Methodenartikel

Stereological raming van de Dopaminerge Neuron nummer in de muis Substantia Nigra met behulp van de optische Fractionator en standaard microscopie apparatuur

DOI:

10.3791/56103

⸱

1 september 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk presenteert een stapsgewijze protocol voor de onbevooroordeelde stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel nummers in de muis substantia nigra met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, een lichte Microscoop, een tabel van de gemotoriseerde object (x, y, z vliegtuig), en publiek domein-software voor digitale beeldanalyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In pre-klinische van Parkinson onderzoek is analyse van het nigrostriatal-darmkanaal, met inbegrip van de kwantificering van de Dopaminerge neuron verlies in de substantia nigra, essentieel. Voor het inschatten van de totale Dopaminerge neuron nummer, onbevooroordeelde stereology met behulp van de optische fractionator-methode wordt momenteel beschouwd als de gouden standaard. Omdat de theorie achter de optische fractionator methode complex is en stereology moeilijk is te bereiken zonder gespecialiseerde apparatuur, bestaan verschillende verkrijgbare volledige stereology systemen die de benodigde software bevatten, zuiver tellen de redenen voor de cel. Sinds de aankoop van een gespecialiseerde stereology setup is niet altijd haalbaar is, om vele redenen, dit verslag wordt een methode beschreven voor de stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel met behulp van standaard microscopie apparatuur telt, met inbegrip van een lichte Microscoop, een gemotoriseerd tabel object (x, y, z vliegtuig) met beeldbewerkingssoftware, en een computer voor analyse. Een stapsgewijze uitleg wordt gegeven over het uitvoeren van stereological kwantificering met behulp van de methode van de optische fractionator en voorgeprogrammeerde bestanden voor de berekening van de geschatte cellen worden geleverd. Om te beoordelen van de juistheid van deze methode, werd een vergelijking met gegevens die zijn verkregen uit een commercieel verkrijgbare stereology apparaat uitgevoerd. Vergelijkbare cel nummers werden gevonden met behulp van dit protocol en de stereology apparaat, dus het aantonen van de precisie van dit protocol voor onbevooroordeelde stereology.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwantificering van de neuronale cel nummer is cruciaal in de pre-klinische van Parkinson onderzoek om te bepalen van het niveau van neurodegeneratie binnen de substantia nigra (SN)1,2. De onbevooroordeelde stereological schatting van het aantal cellen in een gebied van belang wordt beschouwd als de gouden standaard3,4,5.

Vóór de komst van onpartijdige stereology, was het aantal neuronen in secties beoordeeld door het manipuleren van de getelde cel profielen om te corrigeren voor de variabele waarschijnlijkheid dat neuronen in zicht in een sectie komen. Een van de meest gebruikte methoden was de correctie van de graven van de gekwantificeerde cel beschreven door Abercrombie6. Deze methode geprobeerd rekening dat cellen meer dan één keer kunnen worden gekwantificeerd, als fragmenten van dezelfde cel in aangrenzende dunne secties worden gevonden. Daarom, Abercrombie en andere auteurs gegenereerd vergelijkingen die veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de getelde cellen7,8 vereist. Deze aannames waren echter meestal niet gerealiseerd en dus geleid tot systematische fouten en divergentie van de werkelijke celaantal (dat wil zeggen, bias). Bovendien kon de bias niet verlaagd worden door aanvullende monsters3.

Voor de stereological schatting van cel nummers met behulp van de optische fractionator, worden wiskundige beginselen toegepast om direct de cel nummers direct in een gedefinieerde, 3-dimensionale volume schatten. Het voordeel van deze methode is dat het geen veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de cellen wordt geteld. Dus de geschatte cel nummers zijn dichter bij de werkelijke waarden en dichter als de grootte van de steekproef (dat wil zeggen, onbevooroordeelde)3 toeneemt. Omdat vele regels moeten worden gevolgd bij het gebruik van stereology om te houden van de methode onbevooroordeelde, kant-en-klare commerciële stereology systemen zijn ontwikkeld (Zie voor herziening, Schmitz en Hof, 20054). Gespecialiseerde stereology systemen implementeren ontwerp gebaseerde stereological methoden met een vooraf gedefinieerd sondes en bemonsteringsplannen voor stereological evaluaties die tot onafhankelijkheid van vorm, grootte, ruimtelijke verdeling en oriëntatie van leiden de cellen die moeten worden geanalyseerd4,9. Echter zijn commercieel verkrijgbare stereology systemen duur; deze kan uitvoering in nieuw onderzoek beperken.

Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een bruikbare techniek voor de ontwerp-gebaseerd stereological schatting van Dopaminerge cel graven in de muis SN, dienst van de optische fractionator methode en met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, licht Microscoop, standaard Microscoop software en een gemotoriseerde x, y, z toneel). Hiervoor is een geleidelijke gids op hoe verwerken muis hersenweefsel en hoe te schatten SN cel nummers met behulp van ontwerp gebaseerde onbevooroordeelde stereology gepresenteerd. Bovendien worden de sjablonen voor de berekening van de geschatte cel nummers en coëfficiënten van fout (CE) geleverd.

De hier beschreven methode is niet beperkt tot de analyse van de SN, maar kan worden aangepast voor gebruik in andere anatomisch gedefinieerde regio's van de muis of rat hersenen. Bijvoorbeeld, is onbevooroordeelde stereology gebruikt voor het schatten van de neuronale cel nummers in de hippocampus10 en de locus coeruleus11. Celtypes dan neuronen, zoals astrocyten12 en microglia13, kunnen daarnaast ook worden beoordeeld. Deze methode kan dus nuttig aan wetenschappers die willen implementeren onbevooroordeelde stereology in hun onderzoek, maar zijn niet bereid om te besteden een heleboel geld voor de aankoop van een stereology systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

alle internationale, nationale en/of institutionele richtsnoeren van toepassing voor de zorg en het gebruik van dieren werden gevolgd. Het protocol is goedgekeurd door de plaatselijke autoriteiten op de Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland.

1. verwerking van weefsel en Immunohistochemistry

  1. euthanaseren muizen met CO 2 of een andere goedgekeurde methode.
  2. Perfuse zes 12-week-oude C56Bl/6N mannelijke muizen transcardially met 10 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een 25-G naald en een infusiepomp, gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PBS 70 mL.
    Let op: PFA is toxische, allergene en kankerverwekkende.
  3. Ontleden van de hersenen van de muis in de coronale vlak met een hersenen matrix slicer op de regio van +0.74 van Bregma (figuur 25, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas 14) mm.
  4. Zet het dorsale deel van de hersenen, met inbegrip van de SN, in 4% PFA in 0,1 M PBS voor 1 d bij 4 ° C voor onderdompeling-fixatie.
  5. De PFA naar 30% sacharose/0,1 mol PBS oplossing voor cryo-bescherming uit te wisselen en incubeer voor een ander 2 d bij 4 ° C.
  6. Zet het dorsale deel van de hersenen in een cryomold gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde en langzaam het bevriezen van het weefsel in vloeibare droogijs-gekoelde tolueen.
    Let op: Droogijs is extreem koude (-78 ° C); gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van handschoenen, tijdens het werken met droogijs. Droogijs verdampt in CO 2; Daarom werken in een zuurkast.
  7. Serieel gesneden 30-µm cryo-secties in de coronale vlak en het verzamelen van de secties, begint op 2,46 mm van Bregma (figuur 51, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas 14) en eindigt bij 4,04 mm van Bregma (figuur 64, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas 14).
  8. Slaan vier reeksen in buizen die zijn gevuld met cryoprotectant (30% glycerol ethoxyethanol van 30% en 40% PBS) bij-20 ° C. Tijdens de vectorafbeeldingsbestanden procedure, de rechter hersenhelft te markeren door een klein gaatje prikken in de bovenste regio van de hersenstam.
  9. Voor de immunohistochemische kleuring, selecteert u een aantal secties per muis. Preincubate vrij zwevende secties voor 1 h in 10% normale geit serum (NGS)/2% BSA/0.5% wasmiddel in 0,1 mol PBS op een shaker. Incubeer de secties met konijn anti-muis tyrosine hydroxylase (TH; 1:1,000 verdunning) antilichaam verdund in 2% NGS/2% BSA/0.5% wasmiddel in 0,1 mol PBS's nachts bij 4 ° C.
  10. Toepassen secundaire antilichamen tegen konijn Igs (1:100 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door avidin/Biotine reagens (1:100 verdunning). Incubeer en vlek met 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) en H 2 O 2. De secties na kleuring hen op gecoate object dia's mount.
    Opmerking: TH + Dopaminerge SN neuronen worden weergegeven in Figuur 1a. Door kleuring van één reeks, zijn een gemiddelde van 13 SN secties, zich uitstrekt van de rostraal tot caudal gedeelten van de SN pars compacta (SNpc) en reticulata, gekleurd per dier ( Figuur 1b). De secties worden gescheiden door 120 µm (1/4-serie) ( Figuur 1 c).
    Let op: DAB is een verdachte kankerverwekkend. Het is giftig bij contact en inhalatie. Gebruik van PPE wanneer u werkt met DAB.

2. Overname van afbeeldingen

  1. vangen TH immunohistochemisch gekleurd SN secties digitaal via imaging software die is gekoppeld aan een microscoop. Apart analyseren van elke sectie één reeks.
  2. De optie dia scan van de imaging-software gebruiken. Opslaan in TIFF-indeling voor afbeeldingen van hoge kwaliteit (Figuur 2).
    Opmerking: Beeldresolutie is 312 pixels per cm.
  3. Pers " ophaal " te openen van het venster van de overname (Figuur 2a).
  4. Stelt de weggooien op " 2 " voor grijswaardenafbeeldingen.
    Opmerking: De verwerving van grijswaardenafbeeldingen in plaats van kleurenafbeeldingen vermindert de grootte van het afbeeldingsbestand definitieve stack (Figuur 2a).
  5. Klik op " Toon Live " in het venster van de overname een nieuw venster weergegeven: het live beeld van de sectie te openen (Figuur 2 een en b).
  6. Klik op " stadium " in het venster van de overname. Kies " scannen dia " in het dropdownmenu en het selectievakje het vak (Figuur 2 c).
    Opmerking: Hierdoor is de overname en de uitlijning van sterk vergrote SN beelden (630 X vergroting) in de x, y-vlak, alsmede de overname van stapel beelden met een afstand tussen opeenvolgende beelden van 1 µm in het z-vlak, die betrekking hebben op een totaal bereik van 13 µ m.
  7. Selecteer de 2.5 X doelstelling om te zoeken naar de SN.
  8. De doelstelling tot en met 63 x. wijzigen
  9. De linker bovenhoek (TopLeft) (Figuur 2 c) en de lagere juiste hoek (LowRight) (figuur 2d) van de sectie definiëren door te klikken op " Set. "
  10. Klik op " Z-serie " en controleer de " Z-Plane serie " vak (figuur 2e).
  11. Bepalen de werkelijke gemonteerde dikte van de secties op drie tellen van de willekeurig geselecteerde sites per sectie met behulp van het imaging software. Voor dit, klikt u op " weergave Top Offset " aan de bovenkant van de sectie (figuur 2e) definiëren en klik vervolgens op " Stop weergave Top " (figuur 2f). Daarna, klik op " weergave onder Offset " (figuur 2f) en klik vervolgens op " Stop weergave onder " (Figuur 2 g). Noteer de dikte van de sectie.
  12. Aftrekken 3 µm (guard zone) vanaf de bovenkant gecompenseerd en typt u het resultaat in de bovenste offset sleuf (Figuur 2 h). Aftrekken van 13 µm (hoogte van de optische disector) van het nummer van de bovenste marge en typt u het resultaat in de bodem offset sleuf (figuur 2i). Selecteer de volgende parameters: stappen, 14; grootte, 1,00 (figuur 2i).
    Opmerking: Dit komt overeen met een dikte in het z-vlak van 13 µm, met een 1-µm afstand tussen opeenvolgende beelden.
  13. Selecteer de map voor het opslaan van het bestand (figuur 2j).
  14. Klik op " reeks " om te beginnen met de overname (figuur 2j).
  15. Klik op " verwerking " en selecteer de volgende parameters: " alle vliegtuigen, " van " volgorde; " " Montage; " en de " snel " en " Stitching " vakken, met een afbeelding overlapping van 10% (Figuur 2 k). Steek de beelden door te klikken op Start " start ".
    Opmerking: Dit zal genereren stapel afbeeldingen p.a. (Figuur 2 l, Figuur 3a -e).

3. Volgorde van Stereological evaluatie

  1. uitvoeren van de analyse van SN stapel afbeeldingen met behulp van de NIH ImageJ softwareversie 4.7.
  2. Downloaden de twee plugins die nodig zijn op de website van ImageJ.nih.gov: de " raster Overlay " plugin 15 en de " cel teller " plugin 16. Installeer beide plugins zoals beschreven.
  3. Voor onbevooroordeelde stereological beoordeling, het tellen om parameters te definiëren als volgt: rastergrootte, 130 x 130 µm; counting frame, 50 x 50 µm; en optische disector hoogte, 13 & #181; m.
  4. Open de afbeelding door te klikken op " bestand " → " Open " (figuur 4a) schaal van het beeld instellen met behulp van de " analyseren " → " Set schaal " opdracht (figuur 4b). Voor deze stap, veranderen de gedefinieerde grootte van pixels naar µm (Figuur 4 c).
    Opmerking: Voor de geanalyseerde beelden, 425 pixels komt overeen met 100 µm.
  5. Selecteer de " Plugins " → " raster " → " raster Type: lijnen " opdracht willekeurig invoegen een raster. Controleer de " willekeurige Offset " vak. Definieer de grootte van een vierkant binnen het raster (raster-plein) als 130 µm x 130 µm = 16,900 µm 2 ( Figuur 3b en Figuur 4 d en e).
  6. Verandering image type uit 16-bits RGB-kleur (Klik op " Image " → " Type " → " RGB kleur ") (figuur 4f). Zoek de SNpc, zoals beschreven door Baquet et al. 17. de SNpc met omcirkelen de " gereedschap Penseel " (borstel breedte: 11) ( Figuur 3 c en Figuur 4 g -Ik).
  7. Ongedaan maken de " schaal instellen " command door te klikken op " analyseren " → " Set schaal " → " Klik op schaal verwijderen " (figuur 4j -l) om de prestaties van de berekeningen in pixels eerder dan µm.
  8. Maken van een screenshot (Figuur 4 m), uitgezonderd naar de spiegelbeeld vijl en open het nieuwe bestand met ImageJ (figuur 4n). Selecteer " punt " (figuur 4o) en de breedte van een borstel van 25 (Figuur 4 p). Markeer elke raster-plein dat contacten de SN voor plaatsing van een optische disector (figuur 4q). Analyses van het celaantal uit te voeren in alle optische disectors, die volledig zijn gelokaliseerd of gedeeltelijk binnen de contour SN.
  9. Selecteer een raster-vierkant dat bestaat uit delen van de SN. Maatregel de linker bovenhoek van dit plein met de cursor in ImageJ te definiëren van de x- en y-coördinaten om te beginnen met (figuur 4r).
    Opmerking: Coördinaten wordt ingevoegd voor optische disector positionering met behulp van de " positie van de optische disector " (figuur 4s), zoals beschreven in stap 4.
  10. Berekenen van de positie van de optische disector met behulp van de sjabloon van de spreadsheet getiteld " optische disector positie, " zoals beschreven in stap 4.
  11. Kalibreren de optische disector (macro geschreven door Christopher S. Ward, Aanvullende bestand) door te klikken op " Plugins " → " macro's " → " bewerken " (figuur 4t), opent de " opt_dis_ grid.txt " bestand (figuur 4u) en definieer de grootte van de " usergrid " in pixels die overeenkomt met de x, y dimensie van de optische disector (figuur 4v). Selecteer een formaat van 50 µm x 50 µm, zodat de grootte van één kant van de usergrid wordt gedefinieerd als 212.5 pixels (50 x 4,25 pixels).
  12. Bepalen de positie van de optische disector in het beeld van de stack door het invoegen van de ImageX en ImageY coördinaten die het midden van de optische disector (figuur 4v bepalen). De macro uitvoeren (" macro's " → " Macro uitvoeren ") (figuur 4w).
    Opmerking: De grid zal verdwijnen uit de stapel afbeelding ( Zie afbeelding 3d en Figuur 4 x). De optische disector zullen blijven bestaan wanneer neer het bewegen in het z-vlak ( 3e cijfer en Figuur 4 x).
  13. Selecteer " Plugins " → " cel teller " om te beginnen de cel Counter plugin (Figuur 4). Initialiseren van de teller van de cel en selecteert u een markeringstype (figuur 4z). Inzoomen op de afbeelding (Klik op " + ") en het uitvoeren van de stereological beoordeling van de nummers van de cel bij een vergroting van 200%.
  14. Identificeren Dopaminerge neuronale perikarya door hun ronde of ovale vorm en cel grootte ( Figuur 1a). Het aantal cellen met behulp van stereological regels kwantificeren.
    Opmerking: Aangezien de optische disector is een 3-dimensionale kubus ( figuur 5a), definiëren de uitsluiting als de voorkant, links, en top kanten van de kubus (rood). Daarom, don ' t graaf TH + cellen die komen in contact met de rode lijn (linker- en voorzijde) of de bovenkant kant. De resultaten van de graven van de cel toevoegen aan het bereid werkbladbestand recht, " berekening van cel graaf " (stap 5).
  15. Volgens de SN-afbeelding, berekenen het volgende raster-vierkant op waarin de optische disector voor de volgende cel telling, met x, y stappen de grootte van het bovenliggende raster ( Figuur 5b) en de " optische disector positie " werkblad sjabloon, zoals beschreven in stap 4.
  16. Uitvoeren van een schatting van de cel nummer met behulp van de " berekening van cel graaf " werkblad (stap 5).

4. Berekening van de optische Disector positie met behulp van de " optische Disector positie " werkblad sjabloon

  1. berekenen de grootte en de positie van elke optische disector te worden geplaatst in het bovenliggende net binnen de omtrek van de SN ( Figuur 5b) met behulp van de " optische disector position.xlsx " werkbladbestand (Aanvullende bestand).
  2. Invoegen de conversie van pixel per µm, zoals gedefinieerd door de " Set schaal " commando, in de geel gemarkeerde posities van de " optische disector position.xlsx " bestand ( Figuur 6a en aanvullende bestand ).
  3. Invoegen de geplande grootte van de optische disector en de grootte van het raster-plein van het bovenliggende raster, gedefinieerd door de lengte van een zijde (in µm), de Oranje gemarkeerde posities.
    Opmerking: De resultaten worden afgebeeld in de rood vakken naast de oranje vakken.
  4. Start met het raster-plein binnen de SN-omtrek die werd bepaald als het startpunt (een raster-plein was geselecteerd om mee te beginnen, zoals in stap 3.9, hierboven).
  5. Invoegen de x- en y-coördinaten, uitgedrukt in stap 3.9, in de groene vakken van het bestand (met behulp van deze waarden, de x-, y-coördinaten voor het midden van de optische disector binnen dit eerste plein zijn berekend, en de resultaten worden afgebeeld in de blauwe dozen). Voer de macro opt_dis_grid.txt (Aanvullende bestand).
  6. Berekenen de x, y-coördinaten van de opeenvolgende optische disectors door het invoegen van de afstand van de grid-plein (gemeten in aantal pleinen) ten opzichte van het eerste raster-vierkant (bruine dozen).
    Nota: + x: raster-square ligt aan de rechterkant; -x: raster-square ligt aan de linkerkant; + y: raster-square ligt aan de bodem; -y: raster-square ligt naar de top. Resultaten worden weergegeven in de grijze vakken.

5. Schatting van de cel nummer met behulp van de " berekening van de telling van de cel " werkblad

  1. berekenen het geschatte aantal TH + SN cellen per dier (N) met behulp van de formule gepubliceerd door West et al.., 1991 3, waar ∑ Q - is gedefinieerd als het totale aantal TH + neuronen in alle optische disectors van één hersenen sectie geteld.
    Opmerking: De hoogte van de optische disector (h) met betrekking tot de gemeten dikte van de sectie (t) is opgenomen in de vergelijking. Het gebied bemonstering breuk (asf) wordt gedefinieerd als het aandeel van de ruimte (A) van de framegrootte van de optische disector (een optische disector) binnen de vierkante grootte van het raster (een x, y stap) (een optische disector/A x, y stap) ( Figuur 3b), en de sectie bemonstering breuk (ssf) wordt gedefinieerd als het aandeel van de secties van de hele serieel gesneden hersenen:
    figure-protocol-1
    om kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve ramingen van de coëfficiënt van fout (CE) moet lager zijn dan 0,10. Bepalen de CE met behulp van de formule door Keuker et al.., 2001 10:
    figure-protocol-2
  2. voor de stereological schatting van het nummer van de cel binnen de SN van elk muis, plaatst u de aangegeven gegevens met betrekking tot het totale aantal gegenereerde reeks per muis, de hoogte van de optische disector, x, y ruimte van de optische disector (een optische disector, in µm 2), de x, y ruimte van het raster-plein (een x, y stap in µm 2), en de gemiddelde gemeten de dikte van de sectie (in µm) in de gele vakken met behulp van de " berekening van de cel count.xlsx " werkbladbestand ( Figuur 6b en aanvullende bestand ).
  3. Analyseren van elke sectie SN van hetzelfde dier, zoals beschreven in stap 5.
  4. Invoegen cel telt voor elke optische disector in de grijze vakken, elke regel die verwijst naar een SN sectie, met behulp van de " berekening van de cel count.xlsx " werkbladbestand (Aanvullende bestand).
    Opmerking: Het geschatte celaantal en de berekende CE worden afgebeeld in de blauwe dozen ( Figuur 6b).

6. Schatting aantal cel met behulp van een commercieel beschikbare systeem van de Stereology

  1. Start de schatting van de Dopaminerge SNpc mobiele nummer door te klikken op " Probes " → " optische Fractionator Workflow " te openen van de optische Fractionator Werkstroom venster.
    Opmerking: Een nieuw venster zal pop-up om te bepalen of een nieuwe reeks van SN gaat worden geteld.
  2. Beginnen met een nieuwe serie van TH + SN secties door te klikken op " beginnen een nieuw onderwerp " in het pop-upvenster.
  3. Gaan door de verschillende stappen van de optische Fractionator Workflow. Instellen van het onderwerp in de eerste stap. Plaats hiertoe de onderzoeker ' s naam, het onderwerp ' s naam (SN groep), en andere nuttige informatie. Voeg de nummers van de secties te tellen voor deze SN. De dikte van het van de geknipte weefselsecties invoegen Voeg de sectie interval, die in dit geval vier is. Om te beginnen met het willekeurig bepaald Sectienummer invoegen.
  4. Instellen in de tweede stap, de Microscoop te lage vergroting (2 X doelstelling) en selecteer " 2 X Mag Lens " in het menu.
  5. In stap 3, het traceren van de regio van belang met de linker muisknop, oftewel de SNpc, zoals beschreven door Baquet et al.., 2009 17.
    6. De Microscoop
  6. ingesteld op hoge vergroting in stap 4. Hiervoor wijzigt u de doelstelling naar 100 X en selecteer " 100 X Mag lens " van het dropdownmenu.
  7. Meten van de gemonteerde dikte in stap 5 door zich te richten tot de bovenkant en de onderkant van de sectie.
  8. In stap 6, definiëren de framegrootte van counting als 50 x 50 µm; dit is de grootte van de optische disector (x, y).
  9. In stap 7, stelt u de grootte van het raster van systematische aselecte steekproef (SRS) als 130 x 130 µm.
  10. Geef een 3-µm guard zone in stap 8.
  11. De instellingen opslaan in stap 9.
  12. Ten slotte de TH + Dopaminerge cellen in elk van de optische disectors binnen het raster van de SRS in stap 10 van de optische Fractionator werkstroom tellen. Hiervoor start u door te klikken op de " Counting " knop.
  13. Na het beëindigen van een sectie, klik op de " volgende gedeelte begint " knop voor voorsprong naar de optische Fractionator Workflow van de volgende sectie van de SN van dezelfde serie SN.
  14. Wanneer de laatste SN sectie één SN reeks heeft gekwantificeerd, klikt u op " ik ' ve Gereedgemeld Counting. "
  15. Klik op de " Bekijk resultaten " knop om weer te geven van de resultaten van de bemonstering stereology.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de onderhavige methode, het geschatte aantal TH + Dopaminerge neuronen in het recht SN varieerden tussen 7,363 en 7,987 cellen en, in de linker SN, tussen 7,446 en 7,904 cellen. Zo was het gemiddelde aantal Dopaminerge neuronen (± SEM) 7,647 ± 83 cellen voor het recht SN en 7,675 ± 66 voor links SN. De berekende CE voor elk dier was lager dan 0,08 (bereik: 0.073-0.079) (Figuur 7). Om na te gaan van de vergelijkbaarheid van deze methode met comm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereology begint met de verwerking van het weefsel. De seriële snijden van SN weefsel moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat het verlies van secties tijdens de stereological analyse. Daarnaast is een essentiële stap ter gelegenheid van een halfrond teneinde te onderscheiden van het recht van de links SN bij het uitvoeren van stereology. Plaatsen van een klein gaatje in het bovenste deel van de hersenstam gegenereerd de beste resultaten in de gepresenteerde studie. Bovendien, sinds het werken met de optisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. W. I. heeft gediend op wetenschappelijke boards voor Merz geneesmiddelen, LLC en TEVA; ontvangst van subsidiegelden voor reizen van Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC en Allergan, Inc.; en spreker honoraria van Merz, TEVA en Allergan, Inc. heeft ontvangen buiten het ingezonden werk. J. V. heeft gediend als consultant voor Boston Scientific, Medtronic en AbbVie en honoraria van Medtronic, Boston Scientific AbbVie, Bial, Allergan en GlobalKinetics buiten het ingezonden werk heeft ontvangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn Keali Röhm, Louisa Frieß en Heike Menzel erkentelijk voor hun deskundige technische bijstand; aan Helga Brünner voor de verzorging van de dieren; en Chistopher S. Ward voor de productie- en distributieactiviteiten van de optische disector raster plugin voor de ImageJ software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Paxinos mouse atlasThe Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouseZivic InstrumentsBSMAS 001-1
paraformaldehydeMerck1040051000
sucrose /D(+) SaccharoseRoth4621.1
isopentaneRoth3927.1
glycerolMerck1040931000
EthanolSigma Aldrich32205-1L
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
fosfaat gebufferde zoutoplossing ingrediënten:
natriumchlorideSigma Aldrich31434-1KG-R
kaliumdihydrogeenfosfaatMerck1048731000
di-natriumwaterstoffosfaatdihydraatMerck1065801000
kaliumchlorideMerck1049360500
normaal geitenserumDakoX0907
rundeserumalbumineSigmaA4503-100G
Triton X-100Sigma AldrichX100-100mldetergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochloor/DAB-tabletten 10mg pH 7,0Kem En Tec4170
H2O2/ Waterstofperoxide 30%Merck1072090250
avidine/biotinereagensThermo Scientific32050Standaard Ultra Gevoelige ABC-kleuringskit, 1:100
konijn anti-muis tyrosinehydroxylase-antilichaamabcamAb1121:1000
gebiotineerde geiten-anti-konijn IgG H+LVector LaboratoriesBA-10001:100
StereoInvestigator versie 11.07MBF
BX53-microscoopOlympus
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Zeiss
ImageJ-softwareNIHVersie 4.7
Tissue-TEK OCTSakura4583
droog ijs
rasteroverlay-plug-inWayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
celteller-plug-inKurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optische dissector-macroChristopher Ward
C57Bl/6N mannelijke muizenCharles River, Duitsland
SuperFrost Plus gecoate objectglaasjesLangenbrinck, Duitsland
25G-naald Microlance 3BD300400
REGLO Analoge infusiepompIsmatecISM 829
StereoInvestigator-systeemStereoInvestigator versie 11.07
BX53-microscoopBX53-microscoop
zelf gesorteerd stereologischVisiview
Axiophot2Axiophot2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881(2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizenbreintyrosinehydroxylaseonbevooroordeelde stereologieceltellingbeeldanalyse

Gerelateerde artikelen