Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Summary

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro - en anti - migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Abstract

Momenteel de meeste in vitro modellen van wondgenezing, zoals gevestigde kras testen, betrekken studeren cel migratie en wond sluiting op twee-dimensionale oppervlakken. De fysiologische omgeving in welke in vivo wond genezing plaatsvindt is echter driedimensionale in plaats van twee-dimensionale. Het wordt steeds duidelijker dat cel gedrag verschilt sterk in tweedimensionale vs. driedimensionale omgevingen; Daarom is er behoefte aan een meer fysiologisch relevante in vitro modellen voor het bestuderen van de cel migratie gedrag in de wond sluiting. De hierin beschreven methode zorgt voor de studie van de cel migratie in een driedimensionaal model dat beter fysiologische omstandigheden dan tevoren vastgelegde tweedimensionale kras testen weerspiegelt. Het doel van dit model is te evalueren cel uitgroei via het onderzoek van de cel migratie van een sferoïde lichaam ingebed in een matrix van fibrine in aanwezigheid van pro - of anti - migratory factoren. Met behulp van deze methode, cel uitvloeisel van het lichaam sferoïde in een drie-dimensionale matrix kan worden waargenomen en na verloop van tijd via helderveld microscopie en analyse van sferoïde lichaamszone gemakkelijk meetbaar is. Het effect van pro-trekkende en/of remmende factoren op cel migratie kan ook worden geëvalueerd in dit systeem. Deze methode biedt onderzoekers met een eenvoudige methode voor het analyseren van cel migratie in driedimensionale wond verbonden matrices in vitro, waardoor de relevantie van in vitro cel studies voorafgaand aan het gebruik van in vivo dier modellen.

Introduction

Wondgenezing is een complex proces dat leidt tot het herstel van weefsel integriteit na letsel. Dit proces is onderverdeeld in vier overlappende stadia omsloten door hemostase, ontsteking, proliferatie en remodeling, die elk geregeld zijn door een complexe combinatie van oplosbare signalen, cel-matrix interacties en cel-cel communicatie. ^{1 , 2} de orkestratie van deze signalen regelt een veelheid van cellulaire reacties in de wondgenezing en bovenal cel migratie. ^{3 , 4} cel migratie is een zeer dynamisch proces afhankelijk van zowel cellulaire fenotypes en de biochemische en biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix milieu. ⁵ cellen voortdurend sonde hun milieu van de extracellulaire matrix door middel van integrine-gemedieerde trajecten; Dit proces maakt cellen te voelen van een breed scala van matrix eigenschappen met inbegrip van de topografie, stijfheid en opsluiting. Tweedimensionale (2D) analyse van cel migratie blijkt dat migratie wordt gedreven door lamellipodia formatie op geavanceerde kennisgebieden door middel van de generatie van actine-filament-bundels. Latere vorming van focal verklevingen op geavanceerde kennisgebieden, in combinatie met actomyosine gedreven contractie en intrekking bij de afvallende flank, rijdt de cel uit. ⁶ de cellulaire migratie three-dimensional (3D) op dit moment niet goed wordt begrepen, recente studies tonen echter aan dat 3D migratie is beduidend anders dan de hierboven mechanisme in 2D beschreven en waarschijnlijk door alteratief mechanismen gedreven wordt. Bijvoorbeeld, recente studies door Petrie et al. aangetoond dat, afhankelijk van de eigenschappen van de ECM, cellen in 3D-matrices tussen lamellipodium en lobopodium gedreven mechanismen van migratie schakelen kunnen. ⁷ omdat cel migratie een essentieel onderdeel van de wond genezing reactie is, 3D-modellen van cel migratie zijn cruciaal voor het begrip van fysiologische reacties op verschillende stimuli tijdens de wondgenezing. Hoewel cel trekgedrag op 2D oppervlakken is aangetoond dat variëren sterk van migratie in 3D-matrices, meest recente in vitro modellen van cel migratie tijdens het genezingsproces, met inbegrip van de gevestigde kras assay, wond gebruiken 2D enkelgelaagde culturen. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} meer onlangs ontwikkelde testen hebben een 3D matrix gebruikt, maar nog steeds cultuur cellen in een enkelgelaagde op de top van de matrix, dus de beperking van de mogelijkheid om echt recapituleren de driedimensionaliteit van de cel milieu in vivo. ¹⁵

Het doel van de hier beschreven methode is om te studeren cel migratie in een fysiologisch relevante 3D-model, in plaats van op een 2D ondergrond, om een meer robuuste inzicht van migratie reacties die zijn gekoppeld aan de toegepaste prikkels. Deze methode zorgt voor de evaluatie van cel migratie binnen een 3D fibrine clot matrix in aanwezigheid van de factoren die activeren of remmen trajecten die is gekoppeld aan cel migratie. Een matrix van fibrine werd gekozen voor deze methode als gevolg van de kritische rol van fibrine in een vroeg stadium van de wondgenezing; volgende letsel, een fibrine clot wordt gevormd binnen wond omgevingen te vloeien bloedverlies en fungeert als een steiger voor de eerste cel infiltratie tijdens weefselherstel en remodeling. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} bovendien fibrine klinisch als een chirurgische sealant wordt gebruikt en de samenstelling van de mastieken is gebonden aan cel migratie en ultimate genezing van resultaten. Een eerdere studie door Cox et al. fibroblast migratie met fibrine stolsels bestaat uit verschillende fibrine en trombine concentraties met het oog op het optimaliseren van een fibrine-sealant onderzocht. Migratie van cellen uit fibrine stolsels op kunststof gerechten werd in deze studies gekwantificeerd. ²⁰ hier presenteren we een methode waarmee de kwantificering van de migratie van de cellen binnen de 3D fibrine-omgeving. Terwijl de specifiek in dit protocol beschreven methode fibrine gebruikt, kan dit model eenvoudig worden aangepast voor het gebruik van alternatieve matrix materialen zoals gewenst, zoals collageen of andere 3D-matrices. Daarnaast presenteren wij het gebruik van de fibroblast spheroïden in deze test omdat fibroblast migratie in het bed van de wond van het allergrootste belang voor de synthese van de extracellulaire matrix en reparatie/remodelleren van weefsel is. Echter, tijdens de reparatie proces neutrofielen zijn het eerste celtype migreren naar het bed van de wond, gevolgd door macrofagen. Fibroblasten beginnen dan te infiltreren in de omgeving van de wond ongeveer 48 uur na de eerste schade, aan het begin van de proliferatieve fase van de wond genezingsproces. ¹⁹ deze test kan eenvoudig worden aangepast om op te nemen van neutrofiele granulocyten, macrofagen, of andere celtypes te evalueren hoe wijzigingen in fibrine clot structuur van invloed zijn op migratie van deze celtypes. ²¹

Ter uitvoering van deze bepaling, ten eerste, een sferoïde fibroblast gevormd met behulp van een wijziging van de technieken beschreven voor cultuur van de cel van de stam. ²² de fibroblast sferoïde wordt vervolgens omgezet in een 3D fibrine-matrix, waarna uitgroei kan worden gemakkelijk gecontroleerd en gekwantificeerd gedurende meerdere dagen. Dit protocol rekening wordt gehouden met de 3D van fysiologische systemen door inbedding 3D cel spheroïden binnen een matrix van fibrine, dus het vermijden van de beperkingen in relevantie teweeggebracht door het gebruik van een 2D groei oppervlak met een enkelgelaagde cel naar model trekgedrag, terwijl toch toe te staan voor de evaluatie van de werking van de cel in een zeer gecontroleerde in vitro -omgeving.

Protocol

1. dag 1: cel en de bereiding van het reagens

Opmerking: alle cel en reagens voorbereiding dient te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van verontreiniging van monsters.

1. Warm gefilterd Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een waterbad 37 ° C.
2. Voorbereiden neonatale menselijke dermale fibroblast (HDFn) media door haar aan te vullen opgewarmd DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine.
3. Ontdooi een flesje van bevroren HDFns en centrifuge voor 8 min. op 200 x g te verwijderen cryopreservatie medium. Resuspendeer de cellen in de voorbereide HDFn media bij een dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen/mL en zaad in een maatkolf van het cultuur T-75.
4. Plaats de kolf in een incubator (37 ° C, 5% CO ₂) dat de celproliferatie.
5. Winkel HDFn media bij 4 ° C.
6. Pro - en anti - migratory reagentia bereiden desgewenst.

2. Dag 3: Sferoïde voorbereiding

1. de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
2. Wanneer cellen bereikt 80% confluentie, gecombineerd media en voeg 5 mL van 0,25% trypsine-EDTA. Winkel destillatiekolf in een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten om volledig los van cellen van het oppervlak van de kolf te.
3. 5 mL van verwarmde media Voeg aan de maatkolf om te neutraliseren de trypsine.
4. In een microcentrifuge buis, meng 10 μL van Trypan Blue en 10 μL van de celsuspensie.
5. Centrifuge de oorspronkelijke celsuspensie gedurende 8 minuten op 200 x g.
6. Terwijl de celsuspensie worden gecentrifugeerd, 10 μL van de celsuspensie Trypan Blue toevoegen aan een hemocytometer en uitvoeren van een cel tellen.
7. Na centrifugeren, gecombineerd media zonder het loskomen van de cel-pellet. Resuspendeer de pellet cel bij een concentratie van 1,25 x 10 ⁵ cellen/mL.
8. Voeg 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar de onderkant van een 10 cm petrischaal te handhaven een gehydrateerd klimaat tijdens sferoïde groei.
9. Omkeren de deksel van de petrischaal. Voeg enkele druppels voor 20 μL van de celsuspensie op de binnenzijde van de deksel van de petrischaal.
10. Snel het deksel weer omkeren en plaats deze terug aan de onderkant van de schotel, voorzichtig om niet te verjagen van de hangende druppels. Figuur 1 illustreert met succes gevormde hangende druppels.
11. Zorgvuldig plaats de schotel in een 37 ° C incubator en toestaan spheroïden om te groeien in een hangende drop cultuur voor een periode van 72 h.

3. Dag 6: Het inbedden van spheroïden in 3D Matrix

1. de volgende uitvoeren in een cultuur kap ter voorkoming van verontreiniging van monsters.
2. Voor de vorming van eerste fibrine laag, maken een klonter-oplossing van voldoende volume toe te voegen 100 μl van clot oplossing per putje voor zoveel wells als nodig (1 sferoïde per putje). Stolsels bestaan uit 10% 10 X HEPES buffer door volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl ₂, pH 7.4), 2 mg/mL menselijk fibrinogeen en 0.1 U/mL menselijke Alfa trombine. Het resterende deel van de klonter volume bestaat uit ultrazuiver water.
   1. Toevoegen trombine laatst en snel toevoegen oplossing aan gewenste putjes in een 48-well plaat om te voorkomen dat stolsels actinemonomeren voorafgaand aan wordt toegevoegd aan putjes.
3. Voorzichtig schudden/kraan goed plaat om ervoor te zorgen dat fibrine clot mengsel is de gehele coating goed, en plaats dan goed plaat in de incubator voor 1 h om de onderste clot laag te polymeriseren. Niet schud goed plaat hard genoeg voor het opwekken van de luchtbel vorming; gewoon rock plaat als nodig is totdat het geheel van de put is bekleed. Als grotere clot volumes worden gebruikt, deze stap niet noodzakelijk kan zijn.
4. Spheroïden overbrengen in de laag fibrine.
   1. Verwijderen de put plaat en de petrischaal met spheroïden in de opknoping cultuur uit de incubator neerzetten en spheroïden onder een microscoop te onderzoeken. Vervolgens zet de schotel in de cultuur kap.
   2. Zorgvuldig het omkeren van de deksel van de petrischaal toegang naar de opknoping drop culturen.
   3. Met behulp van een naald van de 21 G verbonden met een spuit van 1 mL, zorgvuldig transfer een druppel uit het omgekeerde deksel in het midden van elk goed, zorg niet om het doorprikken van de gepolymeriseerde fibrine laag coating van de bodem van de put. Om effectief de daling, Trek langzaam de daling in de naald. Stoppen met het trekken van de zuiger terug zodra de gehele daling binnen de naald; luchtbellen, die effectieve sferoïde overdracht of latere imaging verstoren kunnen terug te trekken de daling te ver kan introduceren.
   4. Onderzoeken van de goed plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de spheroïden correct in alle gewenste putten hebben overgedragen.
5. Voor de vorming van tweede fibrine laag, maken een andere clot oplossing met behulp van de dezelfde voorbereiding zoals hierboven voor de oprichting van de eerste laag fibrine (stap 3.2). Zorgvuldig Pipetteer 100 μl op elke daling sferoïde-bevattende en onderzoeken onder een Microscoop opnieuw om ervoor te zorgen dat de spheroïden nog steeds intact zijn en zijn niet geduwd aan de randen van de putten.
6. De goed plaat aan de incubator terug en laat de tweede laag te polymeriseren voor 1 h.

4. Dag 6: Toevoeging van Pro-trekkende of remmende factoren

1. warme HDFn media tot 37 ° C.
2. De volgende stappen uitvoeren in een kap om verontreiniging te voorkomen.
3. Media voorbereiden op elke groep met inbegrip van de juiste concentraties van pro/anti-migratory agenten moeten worden geëvalueerd.
4. Verwijderen van de goed plaat uit de incubator en plaats in de kap van een cultuur.
5. Voeg toe 500 μL van standaard media aan elk putje van de controlegroep sferoïde, 500 μL van remmende media aan elk putje van de migratie-geremd sferoïde groep en 500 μL van pro-trekkende media aan elk putje van de groep migratie-enhanced sferoïde.
6. De goed plaat terug te keren naar de incubator.
7. Verandering media elke 48 h.

5. Dagen 6-9: evaluatie van de migratie van de cel en proliferatie

1. afbeelding spheroïden met helderveld microscopie onmiddellijk na toevoeging van media (0 h) en vervolgens elke 24 h voor 72 h. Optioneel: op elk tijdstip, een z-stack beeld te nemen om te bepalen of migratie plaatsvindt in vliegtuigen buiten het primaire gebied van focus. In onze ervaring dit niet het geval; het is echter nuttig om ervoor te zorgen dit is het geval in elk experiment.
2. Gebruik ImageJ cel uitgroei in elk putje bepalen door het analyseren van de procentuele toename van de ruimte voor elke sferoïde door het traceren van de rand van een cel voor elke sferoïde op elke opeenvolgende tijdstip en met behulp van de " maatregel " functie voor het verkrijgen van het gebied.

Results

Sferoïde cultuur kan worden gebruikt om met succes het evalueren van het effect van pro- en anti-trekvogels agenten op fibroblast migratie in vitro
3D fibroblast spheroïden kunnen worden gevormd via opknoping drop cultuur over een periode van 72 h (Figuur 1). Na de periode van de cultuur, spheroïden worden ingebed binnen de klonter matrix en beeld met behulp van helderveld microscopie (Figuur 2). Het eerste ge...

Discussion

Dit protocol maakt het mogelijk voor het onderzoek van de cel migratie in de wondgenezing ECMs door middel van een 3D-model in vitro verbonden . Een cruciale stap in de goede uitvoering van de procedure is de goede ontwikkeling van de fibroblast spheroïden; cel concentratie tijdens voorbereiding is geoptimaliseerd voor het geven van een beginconcentratie van 2.500 cellen/drop, waardoor spheroïden aan formulier betrouwbaar over een incubatietijd van 72 uur. Als een onvoldoende aantal cellen worden gebruikt, wordt...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materialen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L Glucose, met Sodium Pyruvaat, zonder L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM dat al L-glutamine bevat, kan ook worden gebruikt
100mm Tissue Cultuurschaal, Niet-Behandeld, Gesteriliseerd, Niet-Pyrogen	VWR	10861-594	Schalen van elk formaat kunnen worden gebruikt voor druppelcultuur
Fetaal Runderserum uit door USDA goedgekeurde landen, hitte-geïnactiveerd, steriel gefilterd, getest voor celcultuur	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Niet nodig als u DMEM gebruikt dat al L-glutamine bevat
Penicilline-Streptomycine Oplossing gestabiliseerd, steriel gefilterd, met 10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Menselijke Dermale Fibroblasten, neonataal	Thermo Fisher	C0045C	Kan worden vervangen door andere celtypen van belang
21 G x 1 1/2' naald	BD	305167	22 G x 1 1/2 naalden werken ook
1 mL spuit	VWR	89174-491	Spuiten van elk volume kunnen worden gebruikt
Cel Cultuur Multiwell Platen, Polystyreen, Greiner Bio-One (Afzonderlijk Verpakt) (48 putjes)	VWR	82051-004
Huiselijke Fibrinogeen - Plasminogeen, von Willebrand Factor en Fibronectine Gedepleteerd	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Kan worden vervangen door matrixeiwit van belang
Huiselijke Alfa Trombine	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	Kan niet noodzakelijk zijn, afhankelijk van het matrixeiwit van belang
Uitrusting
BSL2 celcultuur kap
Celcultuur incubator
Omgekeerde microscoop met 10X objectief
Centrifuge compatibel met 15 mL buizen