Methodenartikel

In Vitro Karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon Afferent vezels in ratten

DOI:

10.3791/56090

⸱

27 september 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abnormale sensorische functie ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van functionele en inflammatoire darmziekten. Een protocol voor het elektrofysiologische opname van de Colon afferent zenuwen in een ex vivo -voorbereiding van het rat-colorectum wordt hier gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunctie van het Colon sensorische zenuwen heeft betrokken bij de pathofysiologie van verschillende gemeenschappelijke voorwaarden, met inbegrip van functionele en inflammatoire darmziekten en diabetes. Hier beschrijven we een protocol voor de in vitro -karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon afferents bij ratten. De colorectum, met de intact bekken ganglion (PG) aangesloten, wordt verwijderd uit de rat; superfused met carbogenated Krebs oplossing in de vergaderzaal van de opname; en gecanuleerde aan de uiteinden van het oraal en anaal te voorzien van de zwelling. Een bundel van de fijne zenuwen die afkomstig zijn van de PG is geïdentificeerd, en de activiteit van multiunit afferent zenuw is opgenomen met behulp van een zuignap elektrode. Zwelling van het Colon segment lokt geleidelijke stijgingen van de multiunit kwijting. Een analyse van de belangrijkste component is uitgevoerd om te differentiëren van de laagdrempelige, de hoge-drempel en de wide-Dynamiekomvang afferent vezels. Chemische gevoeligheid van Colon afferents kan worden bestudeerd door de administratie van het bad of intraluminale van test verbindingen. Dit protocol kan worden aangepast voor toepassing op andere diersoorten, zoals muizen en cavia's, en te bestuderen van de verschillen in de elektrofysiologische eigenschappen van thoracolumbar/hypogastric en lumbosacrale/bekken afferents van de dalende dikke darm in normale en pathologische condities.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het maag-darmkanaal (GIT) is rijkelijk geïnnerveerd met extrinsieke afferent zenuwen die vervoeren sensorische signalen van de darm naar het centrale zenuwstelsel en die bijdragen aan de gut-brain-interactie. Gewijzigde prikkelbaarheid van deze extrinsieke afferents, evenals gewijzigde centrale verwerking van de afferent ingangen, ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van GI voorwaarden, met inbegrip van functionele en ontstekingsziekten darm ziekten1. Sensorische informatie van de colorectum wordt voornamelijk via de thoracolumbar/hypogastric en de lumbosacrale/bekken zenuwen (PN)2overgebracht. Er is een verhoogde belangstelling bestuderen de elektrofysiologische eigenschappen van deze primaire afferent vezels in knaagdier ziekte modellen. Echter, in vivo elektrofysiologische registraties van de Colon afferents in knaagdieren is een technische uitdaging en vereist aanzienlijke chirurgische vaardigheden. Daarnaast hemodynamische wijzigingen, weefsel beweging en verdoving kunnen ook gevolgen hebben zenuw activiteit en gevoeligheid voor prikkels in vivotest. Daarom, in de afgelopen jaren hebben een toenemend aantal studies tewerkgesteld in vitro (ex vivo) preparaten voor de mens, verschillende soorten, waaronder muizen, ratten en cavia's te onderzoeken van de mechanismen van sensorische signaaltransductie in Colon afferents en de gewijzigde prikkelbaarheid in ziekten. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

Er zijn voornamelijk twee soorten ex vivo Colon voorbereiding gemeld: de "flat-blad" voorbereiding5,9,10 en de "buis" voorbereiding3,4. Een video protocol voor de "flat-blad" lymfkliertest colorectum voorbereiding geweest eerder gepubliceerde11. In dit protocol, de muis colorectum, met de PN) of lumbale splanchnic zenuwen (LSN) aangesloten, is gekapt en superfused in een kamer van het weefsel. De colorectum is opengesneden lengterichting en de zenuw bundel wordt uitgebreid tot een opname compartiment gevuld met paraffineolie. Zenuw activiteit is opgenomen met behulp van een monopolaire platina-iridium-elektrode. Het protocol voorziet in de identificatie van de Receptieve velden van individuele afferent vezels met behulp van onbevooroordeelde elektrische stimulatie. Het lokaliseert de toepassing van chemische stimuli, alsmede de toepassing van verschillende mechanische stimulatie paradigma's (bijvoorbeeld focal mucosal indringende en ze stretch), aan de afferent zenuwuiteinden. Omdat de zenuw moet worden uitgebreid tot een aparte kamer uit de zaal weefsel, is het essentieel om te houden van de bijgevoegde zenuw relatief lang; de succesvolle dissectie van de zenuwen vormt een uitdaging voor die nieuw aan deze methode. Meer recentelijk gepubliceerd Nullens et al. een video protocol voor de in vitro -opname van de lymfklieren afferents in lymfkliertest jejunal en Colon segmenten12. In deze voorbereiding "tube" is het segment van de darm met het mesenterium aangesloten bewaard gebleven, waardoor voor gesorteerde zwelling en de intra - en extra-luminal administratie van verschillende chemische stoffen. Aangezien het mesenterium zenuw is opgenomen met behulp van een zuignap elektrode, die kan worden geplaatst dicht bij het weefsel, kan afferent activiteit worden opgenomen, hoewel het mesenterium zenuw relatief kort is. Echter, het mesenterium zenuw bestaat uit gemengde bevolking van vagale en spinale afferent vezels die het jejunum innervate of thoracolumbar hypogastric. Lumbosacraal bekken afferents innervate de colorectum, die in dit protocol kan niet worden gediscrimineerd. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het elektrofysiologische opname van Colon afferents rat met behulp van de "buis" colorectum opstelling met een intact PG. Deze methode kan toestaan voor de karakterisatie van de functionele eigenschappen van lumbale splanchnic (hypogastric) en lumbosacrale bekken afferents.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de experimentele protocol gemeld hier is goedgekeurd door het dier ethisch comité van Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). de dissectie van de colorectum met intact ganglion en zenuw boomstam neemt een minimum van 15 minuten voor een persoon heel ervaren in deze techniek. Daarom is het noodzakelijk om te houden van het dierlijke leven maar onder diepe verdoving terwijl het uitvoeren van de ontledingen, zodat de levensvatbaarheid van het weefsel voor latere elektrofysiologische opname.

1. bereiding van de oplossing van de perfusie en Test verbindingen

  1. bereiden 5 L van Krebs oplossing: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, 1.2 mM CaCl 2 , en 11,5 mM glucose. Verzadig de oplossing met een 95% O 2 + 5% CO 2 gasmengsel. Pre ~ 500 mL van zuurstofrijk Krebs in de koelkast afkoelen.
  2. Voorbereiden aliquots van voorraad test verbindingen (1 mM capsaïcine in ethanol en 10 mM 5-hydroxytryptamine (5-HT) in een zoutoplossing) zo nodig. Verdun de voorraad in Krebs (voor Bad applicatie) en in een zoutoplossing (voor intraluminale beheer) tot de uiteindelijke concentratie slechts voorafgaand aan gebruik.

2. Voorbereiding van de elektrode opnemen

  1. trekken de elektrode van de opname van standaard glazen zonder innerlijke filamenten (1,5 mm buitendiameter buizen) met een trekker van de conventionele elektrode. Pas de instellingen van de trekker voor warmte en trekken zodat de schacht van de elektroden van de getrokken tussen 20 en 25 mm.

3. Weefsel collectie

  1. Anaesthetize de rat diep met behulp van natrium pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
  2. En tegelijkertijd steriliteit, bloot de buikholte door het uitvoeren van een middellijn insnijding op de buikwand met behulp van een scalpel. Trek het mesenterium en andere weefsels opzij om de colorectum bloot.
  3. Plaats het dier onder de Microscoop ontleden. Door middel van zorgvuldige dissectie, zoek de linker PG en identificeren van de PN en de LSN toetreden. Deze zenuwen een paar millimeter afstand van de PG. gesneden
    Opmerking: De PG ligt dicht bij de opsporing van colorectale kruising. Normaal gesproken 3-4 PN uit het ruggenmerg lumbosacrale en een LSN-project aan de PG ( Figuur 1).
  4. Knippen het pubica bot om het rectum bloot te stellen. Verwijderen van de weefsels (dat wil zeggen, de urineblaas, enz.) boven de colorectum; Wees voorzichtig om de PG intact laten.
  5. Offeren de rat door de intraveneuze injectie met een overdosis van pentobarbital. Transect van de dikke darm ongeveer 3 cm boven de PG en verwijderen van de colorectum van het dier met behulp van de verlostang.
  6. De colorectum overbrengen in een petrischaal gevuld met vooraf gekoelde Krebs oplossing. Verwijder de uitwerpselen door het voorzichtig spoelen van de dikke darm. Verwijderen van de urineblaas overblijfsel en andere weefsels zorgvuldig, zonder afbreuk te doen aan de PG.

4. Dissectie van de Colonic Afferent zenuwen

  1. plaats van de dubbele punt in een opname kamer (20 mL) en perfuse van het weefsel continu met carbogenated Krebs oplossing. Het tarief van de perfusie vastgesteldop 15 mL/min.
  2. Cannulate de colorectum aan de uiteinden oraal en anaal. Begin van de intraluminale infusie van de dikke darm met zoutoplossing met een snelheid van 10 mL/h in de mondelinge anale richting.
  3. Zoek de grote PG onder de Microscoop ontleden. Met insect pins waarmee werkmapberekeningen de ganglion. Met zorgvuldige dissectie, vinden een mooie tak van de zenuw die afkomstig zijn van het ganglion en loopt naar de dikke darm ( Figuur 1). Snijd de zenuw dichtbij de ganglion.
    Opmerking: Figuur 1 illustreert een opname van een zenuw tak distale aan de PG. De zenuw bevat waarschijnlijk een mengeling van bekken en lumbale splanchnic afferent vezels. U kunt ook een opname kan worden gemaakt van de PN en/of de proximale aan de PG. LSN
  4. Zet de Verwarming Bad en warm de Krebs oplossing te houden van de temperatuur van de kamer bij 34 ± 0,5 ° C.

5. Voorbereiding van de zuiging-elektrode

  1. nemen een vooraf getrokken glazen pipet (stap 2) en onder de Microscoop ontleden inspecteren. De tip van de elektrode met een paar pincet te breken zodat er van een formaat dat compatibel is met de diameter van de zenuw worden geregistreerd.
  2. Schuine rand van het puntje door het plaatsen van het dicht bij een lichtere flare.

6. Elektrofysiologische opname

  1. verbinden de schuine elektrode aan de elektrode-houder. Verbinding maken met een 10 mL spuit op de poort van de kant van de houder aan de negatieve of positieve druk uitoefenen op de elektrode.
  2. Sluit de houder aan de headstage van de bioamplifier en monteer de headstage op een manipulator.
  3. De elektrode naar de bad weefsel en de elektrode te vullen met de Krebs oplossing door zachte zuigkracht toe te passen totdat het contact op met de zilveren draad van de houder. Plaats het uiteinde van de elektrode dicht bij het snijden einde van de zenuw en onderdruk te zuigen van de zenuw in de elektrode van toepassing. Meer negatieve druk uitoefenen zodat ~ 1 mm van de zenuw in de elektrode wordt getrokken en een goede afdichting vormt.
  4. Beurt op de bioamplifier en reeks het filter tot 300-3000 Hz. het signaal op de oscilloscoop controleren en opnemen van het signaal van de zenuw (20-kHz sampling rate) en de intraluminale druk signaal (100-Hz sampling-snelheid) met behulp van een computer met een Prikker gegevensverwerking software.

7. Testen van de Colonic Afferent gevoeligheid

  1. toepassen oprit zwelling van de dikke darm door het sluiten van de drie-weg kraan op de canule outlet terwijl het voortdurend infusie van intraluminally. Controleren van de intraluminale druk totdat zij 60 mmHg, op dat moment open de drieweg-Tik op de zuig canule tot.
  2. Herhaal deze procedure op gezette tijden van 15 min. toepassen drugs extra- of intraluminally voor het testen van de chemische gevoeligheid van de zenuwen afferent.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 is de Schematische illustratie van de experimentele opstelling voor de ex vivo "tube" colorectum opstelling, met een vertegenwoordiger van een zenuw distale opnemen op de PG. De zenuw bevat vermoedelijk een mengsel van bekken en lumbale splanchnic afferents. Bij de voorbereiding van normale ratten hebben de Colon afferent zenuwen meestal een laag niveau van onregelmatige spontane activiteit. Oprit zwelling van de dikke darm induceert een gel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier gepresenteerd is een relatief eenvoudig experimentele methode te beoordelen van de elektrofysiologische eigenschappen van het Colon afferents van ratten. Het protocol (van weefsel dissectie voor het opzetten van de opname van de zenuw) duurt meestal ongeveer 2 uur om te voltooien. Weefsel-collectie (stap 3) en de voorbereiding van de zuiging elektrode (stap 5) zijn de kritische stappen. Het is van cruciaal belang om te kunnen om de PG, de LSN, en de PN te vinden en te verzorgen niet te beschadigen de ga...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd ondersteund door onderzoekssubsidies uit de nationale Natural Science Foundation van China (#31171066, #81270464) en de Sino-Duitse Science Center (GZ919).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium PentobarbitalShanghai Westang Bio-TechB558
CapsaicinSigmaM2028
Electrode pullerMicroData Instrument IncPMP107
Neurolog System (Bioamplifier)Digitimer, LtdNeurolog System
A/D converterCambridge Electronic DesignMicro1401
Data processing softwareCambridge Electronic DesignSpike2 version 6
Silver wireWorld Precision InstrumentsEP12
Glass tubesWorld Precision Instruments1B150-4
Electrode holderWorld Precision InstrumentsMEH3SBW
Heating bathGrantGR150
Dissecting microscopeLeicaZoom2000
Dissecting microscopeWorld Precision InstrumentsPZMIII-BS
Cigarette lighteranyNA
Surgical toolsWorld Precision InstrumentsNA
Insect pinshome-made from 0.1 mm stainless steel wireNA
Three way manipulatorWorld Precision InstrumentsKITF-R
RatsAnyNAAny strain/sex can be used.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
  10. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
  11. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  12. Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
  13. Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
  14. Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
  15. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  16. La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dissectie van het bekkenplexuszenugzuigelektrodecolontractieprincipale componentenanalysemechanosensorische activiteitchemische gevoeligheidstestenbioversterkerregistratie

Gerelateerde artikelen