Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56110

⸱

6 juli 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.

Samenvatting

Vaak cellulaire gedrag en cellulaire reacties worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau waar de reacties van veel cellen samen worden gebundeld als een gemiddelde resultaat maskeren de rijke eencellige gedrag binnen een complexe bevolking. Eencellige eiwit detectie en kwantificering technologieën hebben een opmerkelijke invloed gemaakt in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een praktische en flexibele eencellige analyse platform gebaseerd op adresseerbare druppel microarrays. Deze studie beschrijft hoe de absolute moleculen van doel eiwitten met eencellige resolutie kan worden gemeten. De tumor suppressor p53 is het meestal gemuteerde gen in menselijke kanker, met meer dan 50% van de totale kankergevallen vertoont een patroon van niet-gezonde p53 uitdrukking. Het protocol wordt beschreven stappen voor het maken van 10 nL druppels waarbinnen één menselijke kankercellen worden geïsoleerd en de exemplaaraantal van p53 proteïne wordt gemeten met een enkel molecuul resolutie precies bepalen de variabiliteit in expressie. De methode kan worden toegepast op elk celtype met inbegrip van primaire materiaal om te bepalen van de absolute exemplaaraantal van elke doelgroep proteïnen van belang.

Inleiding

Het doel van deze methode is het bepalen van de variatie in overvloed van een doel-eiwit in een celpopulatie met eencellige resolutie. Eencellige analyse biedt een aantal voordelen die niet beschikbaar met traditionele ensemble biochemische methoden. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in de eerste plaats werken op het niveau van eencellige kan vangen de rijke heterogeniteit van een celpopulatie die anders verloren zou gaan door de gemiddeld dat met traditionele ensemble biochemische technieken optreedt. De meerderheid van de biochemische methoden werkpaard werken met het grootste deel, waarbij, zoals ze vaak doen, miljoenen cellen om een resultaat te produceren. Natuurlijk, de gevolgen voor de beoordeling van de gehele cel populaties hangt af van een aantal factoren, bijvoorbeeld de heterogeniteit in eiwit expressie waar enkele belangrijke kenmerken van de verdeling van eiwit overvloed kunnen worden gemist. Vanuit een praktisch perspectief, de gevoeligheid van eencellige technieken vereist maken hen geschikt voor het werken met hoeveelheden van biologisch materiaal dat onvoldoende is voor zelfs de meer gevoelige bulk technieken om te kunnen functioneren. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de studie van zeldzame celtypes zoals circulerende tumorcellen (CTCs) waar zelfs voor patiënten met een slechte prognostische vooruitzichten minder dan 10 CTCs zou aanwezig zijn in een één 7,5 mL bloed trekken. 6 hier presenteren we de methodologie die is vereist voor het uitvoeren van eencellige eiwit metingen met behulp van een verminderde volume antilichaam gebaseerde assay met druppels olie-afgetopte op een microarray antilichaam afgedrukt.

Microfluidic druppel perrons zijn hoge doorvoer, staat voor het genereren van duizenden druppeltjes per seconde, en geschikt voor isoleren, en zelfs kweken, afzonderlijke cellen in afzonderlijke druppels voor het uitvoeren van een breed scala van biochemische tests. Druppel gebaseerde technieken zijn geschikt voor eencellige analyse,7,8,9 met opmerkelijke recente voorbeelden, waaronder DropSeq10 en inDrop11, die aanzienlijk door de kracht van geholpen hebben amplificatie technieken. De beperkte hoeveelheid materiaal en geen methoden voor amplificatie voor eiwitten maken eencellige proteomics vooral een uitdaging.

Druppels kunnen worden geanalyseerd door een aantal methoden en fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt. Enkel molecuul technieken zoals de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie kunt fluorescerende moleculen aan met ongeëvenaarde signal-to-noise verhouding worden gevisualiseerd. 12 als gevolg van de exponentiële afname van het vluchtig veld, alleen fluorophores in de nabijheid van de hoog aan de oppervlakte (volgorde van 100nm) zijn enthousiast maken TIRF een goede strategie voor het opsporen van kleine hoeveelheden van een doelmolecule in een complex mengsel. De inherente optische vectorafbeeldingsbestanden sterkte van TIRF helpt ook om te voorkomen dat wassen stappen en grenzen assay tijd en complexiteit. Echter TIRF vereist vlakke oppervlakken en voorbeelden van TIRF microscopie toegepast op druppels in stroom betrekking hebben op de vorming van een vlakke oppervlakte van die afbeelding. 13 daarom eencellige proteomic technieken vaak ontwerpen microfluidic chips rond oppervlak-geïmmobiliseerd vangen agenten in een microarray opmaken. 4 , 14

De druppels, zelf, kunnen worden gevormd in matrices op vlakke oppervlakken, zogenaamde druppel microarrays. 15 , 16 , 17 ruimtelijk ordenen druppels in arrays kan ze gemakkelijk kunnen worden gunstig geïndexeerd, gecontroleerd na verloop van tijd, individueel gericht en, indien nodig, ontvangen. Druppel microarrays kan het bereiken van een hoge dichtheid van micro-reactoren met duizenden elementen per spaander die vrijstaande of ondersteund door microwell structuren zijn. 18 , 19 , 20 zij kunnen worden gevormd door opeenvolgende afzetting door liquid handling-robots, inkjet spotters, neem contact op met microarrayers21,22,23,24,25, 26 , of ze kunnen zichzelf monteren op oppervlakken zoals superhydrophillic plekken patroon op een superhydrophobic ondergrond. 27 , 28 , 29

Met deze overwegingen in het achterhoofd, werden adresseerbare Droplet Microarrays (ADMs) ontworpen om de veelzijdigheid, ruimtelijke serverprocessor en verminderde hoeveelheid druppel microarrays combineren met de gevoeligheid van een enkel molecuul TIRF microscopie aan kwantitatief maatregel eiwit overvloed. 5 ADMs inschakelen eencellige analyse vormen een druppel microarray met enkele cellen over een microarray antilichaam, die vervolgens wordt afgetopt met olie om te voorkomen dat de verdamping. De volumes van de druppels zijn discrete om verlies van de steekproef, die anders zou kunnen worden bereikt door op de chip kleppen in continue stroom microfluidics te voorkomen. 30 de absolute hoeveelheid eiwit van het doel van een enkele cel is extreem klein; de beperkte omvang van de druppels staat echter voor relatief hoge lokale concentratie opdat zij worden gedetecteerd met behulp van een sandwich antilichaam assay - antilichaam is geblokkeerd in een afzonderlijke regio, of ter plaatse, op een oppervlak dat vangt eiwit die op zijn beurt bindt aan een fluorescently geëtiketteerde detectieantilichaam aanwezig in het volume van de druppel. Als een etiket-vrije benadering (d.w.z. eiwit doelstellingen niet hoeft direct worden geëtiketteerd), ADMs zijn algemeen toepasbaar zijn bij de analyse van cellen uit primaire bronnen, zoals verwerkte bloed, prima moeten aangeblazen en gedissocieerde tumor biopsieën, evenals cellen van cultuur en hun lysates.

Meten van de variatie in eiwit overvloed over een celpopulatie is belangrijk bij het bepalen van de heterogeniteit in reactie, bijvoorbeeld aan een drug en zal helpen bij het verstrekken van inzicht in de cellulaire functies en trajecten, beoordeling van de subpopulaties en hun gedrag, alsmede identificatie van zeldzame gebeurtenissen dat anders zou worden gemaskeerd door bulk methoden. Dit protocol beschrijft hoe kan produceren en gebruiken van microarrays van de adresseerbare druppel kwantitatief bepalen de overvloed van de transcriptie factor p53 in menselijke kankercellen en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van p53 in reactie op chemotherapeutische geneesmiddelen. Het doel eiwit wordt bepaald door de keuze van vastleggen en detectie van antistoffen en kan worden gewijzigd om meer of andere doelen. Instructies om te bouwen van een eenvoudige apparaat opnemen een concentrische mondstuk van algemene lab verbruiksartikelen aan handmatig array 10 nL druppels afgetopt met olie. De volledige experimentele proces wordt beschreven waarbij elke druppel is vervolgens geladen met een enkele cel, die vervolgens is lysed en de uitdrukking van eiwit met enkel molecuul resolutie met behulp van microscopie van TIRF vastgesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Maken van chips en print antilichaam microarrays
    1. Een zelfklevende siliconen/acryl isolator hechten aan een dekglaasje aan matiemaatschappij ter ondersteuning van een microarray antilichaam. Dit is de chip genoemd.
      Opmerking: Verschillende oppervlakte chemicaliën zijn getest op hun geschiktheid met adresseerbare druppels. 5 oppervlakte oplossingen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor alternatieve vangen agenten. ADM isolatoren commercieel beschikbaar zijn of kunnen worden geproduceerd door laser snijden acryl (CAD bestand voor isolator in dit werk gebruikt als een download wordt verstrekt; zie het Aanvullende codebestand).
    2. Zet de microarrayer en stelt u de luchtvochtigheid op 75%.
      Opmerking: relatieve vochtigheid vermindert verdamping van oplossing om te printen vanaf de microarray pin en vermindert de variatie van de intra - en intersite - spot.
    3. Reinig de microarray pin PIN schoonmaakvloeistof voor 5 min door met ultrasone trillingen. Spoel de pin met ultra pure water met behulp van een fles van wassen en drogen met behulp van stikstof.
      Opmerking: Schorten de pin dat alleen het onderdompelen van de pin-tip. Een microscoopglaasje met een adequaat geboorde gaten set zal helpen als een pin-houder kan niet worden verkregen.
    4. Breng 5 mL print buffer bestaande uit 3 × saline-Natriumcitraat (SSC) buffer, 1.5 M betaïne aangevuld met 0,01% natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bewaren bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
    5. Ter voorbereiding van een oplossing om te printen, ontdooien anti-p53 antilichaam (p53/Mdm2 ELISA kit; Zie de tabel van materialen) aliquots opgeslagen bij-80 ° C. Meng het 1:1 met print buffer om een eindconcentratie van 0,5 mg/mL. Laden van 5-10 µL van oplossing om te printen in een 384 well-plate met behulp van een micropipet en plaats in het microarrayer.
    6. Laden chips geassembleerd in stap 1.1.1 tot de microarrayer. Het programma van de microarrayer af te drukken van vlekken op de coördinaten die zijn gedefinieerd door het midden van elk putje van de isolator.
      Opmerking: Microarrayers dienst een aantal, voornamelijk propriëtaire software en zodat de lezer aangemoedigd wordt om de relevante literatuur te raadplegen. De microarray die nodig zijn voor de ADM isolator featured in de bijbehorende CAD-bestand in stap 1.1.1 bestaat uit rechthoekige elementen; de relevante afstanden worden geleverd.
    7. Opslaan van de chips in luchtdichte containers en wikkel met folie. Bewaren bij 4 ° C tot 6 weken.
      Opmerking: De folie is om elke foto-schade te voorkomen. Opslag bij 4 ° C beperkt het afbraak tempo van biomoleculen en eventuele schadelijke reacties die ter vermindering van microarray activiteit kunnen fungeren. De luchtdichte kunt chips om equilibreer tot kamertemperatuur voor gebruik zonder condensatie vormen op het oppervlak van de chip. Neem contact op met microarray afdrukken exploits oppervlaktespanning en hechting tussen de print oplossing en de print substraat tot vlekken. Vooraf afdrukken of bevlekken is normaal vereist om overtollige oplossing van de microarray pin uniform formaat plekken opleveren. Gooi niet de opofferende vooraf print dekglaasje aan omdat het gebruikt kan worden om te beoordelen van de kwaliteit van de partij.
  2. Voorbereiding spuiten, buizen en concentrische nozzle voor de verstrekking van de adresseerbare druppels
    1. Demonteren van 100 µL (voor de waterige druppel) en 1 mL (voor de overkoepelende olie) glas Hamilton spuiten en spoel delen met gedestilleerd H2O.
    2. Een 100 mm lengte van 150 µm feed ID/360 µm OD gesmolten siliciumdioxide buizen door middel van een 40 mm lengte van 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA buis totdat het steekt door 2 mm. Dit zal het vormen van de concentrische mondstuk.
    3. Breng een dunne laag van Cyanoacrylaat lijm aan het einde van een 10 µL pipette uiteinde en invoegen in de 40 mm stuk van 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA buis. Indien nodig, verplaatst de gesmolten siliciumdioxide buis te handhaven een 2 mm uitsteeksel op het mondstuk voor de zelfklevende sets.
    4. Het andere uiteinde van de gesmolten siliciumdioxide capillaire invoegen aan het einde van een 200 mm lengte van 0.014" ID/0.062" OD PTFE buis en sluit deze aan op een 100 µL Hamilton spuit gevuld met 4% runderserum eiwit (BSA) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (PBSA).
      Opmerking: Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan oppervlakken en kan worden verloren of gedenatureerd. BSA wordt gebruikt om te 'blokkeren' oppervlakken om te minimaliseren van niet-specifieke binding door sacrificially te binden aan deze oppervlakken.
    5. Plaats een 400 mm lengte van 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP Slangen in een 200 µL pipette uiteinde totdat het een afdichting vormt. Breng een dunne laag van Cyanoacrylaat lijm aan een andere 200 µL pipette uiteinde en dit in de eerste tip de buis vast op zijn plaats te duwen. Het open uiteinde van de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing verbinden met een 1 mL Hamilton spuit gevuld met minerale olie.
    6. De 200 µL pipette uiteinde vergadering invoegen het 10 µL pipette uiteinde van de concentrische verstuiver. Plaats de injectiespuiten in aparte injectiespuit pompen omdat zij moeten onafhankelijk worden geëxploiteerd.
    7. Vul de spuit 100 µL met 4% PBSA blokkerende oplossing. Opnieuw koppelen en leegmaken van de 'waterig' buis met de blokkerende oplossing. Herhaal dit twee keer voor een totaal van 3 flushes.
    8. Vul de spuit 100 µL met 0,125 µg mL-1 detectieantilichaam (anti-p53 antilichaam (-1) voorzien van Alexa 488) 4% PBSA en opnieuw aansluit buizen. Blokkerende oplossing in de buizen vervangen door verstrekking 25 µL detectie antilichaam oplossing.
    9. Spoel de "olie" slang met minerale olie tot alle leidingen en het mondstuk wordt gevuld met olie. De 1 mL spuit met minerale olie bijvullen en opnieuw aansluit buis. Beveilig de vergadering van de slang en mondstuk aan een XYZ manipulator.
  3. Bereiden van microinjector en micromanipulator
    Let op: Onderstaande stappen maken specifieke verwijzing naar de componenten van de microinjector en micromanipulator apparatuur opgegeven in de tabel van materialen, maar in het algemeen gelden voor een dergelijk apparaat.
    1. Monteer de microinjector door het aanbrengen van de drukslang en de capillaire houder.
    2. Langzaam draaien de zuiger wijzerplaat totdat de minerale olie volledig de lijn vult.
    3. Monteer de capillaire houder in de vertaling hoofd mount.
    4. Fix het capillair in de capillaire houder met het hoofd van de grip.
    5. Pipetteer een oplossing van 4% PBSA in één van de putten van de isolator.
    6. Vertalen met behulp van de micromanipulator en de tip van het capillair onderdompelen in de oplossing.
    7. Langzaam vullen het capillair met 4% PBSA en verlof te blokkeren gedurende 10 minuten.
    8. Verwijder de microcapillary en de vertaling-module draaibaar, zodat de vergadering duidelijk van de chip is.

2. vorm van de adresseerbare druppels en belasting met afzonderlijke cellen

  1. Formulier adresseerbare druppels
    1. Beveilig de chip in het werkgebied van de Microscoop.
      Opmerking: De Microscoop is een omgekeerde fluorescentie geautomatiseerde Microscoop staat enkel molecuul TIRF met uitgerust een een gecodeerde XY-fase en een elektron te vermenigvuldigen met de camera van de charge - coupled apparaat (EM-CCD).
    2. De Microscoop fase coördinaten van elke plek in de array gebruikmakend van de controle-software voor geautomatiseerde Microscoop opnemen.
    3. De XYZ-manipulator aangezet in het stadium van de Microscoop. Plaats het mondstuk onder een hoek van 50-60°. Zorg ervoor dat de verstuiver voldoende lengte en ruimen van bouwterreinen tot de chip. Stel de 'waterig' en 'olie' syringe pompen om afzien van 10 nL op 100 µL/min en 5 µL op 100 µL/min, respectievelijk.
      Opmerking: Tijdens de voorbereiding, de waterige oplossing aan het hoofd van de verstuiver kan drogen.
    4. Afzien waterige oplossing totdat een kraal van vloeistof zichtbaar aan het hoofd van de verstuiver is. Schar met een doekje stof vrij om het te verwijderen.
      Opmerking: Afhankelijk van het aantal onderzochte voorwaarden, behouden een aantal putten om te dienen als reservoirs voor cellen. Voor een enkele cel/lijntype volstaat een enkele reservoir.
    5. Met behulp van de software van de controle van de geautomatiseerde Microscoop, zet de Microscoop fase coördinaten naar de plek van een antilichaam in de matrix en de focus op het dekglaasje aan oppervlak.
    6. Voorzichtig niet te verstoren, de plek, met behulp van de manipulator XYZ, uitlijnen van de glazen capillaire tip van de concentrische verstuiver aan de kant van de antilichaam-spot en afzien van 10 nL van waterige oplossing. Zonder te bewegen de stadia, afzien 5 µL van olie Cap de waterige oplossing. Langzaam verhogen van de verstuiver duidelijk van de druppel en verplaatsen naar het volgende goed.
    7. Herhaal stap 2.1.6 voor alle antilichaam spots in de matrix.
    8. Na 30 min, het imago van alle spots in de array met behulp van de software van de controle van de geautomatiseerde Microscoop om te bepalen van de achtergrond van afzonderlijke moleculen gebonden aan elke antilichaam ter plaatse vóór het laden van de cellen.
  2. Laden van de adresseerbare druppels met cellen
    1. De cel cultuur kolven verwijderen uit de incubator en losmaken van cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing.
      Opmerking: In deze studie, de BE menselijke Colón carcinoom-cellijn werd gebruikt en gekweekt met behulp van de Dulbecco bewerkt Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) in een incubator CO2 .
    2. Indien nodig, vlek fluorescently cellen.
      1. Resuspendeer de cellen in een oplossing van 0,125 μg/mL detectieantilichaam (anti-p53 antilichaam (-1) voorzien van Alexa 488) in 10% FBS in L-15 media. Om ervoor te zorgen de schorsing van een enkele cel, de cell oplossing wordt gefiltreerd door een 40 µm toonhoogte cel zeef.
    3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en verdunnen of concentraat de oplossing van de cel tot een concentratie van 25-400 × 103 cellen/mL. Dit zorgt ervoor dat cellen sediment met voldoende ruimte om comfortabel het manipuleren van de microcapillary.
    4. Afzonderlijke cellen in de adresseerbare druppels uit het reservoir van de cel met behulp van de micromanipulator en de microcapillary laden.
      Opmerking: Niet-aanhanger cellen kunnen worden geladen in bulk in de micropipet en één voor één in de adresseerbare druppels afgeleverd. Ondanks blokkerende oppervlaktebehandeling, zal aanhangend cellijnen dikwijls niet-specifiek vasthouden aan de binnenwand van het glas microcapillary worden verloren.
    5. Met behulp van een 10 × doelstelling observeren, gebruiken de microinjector om een eencellige gecombineerd in de microcapillary van het reservoir van de cel.
    6. Slaan de micromanipulator fase coördinaten als met behulp van een elektronische manipulator stadium of handmatig opmerking de z-positie.
    7. De micropipet worden ingetrokken door te vertalen naar boven om te wissen de hoogte 1 mm van de chip. Handmatig uitvoeren dit met een joystick of automatisch met behulp van de 'Eject' functie van een elektronische manipulator stadium.
    8. Set die de fase coördineert aan dat een adresseerbare druppel de met behulp van software van de controle van de Microscoop geautomatiseerde. 'Injecteren' de micropipet door het terug te zenden naar de opgeslagen (of genoteerd) z-positie. Dit handmatig uitvoeren met een joystick of automatisch als met behulp van een elektronische manipulator stadium.
      Opmerking: De microcapillary zal doorboren de overkoepelende olie en in het waterige gedeelte van de adresseerbare druppel bevindt.
    9. Afzien van de cel in de adresseerbare druppel met behulp van de microinjector. Het volume van een 10 nL adresseerbare droplet zal met minder dan 1% toenemen.
    10. 2.2.5-2.2.9 voor de resterende adresseerbare druppels verlaten sommige gratis voor de experimentele controle waar adresseerbare druppels bevatten geen een cel herhalen
      Opmerking: Een eenvoudiger alternatief voor het laden van afzonderlijke cellen in het adresseerbare druppels met behulp van een microcapillary en micromanipulator is ter vervanging van de oplossing in stap 1.2.8 met een oplossing van detectieantilichaam in 4% PBSA met cellen met een concentratie over de volgorde van 10 5 cellen/mL, overeenkomend met 1 cel/10 nL. Eencellige bezetting zullen Poissonian en de concentratie van de cel moet worden geoptimaliseerd.
  3. Lyse cellen en afbeelding matrix
    1. Afbeelding cellen in druppeltjes met helderveld microscopie, met inbegrip van eventuele fluorescentie imaging.
      Opmerking: Imaging duurt ongeveer 3 min om het imago van ~ 100 druppels met behulp van een geautomatiseerde Microscoop. Imaging uitvoeren met een 60 NB = 1,49 olie-immersie doelstelling. Geen filters zijn vereist voor helderveld imaging overwegende dat standaard filter sets worden gebruikt voor fluorescentie imaging.
    2. Het imago van alle spots in de array met behulp van één molecuul TIRF microscopie.
      Opmerking: Instellingen zijn gebruikt zoals in stap 2.3.1 met een gespecialiseerde TIRF filter set. Deze beelden worden vervolgens geanalyseerd in sectie 3 om de achtergrond van afzonderlijke moleculen gebonden aan elke vlek antilichaam voorafgaand aan cellysis. Enkel molecuul geschikt zijn met behulp van totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie duurt ongeveer 5 min om het imago van ~ 100 plekken.
    3. Focus op een cel in een adresseerbare druppel. Volledige optische lysis bereiken door te focussen op een enkele 6 ns laser pulse (golflengte 1064 nm, pulse energieën 14.1 ± 0,3 µJ per puls) dicht bij de locatie van de cel.
      Opmerking: De laser pols stelt een groeiende cavitatie-zeepbel die schaar de cel en bevrijdt van cellulaire bestanddelen in het volume van de druppel. 4 , 31 de mechanische processen als gevolg van lysis van de laser-geïnduceerde niet storen de interface van de olie-water bij lage pulse energieën. Lysis van de optische duurt meestal ongeveer 20-30 min 100 cellen lyse. Zoals besproken in de sectie discussie, zijn er een aantal alternatieve methoden lyse van afzonderlijke cellen als de lysis van de optische setup niet mogelijk is.
    4. Herhaal voor alle cel-bevattende adresseerbare druppels verlaten 5 gratis voor de experimentele controle waar adresseerbare druppels een un-lysed cellen bevatten.
    5. Opmerking de tijd waartegen elke cel is lysed.
      Opmerking: Deze tijden zal worden gebruikt om individuele bindende curven voor elke plek in stap 3.1.9 lossen. Vaak volstaat het om op te merken van de momenten waarop de eerste en de laatste cel zijn lysed en schatten de rest veronderstelling dat een adequaat consistent tijd tussen lysis van de gebeurtenissen.
    6. Verwerven van één molecuul beelden met behulp van TIRF microscopie van alle spots elke 10 min voor de eerste 30 min vervolgens elke 20 min. voor een verdere 60 min. Als alleen geïnteresseerd in de hoeveelheid eiwit gebonden aan evenwicht, het imago van alle spots na de chip gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
      Opmerking: De tijd om te bereiken evenwicht zal afhangen van het volume van de druppel en de verwantschappen van de antilichamen die gebruikt in de test. TIRF microscopie wordt uitgevoerd met behulp van een laser excitatie bron op = 488 nm en 1,5 mW vermogen gemeten op de opening van de achterkant met een optisch Energiemeter. Enkel molecuul afbeeldingen zijn verworven door het instellen van de overname-instellingen op de EM-CCD-camera aan 900 ms Acquisitietijd, 16-bits digitalisering 1 MHz uitlezing tempo en een EM krijgen factor 10. De isolator kan hergebruikt worden door het zorgvuldig verwijderen van het dekglaasje aan.

3. de gegevensanalyse

  1. Enkel molecuul tellen (niet-overbelast/digitale regeling)
    1. Fiji (of Matlab), voor elke niet-overbelast antilichaam plek gebruikt, laad de afbeelding vóór lysis (achtergrond, BKD) verworven.
      Opmerking: De bewerkingen in de volgende stappen worden rechtlijnig uitgevoerd met behulp van software van de analyse van de afbeelding van Fiji. Een handleiding kan worden gevonden op de volgende link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
    2. Selecteer de afbeelding van de BKD in Fiji. Onder het menu "Afbeelding" Selecteer "Duplicate" te dubbele BKD. Selecteer de dubbele afbeelding en onder de "proces > Filters", selecteer "Gaussian Blur" en geef een 50 pixel straal.
    3. De BKD-afbeelding afvlakken zodat er een effectieve uniforme intensiteit verdeling van de lichtbron van excitatie door het verdelen van de BKD-beeld door het beeld wazig BKD, productie van BKD_FLAT.
      1. Onder "Proces" Selecteer "afbeelding calculator...", de operatie "Kloof", geven de beelden vereist, en selecteren van de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
    4. Door 1 af te trekken van elke pixel in de afbeelding ("proces > Math", selecteer "Aftrekken..." en geef een waarde van 1). De intensiteit van de gemiddelde pixel moet 0 zijn.
      Opmerking: Field afvlakken en afgevlakte achtergrondafbeeldingen gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd, omdat de som van alle pixels 0 moet zijn en eventuele resterende offset meer rechtlijnig kan worden gecompenseerd.
    5. Selecteer een 50 × 50 pixel pixelgebied in een van de 4 hoeken van het beeld van de BKD_FLAT. Het meten van de standaarddeviatie van de pixel-intensiteit (σ) door "Analyseren" en "Maatregel" te selecteren.
      Opmerking: De samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten. Hiermee bepaalt u de achtergrond van de off-plek waar er is onwaarschijnlijk dat een hoge dichtheid van afzonderlijke moleculen. Het gebied te meten kan handmatig worden geselecteerd met behulp van het standaard menu selectie extra of door de macro code "makeRectangle (x, y, breedte, hoogte)"; Hiermee maakt u een rechthoekige selectie, waarbij de x- en y argumenten zijn de coördinaten (in pixels) van de linkerbovenhoek.
    6. De beeld-drempel ingesteld op 3σ en maak een binaire SM_MASK.
      1. Onder "Afbeelding > aanpassen", selecteer "Drempel..." en de lagere drempel ingesteld op 3σ.
        Opmerking: Pixels waarvan de waarde zijn onder de drempel zijn ingesteld op nul en pixels overschrijding van de drempel is ingesteld op 1. De drempel zal bepalen het vertrouwen waarmee thresholded pixels deel uitmaken van een enkel molecuul.
    7. In de gesegmenteerde afbeelding SM_MASK, set intensiteit de pixelwaarden op nul voor alle objecten die niet over een grootte van 4-9 pixel2 en een cirkelvormigheid van 0,5 beschikken - 1 door te selecteren "Analyseren" gevolgd door "Analyseren Particles" en de grootte en de cirkelvormigheid op te geven.
      Opmerking: De pixelgrootte moet worden geoptimaliseerd voor andere fluorophores en Microscoop set ups. Vanwege het type camera ruis enkele pixels boven deze drempel kunnen worden en niet ondanks de niet afzonderlijke moleculen worden weggegooid. De pixel groottecriterium worden correct dergelijke pixels genegeerd. Afzonderlijke moleculen zijn in het algemeen circulaire vorm. Overwegende dat de waarde 0 naderen geeft aan een steeds langwerpige vorm, duidt een waarde van de cirkelvormigheid van 1 een perfecte cirkel. De overige objecten zijn afzonderlijke moleculen en kunnen worden geteld. Een masker kan worden ingesteld op de afbakening van het gebied van de spot te plaatse discrimineren en off-plek telt per frame. Dit is makkelijker voor frames die zijn verworven in latere tijden wanneer er een voldoende signaal plaatse die vervolgens kan worden toegepast naar eerdere frames.
    8. Voor dezelfde niet-overbelast antilichaam plek, laden en herhaal stappen 3.1.1 - 3.1.7 voor alle afbeeldingsframes opgenomen als een reeks van time-resolved lysis van de post verworven. Gebruik de lysis tijden genoteerd in stap 2.3.5. te corrigeren bindende curven.
  2. Enkel molecuul tellen (verstopt/analoge regeling)
    1. Herhaal stap 3.1.1 - 3.1.8 ter berekening van de gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul, voordat u verdergaat.
    2. Vermenigvuldig de beelden BKD_FLAT en SM_MASK voor de productie van een afbeelding waarbij niet-nulzijnde pixelwaarden geassocieerd met afzonderlijke moleculen worden.
      1. Om uit te voeren, onder het menu "Proces", selecteer "Afbeelding calculator...", geef de bewerking "Vermenigvuldigen" en de beelden vereist en selecteer de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
    3. Som van alle intensiteitswaarden van de pixel door het selecteren van "Analyseren" en vervolgens "Maatregel"; de samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten. Delen door het aantal getelde afzonderlijke moleculen per stap 3.1.8 voor het berekenen van de gemiddelde intensiteit per één molecuul.
    4. Voor een overbelaste antilichaam plek, laden de afbeelding verworven na lysis en plat met een onscherpe achtergrond beeld per stap 3.1.2 en 3.1.3.
    5. Elke pixel in de afgevlakte afbeelding aftrekken door 1 ("proces > Math", selecteer "Aftrekken..." en geef een waarde van 1)
    6. Selecteer een 50 × 50 pixel pixelgebied in een van de 4 hoeken van het beeld en de standaarddeviatie van de pixel-intensiteit (σ) meten. Zie stap 3.1.5 voor details.
    7. Een binaire Afbeeldingsmasker maken door het instellen van de drempel van de afbeelding op 3σ en intensiteit pixelwaarden ingesteld op nul van objecten met een grootte van minder dan 4 pixel2. Om uit te voeren, onder het menu "Analyseren", selecteer "Analyseren Particles" en geef de grootte en de cirkelvormigheid.
    8. De afgevlakte overbelaste antilichaam plek afbeelding te vermenigvuldigen met de binaire Afbeeldingsmasker.
      1. Om uit te voeren, onder het menu "Proces", selecteer "Afbeelding calculator...", geef de bewerking "Vermenigvuldigen" en de beelden vereist en selecteer de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
    9. Som van de resterende intensiteiten van de pixel door het selecteren van "Analyseren" gevolgd door "Maatregel"; de samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten.
    10. De som van pixel intensiteiten door de intensiteit van de gemiddelde enkel molecuul voor het berekenen van het aantal afzonderlijke moleculen gebonden aan de drukke plek te verdelen.
  3. De kalibratiekromme voor absolute kwantificering
    1. Herhaal de punten 1 en 2 vormen 10 nL adresseerbare druppeltjes met de detectieantilichaam in 4% PBSA oplossing verrijkt met een bekende concentratie recombinant eiwit.
    2. Uitvoeren van een reeks van de concentratie van 102- 107 recombinante eiwitten per druppel door het variëren van de bekende concentratie van recombinante eiwitten aan de oplossing toegevoegd. Het wordt aanbevolen te werken in termen van aantal eiwitten per druppel kalibreren eencellige gegevens eenvoudig maken.
    3. Gebruik de concentratie reeks gegevens in stap 3.3.2 kalibreren van een enkel molecuul telt per plek om eiwit overvloed per druppel en door uitbreiding eiwit overvloed per eencellige.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De absolute basale eiwit exemplaaraantal van p53 werd bepaald met de resolutie van de eencellige in een menselijke Colón kanker cellijn, BE cellen. We laten zien hoe p53 expressie kan variëren in de verschillende ordes van grootte en tonen een zwak positieve correlatie tussen de cel grootte en eiwit exemplaaraantal binnen de rust BE-celpopulatie.

Adresseerbaar Droplet Microarrays worden gevormd wanneer waterige druppels zijn afg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Adresseerbaar Droplet Microarrays is een gevoelige en uitbreidbare methode voor het kwantitatief bepalen de absolute exemplaaraantal van eiwit in een enkele cel.

Beperking van het niveau van niet-specifieke binding is (NSB) kritisch in het protocol bij het bereiken van een limiet van detectie mogelijk zo laag. Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan een aantal interfaces aanwezig binnen de druppels — het dekglaasje aan oppervlak, het antilichaam ter plaatse en de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

ASR ontworpen experimenten, protocollen ontwikkeld en geanalyseerd gegevens. SC en PS cel grootte experimenten uitgevoerd. ASR en OC schreef het manuscript. De auteurs willen nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken de steun van Prof. David R. Klug voor het verstrekken van toegang tot apparatuur. De auteurs bedank de Imperial College geavanceerde Hackspace voor toegang tot de fabricage en prototyping faciliteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuur
Fosfaat-bufferoplossing met zout (PBS)Life Technologies10010015
DMEM met hoge glucoseSigmaD6429
Foetaal runder serum (FBS)BiochromS0115
CellcultuurkolvenCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Dekglasjes (Nexterion)Schott, Europa1098523Grootte (mm): 65,0 x 25,0; Dikte (mm) 0,17
p53-capturantilichaamEnzoADI-960-070
p53-detectantilichaam, gelabeld met Alexa Fluor 488Santa Cruzsc-126voorraadconcentratie 200μg/mL
Salina-natriumcitraatbufferGibco15557-044
BetaineSigma61962
NatriumdodecylsulfaatSigmaL3771
384-wellsplaat (klein volume)SigmaCLS4511
StikstofgascilinderBOCIndustriële kwaliteit, zuurstof-vrij
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Druppeltjes
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Handmatige microinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetOrigio, DenemarkenMBB-FP-L-0
SpuitpompenKD ScientificKDS-210
100 μL spuitHamilton81020Gasdicht, PTFE Luer-lock
1 mL spuitHamilton81327Gasdicht, PTFE Luer-lock
Siliconen isolatorGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 wel siliconen isolator met kleefstof
LasersnijderVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wvoor lasersnijden van aangepaste isolatoren
1 mm dikke acrylplaatWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001voor lasersnijden van aangepaste isolatoren
Kleefvel3Mgebruikt om aangepaste isolatoren op microarrayed dekglasjes te bevestigen
SuperlijmLoctiteLOCPFG3T
1 mm ID/3,6 mm OD gesmolten silica buisIDEXFS-115
1,0 mm ID/1/16” OD PFA buisIDEX1503
0,014” ID/0,062” OD PTFE buisKinesis008T16-100
1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP buisIDEX1673
Runder serum albumine (BSA)Fisher ScientificBP9700100
MineraalolieSigmaM5904
Ultrazuiver waterMillipore, DuitslandMilliQ
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscopie & Optica
TIRF-microscoop met gecodeerde XY-standaardNikon, JapanNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IerlandIXON DU-897E
LaseropwekkingsbronVortran, VSStradus 488-50
Optische lysislaserbronContinuum, VSSurelite SLI-10
Microscoopfilterkubus voor TIRFChroma, VSz488bp
Microscoopfilterkubus voor optische lysisLaser 2000, VKLPD01-532R-25
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
FijiOpen SourceBeeldanalysesoftware
MatlabMathworksversie 7.14 of hogerBeeldanalysesoftware

Referenties

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28(2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046(2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551(2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Eiwitdetectie in enkelvoudige cellenabsoluut aantal eiwitkopie nresolutie op enkelcelniveaup53 eiwitkwantificeringsingle molecule TIRF microscopieprotocol voor druppelvorminglyseprocedure van cellenfluorescerend detectieantilichaamanalyse van kankercellen
Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.