Een gestandaardiseerde methode voor het meten van het interne longoppervlak door middel van muizenpneumonectomy en prothese implantatie

Samenvatting

Interne longoppervlakte (ISA) is een kritisch criterium voor de beoordeling van longmorfologie en fysiologie bij longziekten en schade-geïnduceerde alveolaire regeneratie. We beschrijven hier een gestandaardiseerde methode die de metafora voor ISA kan minimaliseren in zowel longpneumonectomy als protes implantatie muis modellen.

Samenvatting

Longenmorfologie, -fysiologie en ademhalingsfuncties veranderen in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Interne longoppervlak (ISA), dat de gasuitwisselingscapaciteit van de long vertegenwoordigt, is een cruciaal criterium om de ademhalingsfunctie te beoordelen. Echter, observeringsbias kan de gemeten waarden voor morfologische longparameters aanzienlijk beïnvloeden. Het protocol dat we hier beschrijven, minimaliseert variaties tijdens metingen van twee morfologische parameters die worden gebruikt voor ISA-berekening: intern longvolume (ILV) en gemiddelde lineaire intercept (MLI). Door ISA te gebruiken als een morfometrische en functionele parameter om het resultaat van alveolaire regeneratie te bepalen in zowel pneumonectomie (PNX) als prothese-implantatie muismodellen, ontdekten we dat de verhoogde ISA na PNX-behandeling significant werd geblokkeerd door implantatie van een prothese in de borstholte¹. De mogelijkheid om ISA nauwkeurig te kwantificeren zal niet alleen de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van longfunctiestudies in door verwonding geïnduceerde alveolaire regeneratiemodellen verbeteren, maar ook mechanistische ontdekkingen van meerdere longziekten bevorderen.

Inleiding

De fundamentele functie van de long is de uitwisseling van zuurstof en kooldioxide tussen bloedvaten en de atmosfeer. Longziekten zoals bronchopulmonale dysplasie (BPD), chronische obstructieve longziekte (COPD) en acute respiratoire infecties resulteren in verminderde ISA ² . Onderzoekers die longziekte bestuderen hebben verschillende kwantitatieve methoden ontwikkeld om morfologische veranderingen in de longen te evalueren, waaronder MLI, ILV, aantal gasuitwisselingseenheden, ISA en longweefsel compliance ^{2 , 3} . Baanbrekende studies van Weibel et al. ⁴ en Duguid et al. ⁵ samen vastgesteld dat ISA kan worden gebruikt als een directe maatregel van longgasuitwisselingscapaciteit in de menselijke longen en kan gebruikt worden als criterium om de emfysem ernst te bepalen. Een aantal studies gepubliceerd in de afgelopen vijf jaar hebben longmorfologische parameters gebruikt ( bijv. ISA en MLI) om morfologische en functionele veranderingen in de longen van muizen tijdens ontwikkeling ^{6 te beoordelen} en tijdens herstel van letsel PNX ^{1 , 7} . ISA wordt berekend aan de hand van vergelijking 1 ^{8 , 9} :

, Waar ILV het interne longvolume is en MLI een tussenliggende parameter is die de pulmonale perifere luchtruim grootte ^{10 vertegenwoordigt} .

PNX, de chirurgische verwijdering van een of meer longlengtes, is algemeen gerapporteerd om alveolaire regeneratie in veel soorten te veroorzaken, waaronder mensen ¹¹ , muizen ¹ , honden ¹² , ratten ¹³ en konijnen ^{14 , 15} . Een stoetY van muizenlongen bij veertien dagen na PNX bleek dat zowel de uitbreiding van reeds bestaande alveoli als de de novo- vorming van alveoli bijdragen aan de restauratie van ISA, ILV en het aantal alveoli in de overige longweefsels ¹ . Wij en anderen hebben aangetoond dat het inbrengen van materialen zoals spons, wax of een op maat gemaakte prothese in de lege thoracale holte na PNX (dat wil zeggen implantaatprothese) de alveolaire regeneratie verzwakt. Het is nu duidelijk vast dat mechanische kracht functioneert als een van de belangrijkste factoren voor het initiëren van alveolaire regeneratie ^{1 , 16 , 17} . Dergelijke studies hebben de effectiviteit van het gebruik van ISA-waarden van PNX-behandelde en Prosthesis-geïmplanteerde longen als criterium benadrukt om alveolaire regeneratie kwantitatief te evalueren.

Observer bias is bekend om de gemeten va significant beïnvloedenLues voor longmorfologische parameters ( bijvoorbeeld MIL en ILV). Gestandaardiseerde protocollen kunnen worden gebruikt om deze vooroordeel te voorkomen bij het bepalen van zowel ILV als MLI, die de twee parameters zijn die bij de berekening van ISA worden gebruikt. Hier bieden wij zeer gedetailleerde, gestandaardiseerde protocollen voor het meten van deze longparameters. Belangrijk is dat het ISA-belofte nauwkeurig kan kwantificeren om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van studies van longfunctie bij schade-geïnduceerde alveolaire regeneratiemodellen te verbeteren en mechanistische ontdekkingen bij meerdere longziekten te vergemakkelijken.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol werden gebruikt, werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren van het Nationaal Instituut voor Biologische Wetenschappen, Beijing. 8 week oude CD-1 mannelijke muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije (SPF) faciliteit tot de experimenten werden uitgevoerd. Surgeries werden uitgevoerd met behulp van volledig verdoofde muizen (dat wil zeggen zonder enige knijpreacties). Na de operatie werden muizen in een warme, vochtige kamer gehouden met voldoende voedsel en zoet water. Muizen werden opgeofferd met behulp van een overdosis anesthetica afgegeven door intraperitoneale injectie.

1. Muis PNX Chirurgie

1. De muizen volledig anesthetiseren met natriumfenobarbital (120 mg / kg lichaamsgewicht) en buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) via intraperitoneale (IP) injectie. Doe een operatie wanneer muizen niet meer reageren op de teen knijpen.
2. Verwijder haar aan de linker thorax van de muizen met chemische depIlatoire behandeling (~ 3 x 3 cm ² gebied).
3. Bevestig elke muis op een intubatieplatform met de ventrale zijde naar de bediener gericht ( Figuur 1A ).
4. Trek de muisstaal uit en verlig de stembanden met een kleine laryngoscoop die een hak bevat voor het begeleiden van katheters ¹⁸ ( Figuur 1A ).
5. Onderscheid de stembanden door de bewegingen van de stembanden in acht te nemen tijdens het ademen. Zet een 20 G intraveneuze intubatie canule in de trachea voorzichtig in een voorste hoek ¹⁹ .
6. Plaats muizen in een rechterwaartse liggend stand en verbind de canule met een mechanische ventilator ( bijv. Drukgestuurd, zie de Tabel van Materialen ). Controleer de inbrengen van de canule in de luchtpijp door de adembewegingen van de muisborst te waarnemen ( Figuur 1B ).
7. Stel de inspiratiedruk inF de ventilator tot 12 cm H ₂ O en stel de ademhalingssnelheid op tot 120 ademhalingen per minuut ( figuur 1B ).
8. Decontamineer de huid in het chirurgische gebied met betadine en 70% ethanol.
9. Voeg een 2-3 cm posterolaterale thoracotomie incisie in de ruimte bij de ^5e intercostale ruimte, doorgesneden huid en spieren Noyes Spring Schaar (snijrand 14 mm, tip diameter: 0,275 mm) (Figuur 2B, C). Chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor de thoracotomie procedure worden vóór gebruik gesteriliseerd.
10. Maak een 1,5 cm incisie op de ^5e intercostale ruimte linkerlong (figuur 2D, E) blootgesteld. Gebruik tijdens de operatie een hoge temperatuurcauterizer om te stoppen met bloeden.
11. Houd een derde van de linker longklier uit de borst met stompe tippincen ( figuur 2F ) en gebruik dan een katoenen poot om de linker kant te trekkenLong ( figuur 2G ).
12. Identificeer de longslagader en bronchi van de linker longklier ( Figuur 2G ).
13. Liggelijk de bronchi en vaten in de hilum met een zijdechirurgische hechting en knip de linker longklier op 3 - 4 mm uit de ligatie ( Figuur 2H , I ).
    OPMERKING: Wees voorzichtig om de hechtknopen op de linker hilum niet af te snijden, wat pneumothorax kan veroorzaken ( bijv . Lucht of gas in de holte van de thorax) .
14. Sluit de borstmuur met 1 hechting en steek vervolgens de spierlaag en de huidlaag achtereenvolgens met 5-6 onderbroken hechtingen. Laat een 3 - 4 mm kloof tussen elke hechting ( Figuur 2M , 2N ).
    OPMERKING: Houd de chirurgische hechtingsnaald weg van het hart; Onopzettelijke hartsporing zal resulteren in onmiddellijke dood.
15. Desinfecteer het chirurgische gebied met povidon-jodium.
16. afteR de chirurgische operatie, plaats de muis op een thermische kussentje van 38 ° C en sluit de muis aan op de ventilator totdat spontane adembewegingen beginnen ( figuur 2O ).

2. Prothese Implantatie

1. Voer stappen 1.1 - 1.13 van de PNX procedure uit (tot op het moment dat de linker longklier van de muis verwijderd is).
2. Klem het middelpunt van de siliconenprothese (klant gemaakt, 12 mm in lengte, 3 mm in dikte, 7 mm in breedte, 0,2 g, ellipsoidvormig) met behulp van stompe tang ( Figuur 2J ). Steriliseer siliconenprothese voor inbrengen.
3. Houd de rib met de hand vast met de ene hand om de thoracale holte bloot te leggen, en plaats de prothese in de linker lege thoraxholte met een andere hand.
   OPMERKING: De invoeghoek is ongeveer 45 graden tussen het frontvlak van de prothese en het thoracale oppervlak ( Figuur 2K ,L). Wees erg zacht bij het plaatsen van de prothese. Overmatige kracht zal leiden tot pleurale breuk.
4. Pas de oriëntatie van de prothese aan met stompe tang om ervoor te zorgen dat de prothese de linker lege thoracale holte bekleedt.
5. Voer stappen 1.14 - 1.16 van de muis PNX procedure uit.

3. Meting van ILV

1. Bereid een aangepast apparaat ("inflatiebuis") op die bestaat uit een plunjer verwijderd van een weggooibare serologische pipet (10 ml), een 40 cm lange flexibele buis met een naaldadapter, een debietregelaar en een 18 G-naald. Bevestig de pipet na een montage op een bord met tape ( afbeelding 3A ). De afstand tussen de bovenkant van de pipet en de experimentele bank moet minstens 30 cm zijn.
2. Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) fixatieoplossing door 20 g PFA in 500 ml voorverwarmde 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) in een 55 ° C waterbad op te lossen, handmatig schuddenStop elke 10 minuten tot de oplossing helder is. Na afkoelen tot kamertemperatuur, filter de oplossing met een 0,45 μm filter.
   LET OP: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) bij het hanteren van PFA.
3. Offer muizen met een overdosisinjectie van verdoving (0,8% fenobarbital natrium, 1000 U / ml heparine).
4. Bevestig elke muis op een polystyreen dissectieplaat en spuit het met 70% alcohol.
5. Maak de muiskist voorzichtig open en snijd de sternum uit met behulp van een schaar om de longlobben grondig bloot te leggen.
6. Verwijder overmatig weefsel met behulp van een schaar om de luchtpijp bloot te stellen. Zorg ervoor dat u de luchtpijp scheidt van de slokdarm.
7. Snij de abdominale aorta in en steek een 25-gauge naald in de rechter hart van de hart; Verbind de naald met een 20 ml spuit voor deze insertie. Druk langzaam 1x PBS in het hart om bloedcellen te verwijderen totdat de longen wit worden. Gewoonlijk is 5 - 10 ml PBS nodig om de longvaten te verwijderen.
8. Vul hetEen op maat gemaakte inflatiebuis met 4% vers PFA en verwijder alle bellen van de infuusbuis.
9. Plaats de 18-gauge naald van de infuusbuis in de luchtpijp en plak de luchtpijp met vaatjesclips om vloeistoflek te voorkomen.
10. Opblazen longen met 4% PFA bij een constante transpulmonaire druk van 25 cm / _H2O ^{2, 20.} Incubeer de longen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om volledig uitgestrekte longen te bereiken. Deze "pre-fix" -stap is cruciaal voor het behoud van longmorfologie.
    1. Controleer de waarde van het initiële 4% PFA volume en controleer het eindvolume door de inflatiebuis te controleren. Het inwendige longvolume is gelijk aan het initiële 4% PFA volume minus het uiteindelijke 4% PFA volume.
11. Ontleed de luchtpijp en gebruik een schaar, ontleed de longen voorzichtig uit (om de longen intact te houden) van de omliggende bindweefsels. Wees erg zacht om de longen te beschadigen.
12. IncuBaat de longen in een 50 ml conische buis gevuld met 4% PFA gedurende 12 uur bij 4 ° C met zacht schudden op een shaker (50 rpm). Ga door naar weefselverwerking en kleuring (zie rubriek 4).

4. Weefsel Inbedding, Sectie, en Hematoxyline & Eosine (H & E) Staining

1. Na fixatie, gebruik Noyes Spring Scissors om het hart en overmatige bindweefsel uit de longen te trimmen. Zet de afzonderlijke longlabbers voorzichtig af door de bronchus af te snijden die de longlopen aan de luchtpijp verbindt.
2. Was de longkloven 3 - 4 keer in 50 ml 1x PBS (30 min / was) op een orbitale shaker (50 rpm).
3. Na de laatste wassing beschermt u de longlobben door ze in een 30% sucroseoplossing (in 1x PBS) bij 4 ° C te onderdompelen tot het weefsel tot de bodem van de 50 ml kegelbuizen (ongeveer 12 uur) zakt.
4. Voordat u de weefsels inbedekt en cryosectieert, verwijdert u de lunglobe-monsters uit de buizen met pincet, behoud de accesSory lobes voor de histologische analyse, druppel de resterende sucroseoplossing uit het oppervlak van de accessoire lobmonsters, en doe het monster vervolgens grondig in een Petri-schaal met een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding gedurende ongeveer 30 minuten.
5. Vries de OCT-embedded accessoire lobe monsters in vloeibare stikstof met behulp van cryomolds. Plaats het grootste oppervlak van de lobe evenwijdig aan de bodem van de mal.
6. Bereid in totaal drie 10 μm dikke secties voor elk monster tijdens cryosectie voor histologische analyse. Verwijder de eerste 1 mm weefsel, verzamel een 10 μm dikke sectie, verwijder 0,5 mm weefsel, versamel een ander gedeelte, verwijder 0,5 mm weefsel en verzamel de derde (laatste) sectie.
7. Droog de secties 1 uur voor het uitvoeren van H & E-kleuring.
8. Voer H & E-kleuring uit
   1. Was de secties in 3 - 4 veranderingen van kraanwater en vlek de secties in verse hematoxyline gedurende 2 minuten; Spoel het gedeelte onder stromend kraanwater af; Dompel het gedeelte twee keer in een 1% HCl-70% ethanoloplossing om overtollige hematoxyline te verwijderen.
   2. Verdeel de sectie in verse eosine gedurende 3 minuten; De secties uitdrogen met twee opeenvolgende 30 s wassen in 95% ethanol en twee 30 s wassen met 100% ethanol; De secties in xyleen gedurende 30 s wissen, herhaal de clearingstap een keer in verse xyleen; Monteer de glijbanen met montagemedium met glazen deklagen.

5. Kwantificering van MLI

1. Verkrijg digitale afbeeldingen van de H & E-gekleurde accessoire lobe secties (20X vergroting) met een heldere veld microscoop.
2. Om de MLI te kwantificeren, selecteer in totaal 15 niet-overlappende standpunten (1000 μm x 1.000 μm) willekeurig uit de geschikte gebieden (zonder slagaders en aderen, grote luchtwegen en alveolaire buizen) van 3 secties.
3. Plaats een rooster met 10 gelijkmatig verdeelde verticale lijnen en 10 even verdeelde horizontale lijnen van gedefinieerde lenGth (1000 μm) op de gekozen gezichtsvelden met behulp van een liniaal tool; Elke lijn is dus op afstand van 100 μm gescheiden ( figuur 4B ).
4. Definieer de waarde van een onderscheiding als de lineaire lengte tussen twee aangrenzende alveolaire epithelia. Meet de waarden van alle afsnijdingen langs elke 1000 μm lengte lijn.
5. Bepaal voor elk raster de waarden van alle afsnijdingen onder de 10 horizontale 1,000 μm lengte lijnen en de 10 verticale 1,000 μm lengte lijnen.
   OPMERKING: MLI is de gemiddelde waarde van de onderscheppingslengten uit een totaal van 15 grids geanalyseerd uit de 3 secties die zijn voorbereid op elk van de accessoire lobben.

6. Berekening van ISA

1. Bereken de ISA met behulp van Equation 1 (zie de introductie ). Raadpleeg sectie 3 voor de meting van ILV en verwijzen naar sectie 5 voor de kwantificering van MLI.

Resultaten

We hebben hier een experiment uitgevoerd met een PNX-behandelde groep en een prothese-implantatie (Prosthesis-geïmplanteerde) groep. Deze groeperingen zijn hetzelfde als de groeperingen die in een eerder gepubliceerde studie van onze onderzoeksgroep ^{14 gebruikt werden} .

De muis PNX- en prothese-implantatieprocedures worden weergegeven in Figuur 2 . 8 week oude CD-1 ma...

Discussie

In dit protocol geven we gedetailleerde beschrijvingen over de meting van pulmonale parameters na de linker long PNX en de implantatie van de prothese. ISA wordt nu beschouwd als een belangrijke meetwaarde voor de beoordeling van de ademhalingsfunctie bij veel longziekten en bij schade-geïnduceerde alveolaire regeneratie. Echter, hoewel de pulmonale onderzoeksgemeenschap in overeenstemming is over het nut van ISA als een nuttige metrische tot nu toe, is er weinig aandacht besteed aan de standaardisatie van de meting van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Low cost cautery kit	Fine Science Tools	18010-00
Noyes schaar	Fine Science Tools	15012-12
Standard pattern pincet	Fine Science Tools	11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Vaatclips	Fine Science Tools	18374-44
I. V. Cannula-20 gauge	Jinhuan Medical Product Co., LTD.	29P0601
Chirurgische hechtdraad	Jinhuan Medical Product Co., LTD.	F602
Muis intubatieplatform	Penn-Century, Inc	Model MIP
Klein dier laryngoscoop	Penn-Century, Inc	Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RSP1006-05L
Thermische pad	Stuart equipment	SBH130D
Pentobarbital natriumzout	Sigma	P3761
Heparine natriumzout	Sigma	H3393
Hematoxyline oplossing	Sigma	GHS132
Eosine Y oplossing, alcoholisch	Sigma	HT110116
10 mL Pipette	Thermo Scientific	170356
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
O.C.T Compound	Tissue-Tek	4583
cryosection machine	Leica	CM1950
Disposable Base Molds	Fisher HealthCare	22-363-553
18 gauge naald	Becton Dickinson	305199
Povidon jodium	Fisher Scientific	19-027132
70% ethanol	Fisher Scientific	BP82011
Infuus sets voor eenmalig gebruik	Weigao	SFDA 2012 3661704
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco	10010023
Tapes	3M Scotch	8915
Wattenpad	Vinda	Dr.P
Siliconen prothese	Op maat gemaakt
Brightfield microscoop	Olympus	VS120
Liniaal tool	Adobe Photoshop