding.
4. Beoordelen endotheel-onafhankelijke vasodilatatie (vasculaire glad spierweefsel functie) en de levensvatbaarheid van het schip door een sequentiële toediening van steeds grotere doses van papaverine (10 ^-8 naar 10 ^-4 M) rechtstreeks aan het bad. Als de diameter van het vaartuig niet terugkomen, of groter zijn dan de rust diameter van de basislijn (Di) in reactie op papaverine (dat wil zeggen passende vasodilatatie), overwegen het vaartuig niet-levensvatbare en negeren van gegevenspunten.

5. Data-analyse en berekening

1. berekenen de vasculaire reactiviteit. Percentage vasodilatatie voor gegevens uitdrukking rekening voor basislijn verschillen vaartuig diameter te berekenen met de volgende vergelijking gebruiken:
   % vasodilatatie (DT-Dp/Di-Dp) × 100 =
   waar DT is de opgenomen diameter op een bepaald tijdstip (maximaal diameter), Dp is de diameter opgenomen na toevoeging van de vasoconstrictie agent (dwz. ET-1 geïnduceerde vernauwing diameter), en Di is de diameter gemeten onmiddellijk vóór de toevoeging van de vasoconstrictie agent (rust basislijn diameter). ⁹
2. vasodilatatie en vasoconstrictie gevoeligheid (dosis-respons) tot een agonist definiëren als de concentratie van Ach, papaverine of ET-1 dat 50% van de maximale respons (EG ₅₀) lokt die kan worden gedefinieerd door een sigmoïdale parameter en uitgezette, zoals eerder is beschreven. ¹⁰
   Opmerking: de Inter waarnemer reproduceerbaarheid studies van vasodilatatie van obesitas microvessels heeft een hoge correlatie coëfficiënt (CC) van 0,99 (n = 10 schip-experimenten) in ons laboratorium.

6. statistische analyse

1. Express continue metingen als bedoel ± SEM. Deze bedrijven meestal normaal worden verdeeld. Analyseren van vasculaire reactiviteit in obesitas arteriolen door herhaald-measures two-way ANOVA.
2. Vergelijken als alternatief, het gebied onder de curve (AUC) van het perceel voor de cumulatieve vasodilatatie aan de dosis-respons tussen behandelgroepen. In alle gevallen overwegen P < 0.05 statistisch significant.

Results

Ons laboratorium heeft gebruikt videomicroscopy om te onderzoeken van endotheel-afhankelijke en onafhankelijke vasodilatatie, evenals de vasocontractile functie van vetweefsel arteriolen geïsoleerd van subcutane en viscerale vet voor zwaarlijvige mensen. De karakteristiek van de experimentele opstelling wordt weergegeven in figuur 1A. Vetweefsel arteriolen zijn opgehangen tussen twee glazen capillaire pipetten en vastgezet met hechtingen binnen de orgel-kamer...

Discussion

De dissectie en de isolatie van obesitas arteriolen uit de omliggende weefsels kunnen een tijdrovend en arbeidsintensief proces met zorgvuldige aandacht voor detail en technisch protocol. De procedure microdissection vereist zorgvuldige vaardigheden en gespecialiseerde dissectie gebruiksvoorwerpen ter voorkoming van potentiële schade aan de gladde spieren of endothelial cel lagen van de microvasculature. Zelfs kleine toevallige lekke banden in de arteriolar muur kunnen voorkomen dat intraluminale overdruksystemen en resu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemische Naam
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calciumchloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Endotheline-1	Sigma Aldrich	E7764
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra azijnzuur (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Nw-nito-L-arginine methylester hydrochloride	Sigma Aldrich	N5751
Magnesiumsulfaat (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
Kaliumchloride (KCL)	Sigma Aldrich	P3911
Kaliumfosfaat (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Papaverine	Sigma Aldrich	P3510
Natriumbicarbonaat (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Natriumchloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (NaH2Po4)	Sigma Aldrich	S9638
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Pincet	Finescience tools	15000-08
Inverteer microscoop	Zeiss Achromat
Laboratoriumslangen	Euro-Pharm	250100306F999
Naald/pipet puller	David Kopf Instruments	720
Ophthalmische monofilament nylon naad	Surgical Specialties	A7756N
Schaar	Finescience tools	150000-08
Vessel Chamber	DMT	VAS v.2.1