Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Summary

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Abstract

Momenteel de meeste in vitro modellen van wondgenezing, zoals gevestigde kras testen, betrekken studeren cel migratie en wond sluiting op twee-dimensionale oppervlakken. De fysiologische omgeving in welke in vivo wond genezing plaatsvindt is echter driedimensionale in plaats van twee-dimensionale. Het wordt steeds duidelijker dat cel gedrag verschilt sterk in tweedimensionale vs. driedimensionale omgevingen; Daarom is er behoefte aan een meer fysiologisch relevante in vitro modellen voor het bestuderen van de cel migratie gedrag in de wond sluiting. De hierin beschreven methode zorgt voor de studie van de cel migratie in een driedimensionaal model dat beter fysiologische omstandigheden dan tevoren vastgelegde tweedimensionale kras testen weerspiegelt. Het doel van dit model is te evalueren cel uitgroei via het onderzoek van de cel migratie van een sferoïde lichaam ingebed in een matrix van fibrine in aanwezigheid van pro - of anti - migratory factoren. Met behulp van deze methode, cel uitvloeisel van het lichaam sferoïde in een drie-dimensionale matrix kan worden waargenomen en na verloop van tijd via helderveld microscopie en analyse van sferoïde lichaamszone gemakkelijk meetbaar is. Het effect van pro-trekkende en/of remmende factoren op cel migratie kan ook worden geëvalueerd in dit systeem. Deze methode biedt onderzoekers met een eenvoudige methode voor het analyseren van cel migratie in driedimensionale wond verbonden matrices in vitro, waardoor de relevantie van in vitro cel studies voorafgaand aan het gebruik van in vivo dier modellen.

Introduction

Wondgenezing is een complex proces dat leidt tot het herstel van weefsel integriteit na letsel. Dit proces is onderverdeeld in vier overlappende stadia omsloten door hemostase, ontsteking, proliferatie en remodeling, die elk geregeld zijn door een complexe combinatie van oplosbare signalen, cel-matrix interacties en cel-cel communicatie. ^{1 , 2} de orkestratie van deze signalen regelt een veelheid van cellulaire reacties in de wondgenezing en bovenal cel migratie. ^{3 , 4} cel migratie is een zeer dynamisch proces afhankelijk van zowel cellulaire fenotypes ....

Protocol

1. dag 1: cel en de bereiding van het reagens

Opmerking: alle cel en reagens voorbereiding dient te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van verontreiniging van monsters.

1. Warm gefilterd Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een waterbad 37 ° C.
2. Voorbereiden neonatale menselijke dermale fibroblast (HDFn) media door haar aan te vullen opgewarmd DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine.
3. Ontdooi een flesje van bevroren HDFns en centrifuge voor 8 min. op 200 x g te verwijd....

Results

Sferoïde cultuur kan worden gebruikt om met succes het evalueren van het effect van pro- en anti-trekvogels agenten op fibroblast migratie in vitro
3D fibroblast spheroïden kunnen worden gevormd via opknoping drop cultuur over een periode van 72 h (Figuur 1). Na de periode van de cultuur, spheroïden worden ingebed binnen de klonter matrix en beeld met behulp van helderveld microscopie (Figuur 2). Het eerste ge.......

Discussion

Dit protocol maakt het mogelijk voor het onderzoek van de cel migratie in de wondgenezing ECMs door middel van een 3D-model in vitro verbonden . Een cruciale stap in de goede uitvoering van de procedure is de goede ontwikkeling van de fibroblast spheroïden; cel concentratie tijdens voorbereiding is geoptimaliseerd voor het geven van een beginconcentratie van 2.500 cellen/drop, waardoor spheroïden aan formulier betrouwbaar over een incubatietijd van 72 uur. Als een onvoldoende aantal cellen worden gebruikt, wordt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes