Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Samenvatting

Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca^{2 +} signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Samenvatting

De AWESAM (een low-kosten eRoe stellate eenstrocyte method) protocol leidt tot een snelle, eenvoudige en goedkope manier voor het genereren van grote hoeveelheden van in-vivo-muis en rat Astrocyt monoculturen zoals : De hersencellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende hersengebieden, en na een week van celkweek, niet-astrocytic cellen zijn afgeschud door het plaatsen van de gerechten van de cultuur in een roteerapparaat gedurende 6 uur in de incubator. De resterende astrocyten zijn vervolgens gepasseerd in nieuwe platen met een Astrocyt-specifieke medium (zogenaamde NB + H). NB + H bevat lage concentraties van heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HBEGF), die wordt gebruikt in plaats van serum in medium. Na een groei in NB + H, hebben AWESAM astrocyten een Notti morfologie en functie prima processen. Bovendien, deze astrocyten hebben meer in-vivo-graag genexpressie dan astrocyten gegenereerd door eerder gepubliceerde methoden. CA^{2 +} imaging, blaasje dynamiek en andere gebeurtenissen dichtbij het membraan kunnen dus worden bestudeerd in de fijne astrocytic processen in vitro, bijvoorbeeldmet behulp van levende cellen confocal of TIRF microscopie. Met name vertonen AWESAM astrocyten ook spontane Ca^{2 +} signalering vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Inleiding

Astrocyten beïnvloeden hersenfunctie door trofische ondersteuning, doorbloeding, synaptic signaling en plasticiteit en intercellulaire communicatie - die allemaal mechanismen die centrum rond de dunne astrocytic processen. Het protocol van de AWESAM die hier worden beschreven kunt de studie van deze processen zonder inmenging van neuronen en andere glia, die nuttige bv, omdat de expressie van veel eiwitten en zelfs Ca^{2 +} signalering overlappen in verschillende hersenen cel typen. Verder is deze methode overwint beperkingen van de voorheen beschikbare technieken. In het bijzonder onze protocol voorziet in vivo-zoals morfologie (Notti astroc....

Protocol

Alle dierproeven die hier beschreven werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de Duitse dierenwelzijn.

Opmerking: De tijdlijn en de belangrijkste stappen van het protocol worden geïllustreerd in Figuur 1.

1. voorbereiding

1. De volgende oplossingen voor te bereiden.
   1. Voorbereiden DMEM + veelhoekige MD astrocyten kweken: DMEM met 10% FCS, 100 U penicilline en 100 µg/mL streptomycine.
   2. Bereiden NB + H voor het kweken van Notti astrocyten: neurobasal medium met 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 supplement, 1 x glutamine supplement, 100 U pe....

Resultaten

Astrocyten die mede gekweekt met neuronen en geteeld in NB + medium weergegeven Notti na 2 weken van cultuur (Figuur 2). Naast NB + medium, de mede gekweekte astrocyten ook blootgesteld aan onbekende neuron-afgeleide factoren die waarschijnlijk aan hun voortbestaan en morfologie bijdragen. In tegenstelling, verschijnen MD astrocyten gegroeid in DMEM + als monoculturen (na het afschudden van andere celtypes voor passage) veelhoekige na 2 weken. AWESAM astrocyt.......

Discussie

Vier stappen in het protocol zijn van cruciaal belang: 1) voorbereiding van de concentratie van de HBEGF tot precies 5 ng/mL, aangezien kleine stijging van de concentratie tot onvolwassen culturen, bijvoorbeeld leiden kunnen10 ng/mL HBEGF-zal onderscheiden astrocyten⁴; 2) vermijden bubbels in de oplossingen die bevatten van weefsels of cellen, die kunnen veranderen van de pH en belemmeren Astrocyt gezondheid; 3) vooraf zo media om de optimale pH en temperatuur voor de teelt van gezonde as.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300054	warm in 37 ºC waterbath before use
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	warm in 37 ºC waterbath before use
B-27 supplement	Gibco	17504-044	50X stock
Glutamax	Gibco	35050-061	100X stock
Penicillin / streptomycin	Gibco	15070-063	50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	without L-glutamine
DMEM	Gibco	41966029
HBEGF	Sigma	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049	1X
100 μm nylon cell strainer	BD	352360
Trypan Blue	Sigma	T8154
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	Hera Cell 240i cell culture incubator
Laboratory shaker	Heidolph	Rotamax 120	use inside cell culture incubator
Centrifuge	Eppendorf	5810 R